SEPARACIÓN MAGNÉTICA DE ELEVADO GRADIENTE DE MATERIAL BIOLÓGICO.

Separación magnética de elevado gradiente de material biológico La invención se refiere a una aplicación de la tecnología de separación magnética de elevado gradiente (HGMS) para la separación y la purificación de material biológico. La separación y la purificación de determinadas partículas a partir de suspensiones de partículas heterogéneas tienen gran importancia para una variedad de métodos analíticos, especialmente en el campo de la investigación biomédica. Generalmente, las partículas que se van a purificar, denominadas partículas diana de aquí en adelante, difieren con frecuencia solamente de forma mínima del resto de las partículas contenidas en la suspensión, denominadas partículas no diana de aquí en adelante. En el caso de las partículas diana y las partículas no diana, se trata frecuentemente de células o de fragmentos de células, sin embargo, pueden ser cualquier otra sustancia biológica. Algunos procedimientos de separación establecidos utilizan las propiedades magnéticas de las partículas diana, en donde las partículas diana pueden tener propiedades magnéticas intrínsecas naturales, o en donde las partículas diana se marcan mediante una fijación dirigida de partículas magnéticas sintéticas antes del procedimiento de separación real. Las partículas magnéticas intrínsecas son, por ejemplo, glóbulos rojos, con la condición de que la hemoglobina contenida en ellos esté presente en forma desoxigenada u oxidada, pero no en forma oxigenada. En este sentido, desoxigenada significa que no es portadora de oxígeno y oxigenada significa que es portadora de oxígeno. En el último caso, la molécula de hemoglobina es portadora de una molécula de oxígeno con una unión no covalente, es decir, una unión reversible. De la que hay que diferenciar la forma oxidada de la hemoglobina, en la que los átomos de oxígeno u otros átomos oxidados, están unidos de forma covalente, es decir de forma irreversible, al átomo central de hierro de la molécula de hemoglobina. Entonces, los orbitales del átomo de hierro central, contenido en la molécula de hemoglobina, son portadores de electrones desapareados, tanto en la forma desoxigenada como en la forma oxidada (pero no en la forma oxigenada), cuya rotación desapareada posibilita la inducción de polos magnéticos en el átomo de hierro, mediante la aplicación de un campo magnético. Sin embargo, un campo magnético aplicado de tipo convencional, no ejerce ninguna fuerza magnética sobre una partícula que contiene tales átomos de hierro, puesto que debido al diámetro muy pequeño del átomo, las fuerzas magnéticas de atracción y repulsión en el polo norte y en el polo del sur de los átomos de hierro polarizados, mantienen el equilibrio. También la partícula perderá su polarización magnética después de la eliminación del campo magnético. Este tipo de magnetismo se conoce como paramagnetismo. Una forma especial de paramagnetismo se denomina también a veces superparamagnetismo". Entre ambas formas, sin embargo, no existe físicamente una separación clara, por lo tanto, a continuación, los términos paramagnetismo y paramagnético abarcarán los términos superparamagnetismo y superparamagnético. También las partículas sintéticas, ordinarias, utilizadas para marcar magnéticamente las partículas diana, son paramagnéticas y contienen generalmente, cantidades menores, muy similares a la hemoglobina oxidada, de hierro oxidado o de otras sustancias magnetizables. Por otra parte, son idealmente tan pequeñas que forman coloides estables en suspensión, es decir, no sedimentan durante largos períodos de tiempo (de meses a años); por lo tanto, su diámetro mide en general 30-200 nm. Las partículas de este tipo disponibles en el comercio, se distribuyen solas o unidas a anticuerpos, por ejemplo, por chemicell GmbH (Eresburgstrasse 22-23, D-12103 Berlín, Alemania), micromod Partikeltechnologie GmbH (Friedrich-Barnewitz-Str.4, D-18119 Rostock, Alemania) o Miltenyi Biotech GmbH (Friedrich Ebert Straße 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania). Un método establecido para purificar partículas paramagnéticas, es decir, para separarlas de suspensiones de partículas, es la creación de gradientes de campos magnéticos extremadamente altos. Un gradiente de campo magnético suficientemente alto, conduce al hecho de que los polos norte y sur de las partículas paramagnéticas, experimentan una diferencia entre las fuerzas de atracción y repulsión y, por lo tanto, en conjunto una fuerza magnética dirigida. Esta tecnología se conoce bajo la denominación separación magnética de elevado gradiente (HGMS). Hay que distinguir entre los separadores magnéticos de elevado gradiente llamados internos y los externos. Las primeras descripciones de la tecnología de HGMS se referían a separadores internos. Estos se pueden encontrar en Oberteuffer (IEEE Transactions on Magnetics, Mag-9, nº 3, septiembre de 1973:303-306) y en el documento de patente de EE.UU. nº 3.676.337. Un material ferromagnético en un recipiente adecuado, no magnético que sirve como cámara de separación, se introduce en un fuerte campo magnético homogéneo que se puede generar con un electroimán o con un imán permanente en forma de herradura (dipolo magnético). En este caso, el material ferromagnético se denomina generalmente matriz; puede ser filamentosa (similar a un alambre o similar a un filamento), esférica (similar a una bola) o tener otra forma cualquiera, por ejemplo, puede consistir en una chapa de acero troquelada. El material ferromagnético de la matriz sufre una magnetización que se corresponde a su susceptibilidad magnética X, a través del campo aplicado externamente. Partiendo de la superficie del material de la matriz, se crean gradientes de campo magnético que pueden alcanzar más de 100 Teslas por centímetro; por lo que la magnitud del gradiente está en relación inversa al diámetro de los elementos filamentosos o esféricos utilizados. Los separadores magnéticos de elevado gradiente externos alcanzan gradientes elevados semejantes, a través de una 2 ES 2 366 074 T3 disposición técnica especial, más compleja de los imanes, fuera de la cámara de separación real, según lo descrito, por ejemplo, en los documentos WO 98/055236, WO 99/019071 o la patente de EE.UU. nº 6.241.894 B1. Como diferencia fundamental, no hay necesidad de una matriz, dentro de las cámaras de separación. Hoy en día, los separadores magnéticos de gradiente elevado internos, son los más utilizados en la investigación biomédica. Los documentes de patente de EE.UU. nº 4.664.796 y nº 5.200.084 describen realizaciones especiales de tales separadores. El documento de patente de EE.UU. nº 5.200.084 describe un aparato y un procedimiento que se dirige particularmente a la purificación de pequeñas cantidades de material biológico en los pocillos de una placa de microvaloración. Entre otros, se describen purificaciones de hasta 83% de células CD4 marcadas con partículas paramagnéticas, procedentes de células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMCs). Según los conocimientos del inventor, solamente una realización técnica de un separador magnético de gradiente elevado interno, consigue actualmente tasas elevadas de purificación, tal y como se describe en los documentos WO 96/26782 y EP 0.942.766 B1. Para evitar uniones no específicas de partículas que no son diana a la matriz, que perjudican el resultado de la purificación descrita en los documentos mencionados, la cámara de separación de ese separador contiene una matriz revestida con polímero. El polímero se estira sobre la matriz en distintas etapas, tal y como se describe detalladamente en el documento WO 96/26782. De acuerdo con la información dada por los autores, la cámara de separación fabricada de ese modo, se caracteriza por el hecho de que el polímero forma un revestimiento impermeable duro, cerrado, impermeable a los líquidos e impermeable a los iones que contiene menos de 1% de agua, en el material ferromagnético de la matriz; y que la matriz revestida con polímero llena el 60­ 70% del volumen total de la cámara de separación descrita. Además de disminuir una unión no específica de las partículas no diana con la matriz, este revestimiento de acuerdo con las publicaciones mencionadas, se supone que también evita el deterioro del material biológico que se va a separar, mediante el contacto directo con el material ferromagnético de la matriz (deterioro físico), así como excluir una reacción química del material ferromagnético de la matriz, con la solución tampón utilizada para la suspensión del material biológico, puesto que los iones liberados también podrían conducir a un deterioro del material biológico que se va a separar (deterioro químico). Sin embargo, ambos tipos de deterioro, se deben considerar hipotéticos según los conocimientos... [Seguir leyendo]

1.- Dispositivo de separación magnética con gradiente elevado para la separación o la purificación de material biológico magnético o marcado magnéticamente que presenta un imán (7), una columna de separación (1) y una matriz ferromagnética (2) que se puede disponer en un espacio interior de la columna de separación, así como un recipiente de almacenamiento (11) que contiene una solución tampón para equilibrar la columna de separación (1) y/o la suspensión del material biológico, en donde durante el funcionamiento, un campo magnético generado por el imán (7) puede generar un campo magnético de gradiente elevado en la matriz (2) y la solución tampón desde el recipiente de almacenamiento de líquido (11) puede fluir a través de la columna de separación (1), caracterizado porque la solución tampón incluye una solución base y macromoléculas que son capaces de saturar los sitios de unión inespecífica de la matriz (2), en donde las macromoléculas comprenden proteínas filamentosas, en particular gelatinas. 2.- Dispositivo según la reivindicación 1, en donde la solución tampón presenta una densidad que coincide con la densidad de las partículas del material biológico que se van a separar, en un grado tal, que la fuerza de la gravedad que actúa sobre las partículas está esencialmente compensada y, por lo tanto, las partículas están casi suspendidas en la solución tampón, y/o la solución tampón tiene una viscosidad elevada, que posibilita un flujo laminar a través de la columna de separación (1), con una velocidad de flujo adecuada para el procedimiento de separación. 3.- Dispositivo según la reivindicación 1 o 2, en donde el imán (7) es un imán permanente o un electroimán que se conforma de modo que la columna de separación (1) se pueda colocar dentro del campo magnético, en particular homogéneo, generado por él mismo, en donde la columna de separación (1) puede estar opcionalmente bajo la influencia del campo magnético o no, mediante una separación espacial y/o desconexión. 4.- Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, en donde la matriz (2) no está revestida y/o comprende un material ordenado o no ordenado, filamentoso, esférico o con otra forma, particularmente, acero inoxidable o lana de acero inoxidable magnéticos. 5.- Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, en donde el recipiente de depósito (11) está conectado con la columna de separación (1), de modo que se puede introducir o no la solución tampón en la columna de separación (1), a través de un dispositivo de limitación del flujo (8, 9) con una velocidad de flujo ajustable, y/o en donde la columna de separación (1) comprende un dispositivo de limitación de la circulación (4, 5), que es capaz de controlar el flujo de salida de la columna de separación (1) y la velocidad de flujo dentro de la columna de separación (1). 6.- Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, en donde la fuerza iónica de la solución base se adapta dependiendo de las macromoléculas, de modo que se compensan los efectos de la agregación de las macromoléculas sobre el material biológico, en donde la solución básica tiene una concentración isoosmolar de cationes sodio, potasio, magnesio o calcio y de aniones cloruro, fosfato, sulfato o carbonato, particularmente es una solución salina o de sacarosa tamponada con fosfato o una mezcla de las mismas. 7.- Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, en donde las macromoléculas incluyen de forma ventajosa polielectrolitos o polianfolitos naturales o sintéticos, particularmente un polielectrolito sintético o un polielectrolito orgánico ácido D-glucurónico, y/o en donde las macromoléculas presentan un punto isoeléctrico que, con el valor de pH de la solución básica, conduce a una carga que se corresponde con la carga de las partículas del material biológico que se van a separar y/o en donde las macromoléculas tienen un peso molecular de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 kDa, particularmente de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 70.000 kDa. 8.- Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, en donde las macromoléculas incluyen proteínas globulares, particularmente albúminas, seroalbúmina bovina o humana, ovoalbúmina, lactoalbúmna o albúminas vegetales, ß-lactoglobulina, -caseína, histonas, protaminas, globulinas, prolaminas o glutelinas, con una concentración desde aproximadamente 3 a aproximadamente 7% en peso, particularmente desde aproximadamente 4 a aproximadamente 5% en peso, en relación con la solución tampón. 9.- Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, en donde las proteínas filamentosas incluyen colágenos hidrolizados en una concentración desde aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 20% en peso, especialmente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10% en peso. 10.- Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, en donde las gelatinas incluyen gelatinas bovinas, gelatinas porcinas o gelatinas de teleósteo y/o tienen una concentración desde aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 1,5% en peso, particularmente desde aproximadamente 0,4 hasta aproximadamente 0,8% en peso, y/o tienen un poder de gelificación bajo de aproximadamente 150 Bloom o menor, particularmente de aproximadamente 75 Bloom o menor. 11.- Procedimiento para la separación o la purificación de material biológico magnético intrínseco o marcado de forma magnética preparativa, mediante una separación magnética de gradiente elevado, en donde una suspensión con el material biológico fluye a través de una matriz (2) ferromagnética dispuesta en un campo magnético externo, 14 ES 2 366 074 T3 de modo que el material se adhiere a la matriz (2), caracterizado porque la matriz (2) no está revestida, porque el material biológico está suspendido en una solución tampón con una solución base y macromoléculas que saturan los sitios de unión inespecífica de la matriz (2) durante la circulación a través de la matriz, y porque la matriz (2) y una columna de separación (1) que la rodea, se equilibran antes de la circulación de la suspensión, mediante una incubación previa con solución tampón pura, es decir, una solución tampón que no contiene material biológico y durante un periodo de tiempo suficientemente largo para saturar los sitios de unión inespecífica en la matriz (2). 12.- Procedimiento según la reivindicación 11, en donde la matriz (2) se equilibra durante un tiempo de aproximadamente 3 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 minutos, y en donde la matriz (2) se mantiene continuamente cubierta por la solución tampón durante el proceso de equilibrado. 13.- Procedimiento según la reivindicación 11 o 12, en donde para la separación de material biológico indeseado, el material eluido, es decir, un líquido que sale de la matriz (2), es recogido preferiblemente después de la circulación, en donde, después de la introducción de la suspensión en la matriz (2), una solución tampón adicional pura fluye a través de la matriz (2), con el campo magnético todavía activado, hasta que se asegura que la suspensión ha salido completamente de la matriz (2), y en donde la matriz (2) se mantiene siempre cubierta por la solución tampón durante la circulación. 14.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde para la purificación de material biológico deseado, después de la introducción de la suspensión en la matriz (2), con el campo magnético externo todavía activado, se hace circular a través de la matriz (2) una solución tampón pura adicional hasta que se asegura que la suspensión ha salido totalmente de la matriz (2), y posteriormente, la matriz (2) se lava con solución tampón pura adicional, con el campo magnético externo desactivado mediante separación espacial o mediante desconexión del mismo y en donde el material eluido se recoge, manteniendo la matriz (2) siempre cubierta con la solución tampón durante el procedimiento completo. 15.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el material eluido recogido se centrifuga y el proceso se repite una o varias veces, con el material biológico separado por centrifugación sin la fase líquida del material eluido. 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