RECIPIENTES Y KITS PARA LA DETERMINACIÓN DE FUNCIONES CELULARES Y MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS MISMAS.

LA INVENCION SE REFIERE A UNOS CONTENEDORES PARA LA DETERMINACION DE LAS FUNCIONES CELULARES QUE SON FACILES DE MANEJAR Y SON MENOS PELIGROSOS,

PERMITIENDO UNA DETERMINACION DE ALTA PRECISION. ESPECIFICAMENTE, UN CONTENEDOR PARA LA DETERMINACION DE LAS FUNCIONES CELULARES QUE SE VA USAR CON LAS SUSTANCIAS FISIOLOGICAMENTE ACTIVAS DE ANALISIS PRODUCIDAS POR LOS HEMATOCITOS, CONSTITUIDO DE FORMA TAL QUE SE DISMINUYE LA CANTIDAD DE MATERIALES INDUCTORES DE LA PRODUCCION DE LAS SUSTANCIAS FISIOLOGICAMENTE ACTIVAS, HASTA UN NIVEL TAL QUE NO CAUSE QUE LOS HEMATOCITOS PRODUZCAN LAS SUSTANCIAS, TAL COMO SE DETERMINA EXTRAYENDO AGUA DEL CONTENEDOR, EN UNA CANTIDAD IGUAL AL DE UNA MUESTRA DE SANGRE QUE SE VA ANALIZAR; Y OTRO CONTENEDOR PARA LA MISMA, EN DONDE LOS MATERIALES QUE INDUCEN LA PRODUCCION DE SUSTANCIAS, CUANDO SE PONEN EN CONTACTO CON LA SANGRE, SE COLOCAN EN UN ESTADO CAPAZ DE PONERSE EN CONTACTO CON LA SANGRE, DISMINUYENDOSE LA CANTIDAD DE LOS MATERIALES EN EL CONTENEDOR DE FORMA QUE NOAFECTE AL ANALISIS DE LAS SUSTANCIAS

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un kit para la medición de funciones celulares implicadas en reacciones inmunes e inflamatorias, y más particularmente a un kit para la medición de funciones celulares que se realiza 5 mediante la determinación de citoquinas como sustancias fisiológicamente activas, producidas por células sanguíneas incluyendo granulocitos, monocitos, macrófagos, linfocitos o similares.

Descripción de la técnica anterior

Los leucocitos, tales como granulocitos, monocitos, macrófagos y 10 linfocitos, desempeñan diversos papeles en reacciones bioprotectoras diversificadas, incluyendo reacciones inmunes e inflamatorias en sangre u órganos respectivos. Se sabe que estas células muestran funciones importantes en diversas morbilidades incluyendo enfermedades infecciosas; enfermedades inflamatorias tales como hepatitis y nefritis; enfermedades 15 alérgicas inmunes tales como artritis reumatoide y asma; y cáncer, y las funciones de estas células son suprimidas o potenciadas según varíe la morbilidad.

También se sabe que diversos fármacos, tales como fármacos anti-inflamatorios, inmunosupresores, inmunopotenciadores y fármacos 20 anticancerosos, son útiles en la terapia de estas enfermedades, en las que las funciones de estas células son suprimidas o potenciadas simultáneamente. Es importante, por lo tanto, examinar las funciones de estas células, mediante lo cual las morbilidades de diversas enfermedades, efectos y efectos secundarios de fármacos puedan identificarse para determinar esquemas terapéuticos, 25 dosis de los fármacos y la temporización de la administración del fármaco.

En vista de las razones descritas anteriormente, un ensayo de actividad fagocítica de granulocitos, un ensayo de actividad bactericida de granulocitos (capacidad de producción de oxígeno activo), un ensayo de transformación de linfocitos y similares se han estado realizado convencionalmente en salas o 30 centros de reconocimiento hospitalarios para medir dichas funciones celulares. También en los últimos años, se ha estado realizando un ensayo de antígeno de superficie que utiliza un citómetro de flujo y anticuerpos monoclonales marcados por fluorescencia contra antígenos de superficie respectivos de diversas células inmunocompetentes. Sin embargo, los métodos de ensayo 35

convencionales han requerido técnicas especializadas tales como separación y cultivo de células, medición microscópica o similares, para necesitar por consiguiente mediciones que requieren tiempo, instalaciones de RI y equipos caros.

Además, los monocitos en sangre, así como macrófagos en los que los 5 monocitos se movían a tejidos diferenciados y maduros, tienen un amplio espectro de funciones, por ejemplo, como entrar en juego en la exclusión de cuerpos extraños mediante fagocitosis y formación inmune mediante presentación de antígenos, o como secreción de diversas sustancias fisiológicamente activas, tales como citoquina y prostaglandina, para regular de 10 este modo una reacción inflamatoria o inmune. Al igual que los granulocitos y los linfocitos, estos monocitos y macrófagos desempeñan papeles importantes también en diversas morbilidades. Es muy importante, por lo tanto, identificar las funciones de estas células. Particularmente en enfermedades infecciosas, a diferencia de los granulocitos y linfocitos, los monocitos y macrófagos muestran 15 ligeros cambios en términos del número de células y amplifican principalmente sus funciones, de modo que la medición de los cambios en las funciones celulares se vuelve más importante (documento “Macrophages”, escrito por Tohru Tokunaga, Kodansha Scientific, 1ª Ed. Publicada en 1986).

El factor α de necrosis tumoral (en lo sucesivo en este documento 20 denominado como TNFα), interleuquina-1β (en lo sucesivo en este documento denominada como IL-1β), e interleuquina-6 (en lo sucesivo en este documento denominada como IL-6), llamadas todas monoquina, son citoquinas que son producidas principalmente por leucocitos incluyendo monocitos y macrófagos, entre las células sanguíneas, y que entran en juego en diversas reacciones 25 inflamatorias e inmunes.

Diversos métodos descritos hasta la fecha examinan las funciones de producción de citoquinas descritas anteriormente de la sangre o leucocitos separados de la sangre. Por ejemplo, en los boletines de Patente Abiertas a Inspección Pública Nº. Hei 2-196961 y Hei 3-285692, se describen métodos 30 que hacen reaccionar a lipopolisacárido (LPS) o lectina con sangre para inducir la producción de citoquinas, tales como TNFα o IL-1β, que posteriormente se determinan cuantitativamente. Además, en los boletines de Patente Abiertas a Inspección Pública Nº Hei 6-209992 y Hei 7-67955, se describen métodos que hacen reaccionar a sangre con materiales poliméricos que tienen una 35 rugosidad de superficie o estructuras químicas específicas para inducir la producción de TNFα. Además, en los boletines de Patente Abierta a Inspección Pública Nº Hei 7-299732 y Hei 7-151752, se describen ensayos de biorreacción que hacen reaccionar a sangre con materiales poliméricos que tienen una rugosidad de superficie específica para determinar la cantidad de TNFα o IL-1β 5 producida. Además, en un boletín de Tokkohyo Nº Hei 7-500905, se describe un método que mide la inmunoactividad de una sustancia ensayada determinando la producción de citoquinas, tales como TNFα o IL-1β, inducida a partir de leucocitos de sangre periférica humana.

Sin embargo, los métodos descritos anteriormente para la medición de 10 funciones celulares que se han realizado convencionalmente en salas o centros de hospitalarios reconocimiento, así como los métodos descritos en los boletines de las patentes abiertas a inspección pública mencionadas anteriormente, presentan los siguientes problemas. Esto es, todos estos ensayos requieren operaciones especializadas, tales como una operación de 15 recogida de sangre de un ser humano examinado usando un inyector y seguidamente la transferencia de forma manual de la sangre a diversos reactores tal como mediante pipeteo, separación celular para separar los leucocitos y las otras, cultivo celular con en fin de medir las funciones celulares o similares. Esto conlleva el riesgo de que la persona que realiza el examen 20 contraiga diversas enfermedades infecciosas, tales como hepatitis y SIDA, cuando la persona entra en contacto con la sangre. Además, existe la posibilidad de que diversas bacterias o polvos se incorporen accidentalmente a una muestra de sangre durante dichas operaciones. Existe otro riesgo de influir negativamente en los resultados de la medición cuando esos contaminantes u 25 operaciones estimulan físicamente a las células en la sangre sin necesidad.

Particularmente en los métodos convencionales que emplean un reactor específico para recoger la sangre en su interior y determinan la producción de citoquinas, específicamente de TNFα o IL-1β inducidas a partir de leucocitos, ha habido una ocasión en la que la endotoxina, tal como LPS obtenido de 30 bacterias gram-negativas, se ha incorporado originalmente en un equipo para la recogida de sangre, tal como un inyector, o en un reactor. Dado que incluso una muy pequeña cantidad de endotoxina puede inducir la producción de TNFα o IL-1β a partir de leucocitos, era imposible obtener resultados de medición fiables cuando, por ejemplo, la entrada de una pequeña cantidad de polvos 35 durante un proceso de fabricación o contaminación a través del agua de limpieza empleada daba como resultado la incorporación de una pequeña cantidad de endotoxina en el equipo para la recogida de sangre o reactor descrito anteriormente.

En vista de los problemas descritos anteriormente, se busca un método 5 para la medición de funciones celulares cuyas operaciones sean más sencillas, menos arriesgadas y más precisas que los métodos convencionales.

En otro aspecto, convencionalmente se han utilizado anticoagulantes cuando se miden diversas sustancias fisiológicamente activas en sangre, funciones de células sanguíneas, antígenos de superficie de células 10 sanguíneas o similares.

Sin embargo, no existe un patrón general para el contenido de endotoxina en anticoagulante, aparte de una directriz que se da en el documento “Endotoxin testing method” en el vademecum de la 13ª Farmacopea Japonesa revisada, que, para anticoagulantes empleados como 15 un fármaco para inyección, establece...

1. Un kit para la medición de las funciones celulares que comprende:

(a) un primer recipiente para la medición de las funciones celulares para su uso en la determinación de una citoquina producida por células sanguíneas, 5 en el que una cantidad de endotoxina, cuando se extrae recogiendo agua de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a medición, antes del uso no supera las 0,5 EU/ml, y está alojado un anticoagulante.

(b) un segundo recipiente para la medición de las funciones celulares en el que están alojados endotoxina y anticoagulante de tal manera que puedan 10 ponerse en contacto con la sangre, en el que la concentración de endotoxina en un líquido completo resultante cuando se pone en contacto con la sangre en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, se traduce en el intervalo de 0,6 - 100.000 EU/ml; y

(c) un reactivo para cuantificar dicha citoquina, en el que dicho reactivo 15 incluye:

un primer reactivo de inmunoensayo enzimático que tiene una alta sensibilidad de medición de 10 - 1.000 pg/ml usado para determinar cuantitativamente la citoquina en la sangre recogida en el primer recipiente para la medición de las funciones celulares; 20

un segundo reactivo de inmunoensayo enzimático que tiene una baja sensibilidad de medición de 500 - 10.000 pg/ml usado para determinar cuantitativamente la citoquina producida mediante la reacción de la endotoxina con la sangre recogida en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, teniendo el segundo reactivo de 25 inmunoensayo enzimático una sensibilidad de medición diferente, para la citoquina, a la del primer reactivo de inmunoensayo enzimático.

2. El kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dichos primer y segundo recipientes un cuerpo 30 de recipiente que tiene una abertura y un tapón fijado para sellar la abertura, que no se retira durante la recogida de la sangre.

3. El kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que en cada interior de dichos 35 primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares se ha reducido la presión.