NANOPARTÍCULAS DE PROTEÍNA CON APOLIPOPROTEÍNA E ACOPLADA PARA LA SUPERACIÓN DE LA BARRERA HEMATOCEFÁLICA Y PROCEDIMIENTO PARA SU FABRICACIÓN.

Nanopartículas de proteína con apolipoproteína E acoplada para la superación de la barrera hematocefálica y procedimiento para su fabricación La presente invención se refiere a nanopartículas a partir de una proteína hidrófila o de una combinación de proteínas hidrófilas, con preferencia a partir de seroalbúmina, en particular de origen humano, que pueden superar la barrera hematocefálica por medio de apolipoproteína E ligada, para transportar sustancias farmacéutica o biológicamente activas al líquido cerebroespinal. Las nanopartículas son partículas con un tamaño entre 10 y 1000 nm, que se pueden fabricar a partir de sustancias macromoleculares sintética so naturales. En nanopartículas de este tipo se pueden ligar medicamentos u otro material biológicamente activo, de forma covalente, iónica o por adsorción o se pueden incorporar en el material de las nanopartículas. No obstante, hasta ahora solamente las nanopartículas de polialquilcianoacrilatos, que habían sido revestidas con polisorbato 80 (Tween® 80) u otros tensidos, estaban en condiciones de superar la barrera hematocefálica, para transportar medicamentos hidrófilos al líquido cerebroespinal y provocar efectos farmacológicos. El mecanismo de este transporte se basa, según las investigaciones hasta ahora, en que apolipoproteína E (ApoE) es adsorbida por las nanopartículas a través del revestimiento de polisorbato 80. De esta manera, estas partículas simulan presumiblemente partículas de lipoproteína, que son reconocidas y ligadas por los receptores-LDL de las células endoteliales capilares cerebrales, las cuales garantizan el suministro de lípidos. Una serie de medicamentos han podido transportarse por medio de nanopartículas de polibutilcianoacrilato revestidas con polisorbato 80 y otros tensidos a través de la barrera hematocefálica y provocar un efecto farmacológico significativo. Ejemplos de tales medicamentos administrados de esta manera son dalargina, un hexapéptido de endorfina, loperamida y tubocuarina, que son ambos antagonistas del receptor de NMDA MRZ 2/576 o bien MRZ 2/596 de la Fa. Merz, Frankfurt, así como el agente anticancerígeno doxorubicina. Los inconvenientes de las nanopartículas de polibutilcianacrilato residen, sin embargo, en que el polisorbato 80 no es fisiológico y en que el transporte sobre la barrera hematocefálica podría basarse posiblemente en un efecto tóxico del polisorbato 80. Un revestimiento de nanopartículas de polibutilcianacrilato con polisorbato 80 u otros tensidos no es, sin embargo, esencial para el transporte de las nanopartículas de polibutilcianacrilato sobre la barrera hematocefálica. No obstante, las nanopartículas de polibutilcianacrilato conocidas tienen el inconveniente adicional de que tanto la ligazón de la ApoE como también de los medicamentos solamente se realiza por adsorción. De esta manera, la ApoE ligada en las nanopartículas o bien el medicamento está presente en equilibrio con ApoE o medicamento libre, y después de la inyección en el organismo puede realizar una desorción rápida de estas sustancias desde las partículas. Además, la mayoría de los medicamentos no se ligan en una medida suficiente a nanopartículas de polibutilcianacrilato y, por lo tanto, no se pueden transportar con la ayuda de este sistema portador sobre la barrera hematocefálica. La presente invención tenía el cometido de preparar nanopartículas para la superación de la barrera hematocefálica, que no tienen los inconvenientes mencionados anteriormente y que, evitando tensidos no fisiológicos, no han adsorbido solamente la apolipoproteína E necesaria para el transporte sobre la barrera hematocefálica. El cometido se ha solucionado de manera sorprendente a través de nanopartículas, que están constituidas por una proteína hidrófila o por una combinación de proteínas hidrófilas, con preferencia por seroalbúmina, de manera especialmente preferida por seroalbúmina humana, o por una proteína comparable, en las que está acoplada apolipoproteína E de forma covalente o a través del sistema avidina / biotina. En la albúmina se trata de un grupo de proteínas que existen sobre todo en líquidos animales / humanos, por ejemplo la seroalbúmina en la sangre, o en tejidos. Las albúminas son ricas en aminoácidos cargados negativamente así como en leucina o isoleucina. En comparación con las globulinas concomitantes, las albúminas poseen masas moleculares más bajas y solamente se pueden rellenar por medio de concentraciones salinas relativamente altas. También la gelatina A, gelatina B, caseína o proteínas comparables son adecuadas como proteínas de partida para las nanopartículas de acuerdo con la invención. La apolipoproteína E es un componente de los complejos de lipoproteína. Estos complejos de lípidos y apolipoproteínas posibilitan el transporte de los lípidos insolubles en agua en la sangre. La ApoE intermedia presumiblemente en el transporte de las nanopartículas de acuerdo con la invención sobre la barrera hematocefálica, ligándose en os receptores de LDL de las células endoteliales capilares cerebrales. Las nanopartículas de acuerdo con la invención pueden presentar adicionalmente una o varias proteínas funcionales, que están ligadas a través de moléculas espaciadoras funcionales a grupos tiol de las nanopartículas 2 ES 2 365 506 T3 modificadas con grupos tiol. Para la preparación de tales nanopartículas, se pueden hacer reaccionar los grupos funcionales, que se encuentran sobre la superficie de las nanopartículas, (grupos amino, grupos carboxilo, grupos hidroxilo) a través de reactivos adecuados para obtener grupos tiol reactivos. Las proteínas funcionales se pueden ligar entonces a través de moléculas espaciadoras bifuncionales, que presentan una reactividad tanto frente a grupos amino como también frente a grupos tiol libres, a las nanopartículas modificadas con grupos tiol. Las proteínas funcionales a acoplar de esta manera a las nanopartículas se pueden seleccionar del grupo, que comprende avidina, derivados de avidina, apolipoproteínas, como por ejemplo apolipoproteína E, pero también anticuerpos, enzimas y similares. En este caso, las proteínas funcionales propiamente dichas tienen un efecto farmacológico o biológico. En una forma de realización preferida, las nanopartículas de acuerdo con la invención presentan avidina acoplada covalente, a través de la cual se puede ligar apolipoproteína E biotinilada, como se representa de forma ilustrativa en la figura 1. La propia avidina es una glicoproteína altamente afín a biotina, que se puede ligar a través de las moléculas espaciadoras bifuncionales mencionadas anteriormente covalentemente a los grupos tiol de las nanopartículas tiolizadas. A través de la ligazón covalente de la avidina a las nanopartículas no sólo se puede ligar ApoE biotinilada, que es necesaria para el transporte sobre la barrera hematocefálica, sino que se pueden ligar una pluralidad de moléculas biotiniladas de una manera especialmente eficiente por las nanopartículas modificadas con avidina. En este caso se prefieren especialmente moléculas activas farmacológica o biológicamente. Para transmitir efectos farmacológicos, las nanopartículas de acuerdo con la invención pueden presentar sustancias farmacológica o biológicamente activas. Estas sustancias activas pueden estar incorporadas en las nanopartículas o son ligadas por las nanopartículas. En este caso, la ligazón de las sustancias farmacológica o biológicamente activas se puede realizar tanto de forma covalente, complexante a través del sistema avidina-biotina como también por incorporación o adsorción. Las nanopartículas de acuerdo con la invención son especialmente bien adecuadas para ligar medicamentos, que no presentan ningún paso o un paso insuficiente sobre la barrera hematocefálica, como por ejemplo dalargina, loperamida, tubocuarina o doxorubicina o similar y para transportarlos sobre la barrera hematocefálica y para provocar efectos farmacológicos. El procedimiento para la fabricación de las nanopartículas de acuerdo con la invención a partir de una proteína hidrófila o de una combinación de proteínas hidrófilas para la superación de la barrera hematocefálica comprende las siguientes etapas: - desolvatación de una solución acuosa de una proteína hidrófila o de una combinación de proteínas hidrófilas, - estabilización de las nanopartículas resultantes a través de la desolvatación por medio de reticulación cruzada, - conversión de una parte de los grupos funcionales sobre la superficie de las nanopartículas estabilizadas en grupos tiol reactivos, - fijación covalente de proteínas funcionales por medio de moléculas espaciadoras bifuncionales, - biotinilación de apolipoproteínas E, si las partículas no presentan apolipoproteína E acoplada covalente, - carga de las... [Seguir leyendo]

1.- Nanopartículas para la superación de la barrera hematocefálica, caracterizadas porque están constituidas por una proteína hidrófila o una combinación de proteínas hidrófilas, a las que está acoplada o ligada apolipoproteína E. 2.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque la al menos una proteína hidrófila está seleccionado del grupo que comprende seroalbúmina, gelatina A, gelatina B, caseína y proteínas comparables, o una combinación de estas proteínas. 3.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizadas porque al menos una proteína hidrófila es de origen humano. 4.- Nanopartículas de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque presentan una o varias proteínas funcionales diferentes, que están ligadas a través de moléculas espaciadoras bifuncionales a grupos tiol de nanopartículas modificadas con grupos tiol. 5.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizadas porque las proteínas funcionales están seleccionadas del grupo que comprende adivina, derivados de avidina, apolipoproteínas, anticuerpos, enzimas, hormonas, citoestáticos. 6.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizadas porque apolipoproteína E biotinilada está ligada a través de avidina acoplada covalente. 7.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizadas porque al menos otra proteína funcional biotinilada está ligada a través de avidina acoplada covalente. 8.- Nanopartículas de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque tienen incorporadas o ligadas sustancias farmacológica o biológicamente activas. 9.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizadas porque las sustancias farmacológica o biológicamente activas están ligadas sobre la superficie de las partículas. 10.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizadas porque las sustancias farmacológica o biológicamente activas están ligadas de corma covalente, complexante a través del sistema avidina-biotina o por adsorción. 11.- Nanopartículas de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizadas porque las sustancias activas están seleccionadas del grupo que comprende dalargina, loperamida, tubocuarina y doxorubicina. 12.- Procedimiento para la fabricación de las nanopartículas a partir de una proteína hidrófila o de una combinación de proteínas hidrófilas para la superación de la barrera hematocefálica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: - desolvatación de una solución acuosa de una proteína hidrófila o de una combinación de proteínas hidrófilas, - estabilización de las nanopartículas resultantes a través de la desolvatación por medio de reticulación cruzada, - conversión de una parte de los grupos funcionales sobre la superficie de las nanopartículas estabilizadas en grupos tiol reactivos, - fijación covalente de proteínas funcionales por medio de moléculas espaciadoras bifuncionales, - biotinilación de apolipoproteínas E, ES 2 365 506 T3 - carga de las nanopartículas modificadas con avidina con apolipoproteína E biotinilada, - carga de las nanopartículas modificadas con avidina con apolipoproteína E biotinilada y otras proteínas funcionales o sustancias farmacéutica o biológicamente activas. 13.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la proteína hidrófila está seleccionada del grupo, que comprende seroalbúmina, gelatina A, gelatina B, caseína y proteínas comparables, o una combinación de estas proteínas. 14.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque la proteína hidrófila es de origen humano. 7 ES 2 365 506 T3 15.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque la desolvatación se realiza a través de agitación y adición de un no disolvente miscible con agua para proteínas hidrófilas o a través de salificación. 16.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque el no disolvente miscible con agua para proteínas hidrófilas se selecciona del grupo que comprende etanol, metanol, isopropanol y acetona. 17.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque para la estabilización de las nanopartículas se utilizan procesos térmicos o aldehídos bifuncionales o formaldehído. 18.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque como aldehído bifuncional se utiliza glutaraldehído. 19.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 18, caracterizado porque como agente modificador de grupos tiol se utiliza una sustancia, que se selecciona del grupo que comprende 2-iminotiolano, una combinación de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y cisteína o una combinación de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida y dicloruro de cistaminio así como ditiotreitol. 20.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 19, caracterizado porque como molécula espaciadora bifuncional se utiliza una sustancia, que está seleccionada del grupo, que comprende éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisulfo-succinimida, sulfosuccinimidil-4-[N-maleimido-metil]ciclohexan-1-carboxilato, sulfosuccinimidil-2-[m-azido-o-nitrobenzamido]-etil-1,3-ditiopropionato, dimetil-3,3-ditiobispropionimidat-diclorhidrato y 3,3.ditiobis[sulfosuccinimidilpropionato]. 21.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 20, caracterizado porque las sustancias activas están seleccionadas del grupo que comprende dalargina, loperamida, tubocuarina y doxorubicina. 22.- Nanopartículas, que comprende una proteína hidrófila o una combinación de proteínas hidrófilas, que tienen ligada apolipoproteína E, para la utilización para el transporte de sustancias farmacéutica o biológicamente activas sobre la barrera hematocefálica. 23.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizadas porque al menos una de las proteínas hidrófilas está seleccionada del grupo que comprende seroalbúmina, gelatina A, gelatina B, caseína y proteínas comparables, o una combinación de estas proteínas. 24.- Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23, caracterizadas porque al menos una de las proteínas hidrófilas es de origen humano. 25.- Nanopartículas de acuerdo con una de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizadas porque las sustancias activas están seleccionadas del grupo que comprende dalargina, loperamida, tubocuarina y doxorubicina. 26.- Nanopartículas de acuerdo con una de las reivindicaciones 22 a 25 para la utilización en el tratamiento de enfermedades cerebrales. 8 ES 2 365 506 T3 9