MÉTODOS Y APARATO PARA MANIPULAR MUESTRAS MICROBIANAS.

Esta invención se refiere al campo general de la microbiología y, de modo más específico, a la transferencia, inoculación y/o siembra en estrías de microorganismos, por ejemplo, para obtener colonias individuales. Entre otros, se refiere a métodos para manipular y sembrar en estrías especímenes microbianos, y a un aparato (semi)automático para preparar especímenes para el recuento visual, la tipificación y otros análisis de poblaciones bacterianas, por ejemplo en microbiología de diagnóstico. Uno de los muchos procedimientos que deben realizarse en microbiología es la siembra en estrías de placas con el fin de aislar colonias microbiológicas. Las colonias aisladas son absolutamente necesarias para observar la morfología de las colonias y para la realización de tinciones y otros procedimientos que son necesarios para determinar el género y, en muchos casos, la especie, cepa, etc. de un organismo desconocido. En la técnica clásica, conocida como siembra en estrías, un asa de siembra estéril en primer lugar se pone en contacto con la muestra o el inóculo cuyas células se desea transferir, después se pone en contacto con la placa que contiene el medio sólido estéril al cual se desea transferir las células, y se mueve de un lado a otro sobre la superficie de una porción (por ejemplo, una cuarta parte) de la placa fresca. En la etapa inicial, pueden transferirse millones de células a la nueva placa, y deben diluirse más en muchos órdenes de magnitud de modo que se obtengan colonicas individuales, en lugar de un crecimiento confluyente. Puesto que la superficie del asa de siembra ya está contaminada con muchos miles de células, debe volver a esterilzarse (por ejemplo, mediante esterilización con llama en el caso de asas de siembra de alambre), o debe sustituirse por una nueva asa de siembra estéril (por ejemplo, en el caso de asas de siembra de plástico desechables de un solo uso). El asa de siembra estéril entonces se pone en contacto con la superficie de la placa fresca que previamente se había sembrado en estrías, por ejemplo mediante varios movimientos a través de la zona de la primera siembra en estrías, y después se siembra en estrías otra porción de la placa (por ejemplo, un cuarto de la placa adyacente a la primera siembra en estrías). Esto produce otra dilución de las células. El asa de siembra después se vuelve a esterilizar o se sustituye, se pone en contacto con la segunda área de siembra en estrías, y después se siembra en estrías una tercera zona de la placa. Este proceso debe realizarse al menos tres o cuatro veces para asegurarse de obtener colonias individuales, en lugar de un crecimiento confluyente, tras la incubación de la placa fresca. El ensayo de especímenes microbianos clínicos requiere en general la siembra en estrías de varias placas (por ejemplo, de 2 a 6) por espécimen de ensayo. El proceso de siembra en estrías manual requiere aproximadamente 30 segundos por placa de agar de tiempo del técnico experto. La calidad de la siembra en estrías y, por tanto, los grados de aislamiento del microorganismo depende de la formación recibida por el técnico y del cuidado que se tiene al realizar el proceso. Por tanto, el proceso de inoculación y siembra en estrías manual requiere mucha mano de obra y mucho tiempo. Además, en muchos escenarios de diagnóstico, tal como un laboratorio microbiológico hospitalario, a menudo se reciben picos de carga de muestras para ensayar. No resulta extraño que el procesamiento de hasta 1000 muestras clínicas individuales de diversos tipos deba realizarse en una ventana de tiempo de sólo unas pocas horas, en general al final de una jornada laboral normal, por ejemplo entre 3 y 5 p.m. Esto ejerce una enorme presión de tiempo sobre los empleados, el equipo y el espacio en el laboratorio implicados. Sin embargo, la inoculación y la siembra en estrías sólo es el principio del ensayo microbiológico real, y también se producen picos de carga para los procedimientos corriente abajo, incluyendo la incubación de las placas, el procesamiento (por ejemplo, la tinción) y la evaluación final de la placa. Por tanto, en el campo se ha intentado automatizar el proceso de inoculación y/o siembra en estrías de placas. E08846927 31-10-2011 Por ejemplo, el ISOPLATER 180 (Vista Technology Inc., Edmonton, Alberta, Canadá) es un sembrador en estrías de placas Petri automático. La máquina hace rotar automáticamente el carrusel de carga para introducir un apilamiento de placas, descargar una placa, retirar la tapa, orientar la placa, transferir la placa con su tapa, sembrar en estrías en cuatro cuadrantes sucesivos para el aislamiento, volver a poner la tapa, y cargar la placa finalizada sobre el carrusel de descarga. La distribución sobre la superficie completa de una placa de agar la realizan cuatro asas de siembra de nicocromo individuales que son esterilizadas mediante un calentamiento eléctrico entre las placas. El documento WO 2005/071055 describe un dispositivo y aparato de siembra en estrías para sembrar en estrías un inóculo microbiano para obtener colonias individuales sobre la superficie de un medio de crecimiento sólido. El dispositivo se caracteriza por una estructura de tipo peine que consiste en una fila de superficies de contacto espaciadas entre sí que están soportadas de forma elástica por un miembro de soporte común. El dispositivo de siembra en estrías se aplica sobre la superficie de una placa de agar y se hace rotar en diversos grados. La técnica anterior, remontándose hasta principios de los años ochenta, describe sistemas de siembra en estrías que comprenden el uso de una partícula de metal magnético esférica, en particular bolas de acero. Por ejemplo, el documento US 3.830.701 describe un método y un aparato para la siembra en estrías de una muestra microbiana que comprende poner en contacto una bola de acero inoxidable con un inóculo y generar un movimiento controlado de la bola utilizando un imán móvil para transferir la muestra microbiana a la superficie de un cultivo. Los documentos US 3.660.243 y US 3.623.958 describen métodos y dispositivos que comprenden características   similares. E08846927 31-10-2011 Los sistemas conocidos en la técnica sustituyen y realizan automáticamente muchas de las tareas manuales implicadas tradicionalmente en la inoculación y la siembra en estrías de placas de agar convencionales. Sin embargo, no se adaptan a todas las preferencias del usuario. Éstas incluyen: a) la producción de colonias individuales cuando se utilizan placas miniaturizadas o divididas; b) que no se produzca contaminación cruzada; c) que sea fácil de usar; d) que tenga gran capacidad (preferiblemente al menos 500 placas/hora); e) que tenga un coste bajo; y f) que tenga compatibilidad con diferentes tipos de especímenes, por ejemplo muestras líquidas, hisopos, etc., y con placas no convencionales, tales como placas divididas. Los presentes inventores se propusieron abordar al menos algunas de las preferencias anteriores para intentar proporcionar otros métodos y aparatos mejorados para la manipulación (semi)automática de una muestra microbiana. Observaron que las partículas de acero empleadas en los métodos de siembra en estrías controlados de forma magnética conocidos en la técnica no son adecuados para la siembra en estrías automática de alta velocidad fiable que se busca en la actualidad. En particular, se descubrió que las bolas de acero conocidas en la técnica muestran un rodamiento insuficiente para lograr una buena dispersión del inóculo sobre una superficie (de cultivo). Con las altas velocidades de siembra en estrías que se desean en la actualidad (al menos 500 placas/hora), las partículas de acero no fueron eficaces para producir colonias individuales, en especial cuando se requieren patrones de siembra en estrías más complejos para obtener una longitud de recorrido de siembra en estrías suficiente sobre una superficie específica limitada, por ejemplo el patrón de zigzag con curvas agudas para sembrar en estrías muestras sobre placas divididas. Sin querer limitarse por la teoría, se cree que una partícula de acero fabricada sin materiales compuestos y homogénea forma un dipolo y, por tanto, actúa como un imán en sí misma. Como resultado, la partícula de acero resbala sobre la superficie de la placa durante el movimiento controlado de forma magnética, y la partícula no puede realizar movimientos de rodamiento óptimos. Se descubrió, de modo sorprendente, que pueden obtenerse unos resultados de siembra en estrías mucho mejores cuando se emplea una partícula magnética fabricada con un material compuesto y no homogénea, en lugar de las partículas de acero inoxidable homogéneas conocidas en la técnica. Además, otras características de la partícula, tales como el diámetro, la densidad y/o la rugosidad de la superficie,... [Seguir leyendo]

E08846927 31-10-2011 1.- Un método para realizar una siembra en estrías de una muestra microbiana sobre un vehículo sólido, que comprende las etapas de: a) poner en contacto al menos una partícula ferromagnética con la superficie de dicho vehículo sólido, siendo la partícula una esfera de un material compuesto que tiene una rugosidad superficial (Ra) en el intervalo de 0,1 a 25 µm, un diámetro entre 2 y 8 mm, y una densidad menor que 7 g/cm 3 , seguido o precedido de proporcionar la partícula con al menos parte de dicha muestra, y b) aplicar un gradiente de campo magnético para permitir un movimiento controlado de modo magnético de dicha esfera sobre dicha superficie, de forma que al menos parte de la muestra se siembra en estrías sobre el vehículo sólido. 2.- El método según la reivindicación 1, en el que dicho vehículo es un portaobjetos de vidrio o un medio de cultivo sólido contenido en una placa de cultivo. 3.- El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha muestra microbiana es una espécimen clínico, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en orina, hisopos del tracto respiratorio superior, secrecciones genitales, esputo, heces, pus, fluidos corporales estériles, y cultivos de sangre. 4.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la partícula tiene una rugosidad superficial de entre 2 y 15 µm, preferiblemente de 5 a 10 µm. 5.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha al menos una esfera de un material compuesto comprende al menos un polímero y al menos un material magnético, preferiblemente en el que la esfera comprende un núcleo magnético provisto de un revestimiento polimérico, o en el que la esfera comprende un núcleo polimérico cubierto por un revestimiento magnético. 6.- El método según la reivindicación 5, en el que la proporción en peso relativa del material magnético al polímero es entre 10:90 y 30:70, preferiblemente entre 20:80 y 25:75. 7.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la esfera de un material compuesto comprende magnetita o ferrita. 8.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el diámetro de la esfera es de 3-8 mm, preferiblemente 4-6 mm. 9.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la densidad de la esfera es menor que 5 g/cm 3 , preferiblemente menor que 4 g/cm 3 . 10.- Una esfera magnética de un material compuesto adecuada para su uso en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, teniendo la esfera una rugosidad superficial (Ra) en el intervalo de 0,1 a 25 µm, un diámetro entre 2 y 8 mm, y una densidad menor que 7 g/cm 3 . 11.- La esfera magnética de un material compuesto según la reivindicación 10, comprendida en un recipiente para especímenes para recibir una muestra microbiana. 12.- La esfera magnética de un material compuesto según la reivindicación 11, comprendida en un recipiente que tiene la forma de un tubo, estando provisto dicho tubo de una tapa movible, y comprendiendo además un medio de cultivo o de transporte. 13.- La esfera magnética de un material compuesto según las reivindicaciones 11 ó 12, comprendida en un recipiente que comprende además un hisopo para recoger una muestra microbiana. 14.- Un aparato adecuado para realizar un método según la reivindicación 1 y las que dependen de ella, de una manera automática o semiautomática, comprendiendo dicho aparato una estación de carga de placas de cultivo, una unidad de muestreo para aplicar o inocular la muestra sobre una placa de cultivo, un mecanismo de siembra en estrías, y un sistema de control informático, en el que dicho mecanismo de siembra en estrías se proporciona con al menos un imán para generar un gradiente de campo magnético, y en el que el sistema de control está conectado a dicho al menos un imán, comprendiendo dicho aparato además una unidad dispensadora de partículas magnéticas que comprende una pluralidad de esferas magnéticas de un material compuesto que tienen una rugosidad superficial (Ra) en el intervalo de 0,1 a 25 µm, un diámetro entre 2 y 8 mm, y una densidad menor que 7 g/cm 3 . 15.- El aparato según la reivindicación 14, que comprende además, conectado al sistema de control, una unidad de identificación de muestras, una unidad de muestreo automática y/o un dispositivo de manipulación de tapas automático.   E08846927 31-10-2011   E08846927 31-10-2011   E08846927 31-10-2011   E08846927 31-10-2011   E08846927 31-10-2011