ENSAYOS DE CICLACIÓN ENZIMÁTICA PARA LA HOMOCISTEÍNA Y LA CISTATIONINA.

Ensayos de ciclación enzimática para la homocisteína y la cistationina. Antecedentes de la invención Las grandes concentraciones de homocisteína en el plasma humano se correlacionan con el aumento del riesgo de cardiopatía coronaria, ictus, arterioesclerosis y otras enfermedades. Como resultado, es deseable examinar en la población en general las cantidades elevadas de este aminoácido. Para la viabilidad de la prueba a gran escala de la homocisteína, deben desarrollarse nuevos ensayos y menos costosos. La homocisteína en el plasma se mide de forma rutinaria por cromatografía líquida a alta presión (HPLC) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) a un coste superior a 100 $ por ensayo, haciendo demasiado costosos estos métodos de separación física para un estudio en toda la población. Por ejemplo, pueden prepararse muestras de orina o de sangre para cromatografía de aminoácidos, y cuantificar la L-homocisteína por separación y detección por HPLC. Fiskerstrand et al., (Clin. Chem., 39:263-271 (1993)) describen un método de ensayo de L-homocisteína que utiliza el marcaje fluorescente de tioles del suero, seguido de separación y detección por HPLC del derivado de L-homocisteína procedente de varios otros compuestos que contienen azufre. Sin embargo dichos métodos son por lo general prolongados, costosos y no resultan fácilmente disponibles en muchos laboratorios. Se ha desarrollado también un inmunoensayo indirecto para la homocisteína, sin embargo, estos métodos de anticuerpos son todavía relativamente costosos a razón de aproximadamente 24 $ por prueba. Un inmunoensayo indirecto específico convierte mediante enzimas la homocisteína en adenosil-homocisteína y la cantidad de adenosilhomocisteína se determina por un ELISA competitivo (inmunoensayo con enzima ligada), utilizando un anticuerpo anti-adenosil-homocisteína (por ejemplo, véase la patente US nº 5.827.645). Se han desarrollado ensayos enzimáticos indirectos para la cuantificación de L-homocisteína. Por ejemplo, la enzima S-adenosil-homocisteína hidrolasa y la adenosina se añaden a una muestra de prueba. La concentración resultante, o el cambio en la concentración, de adenosina en la mezcla de reacción se utiliza como indicador para la concentración inicial de homocisteína en la muestra. Se han publicado también ensayos enzimáticos directos para cuantificar la homocisteína. Por lo general, estos protocolos convierten de manera irreversible la homocisteína en otros compuestos que son cuantificables. Por ejemplo, la enzima homocisteína deshidratasa se ha utilizado para eliminar el grupo sulfhidrilo de la homocisteína. La concentración del resto sulfhidrilo eliminado se mide a continuación. Un inconveniente principal en éste y otros ensayos enzimáticos para la homocisteína es que las enzimas utilizadas reaccionan con otros aminoácidos que contienen azufre y compuestos relacionados con la homocisteína, conduciendo a un fondo elevado e inconstante y a determinaciones de homocisteína en el plasma que son inexactas. Se han publicado ensayos de ciclación enzimática para un número muy pequeño de analitos. En un ensayo de ciclación enzimático se utilizan dos o más actividades enzimáticas que reciclan el sustrato y no convierten de manera irreversible el compuesto cuantificado. En su lugar el "compuesto" se utiliza como catalizador para controlar la velocidad de conversión para el compuesto cuantificado en el ensayo. Como resultado, el analito de interés continúa en una concentración estacionaria que es lo suficiente baja como para crear una velocidad de reacción de seudoprimer orden. La concentración estacionaria del analito de este modo está relacionada linealmente con la velocidad de todo el ensayo. Al medir las velocidades de reacción, la cantidad del analito se determina fácilmente. Los ensayos de ciclación enzimática se denominan a veces ensayos de "ampliación", porque los métodos por lo general aumentan la sensibilidad de la cuantificación de un analito de 100 a 1.000 veces. La ampliación de la cuantificación es un resultado directo de no reducir la concentración estacionaria del compuesto. Se ha publicado un ensayo de ciclación enzimática para la cuantificación de la homocisteína en el documento WO 00/28071. La presente invención proporciona un ensayo de ciclación enzimática para la homocisteína y/o la cistationina que es menos costoso, y proporciona un resultado superior de la muestra que los ensayos de diagnóstico actualmente disponibles. Además, la invención proporciona métodos y vectores para la producción recombinante de enzimas que pueden utilizarse en la producción de reactivos de ensayo y kits de prueba para evaluar la cantidad de homocisteína y cistationina en una muestra. Sumario de la invención La presente invención proporciona un kit de prueba para su utilización en la evaluación de la cantidad de homocisteína en una solución de la muestra que contiene cistationina ß-sintasa, o un derivado de la misma, L-serina, cistationina ß-liasa, o un derivado de la misma, en el que los derivados conservan actividad enzimática de una enzima natural aislada. La invención proporciona además una enzima aislada que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo 2   constituido por las SEC. ID. nº 19 y nº 20. La invención proporciona además un procedimiento de utilización de la cistationina como calibrador del ensayo de homocisteína que comprende las etapas siguientes: (a) tomar una concentración conocida de cistationina; (b) añadir dicha concentración conocida a una muestra biológica; (c) utilizar dicha muestra que contiene cistationina en una reacción enzimática que convierte la homocisteína en cistationina y reconvertir la cistationina en homocisteína con la producción acompañante de piruvato y amoniaco; (d) medir las cantidades de piruvato o amoniaco producidas; y (e) utilizar dichas cantidades medidas de piruvato o amoniaco como patrones de referencia para dicho ensayo de homocisteína. Ésta aprovecha la reacción de homocisteína y L-serina para formar cistationina mediante la enzima cistationina ßsintasa (CBS), o un derivado de la misma que conserva actividad enzimática de una enzima natural aislada y la conversión enzimática por la cistationina ß-liasa (CBL) de cistationina a homocisteína, piruvato y amoniaco. El kit puede utilizarse para un ensayo que proporciona una concentración estacionaria de la homocisteína y/o la cistationina que está linealmente relacionado con la velocidad de la reacción completa. La cantidad de homocisteína y/o cistationina determinada en una muestra se basa en la cantidad de piruvato y/o amoniaco que se forma o en la cantidad de serina eliminada de la mezcla de reacción. Las soluciones que pueden someterse a prueba utilizando el kit de la presente invención pueden incluir muestras de laboratorio de sangre, suero, plasma, orina y otras muestras biológicas. Además, puede someterse a prueba cualquier otra muestra líquida. Se da a conocer un procedimiento para evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina en una solución que comprende las etapas siguientes: (a) poner en contacto la solución que contiene homocisteína y/o cistationina (bien antes y/o después de llevar a cabo una etapa de reducción de disulfuro) para formar una mezcla de reacción con CBS, o un derivado de la misma, L-serina y CBL, o un derivado de la misma, durante un periodo suficiente para catalizar la conversión cíclica de homocisteína en cistationina, y la reconversión de cistationina en homocisteína con producción de piruvato y amoniaco; (b) determinar la cantidad de piruvato y/o amoniaco presente en la mezcla de reacción; y (c) evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en la solución basándose en la cantidad de piruvato y/o amoniaco formada. Más específicamente, el procedimiento proporciona la evaluación de la cantidad de homocisteína mediante la adición del aminoácido L-serina económico. La cantidad de piruvato presente en la mezcla de reacción puede medirse de numerosas maneras. En un kit específico de la presente invención lactato-deshidrogenasa (LDH) y NADH (cofactor de nicotinamida reducido), están presentes en la mezcla de reacción. LDH en presencia de NADH convierte piruvato en lactato con la oxidación de NADH a NAD+ (cofactor de nicotinamida oxidado). La oxidación de NADH a NAD+ puede medirse por numerosos procedimientos conocidos en la técnica incluyendo el seguimiento de la mezcla de reacción a 340 nm. La producción de NAD+ puede también seguirse por la oxidación de un colorante para producir un cambio de color observable. Los colorantes preferidos para su utilización en la presente invención comprenden de manera no limitativa 5,5-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), 2,6-diclorofenilindofenol, compuestos de tetrazolio, metosulfato de fenazina,... [Seguir leyendo]

1. Kit de prueba adecuado para su utilización en la evaluación de la cantidad de homocisteína en una solución de muestra que comprende cistationina ß-sintasa, o un derivado de la misma, L-serina, cistationina ß-liasa, o un derivado de la misma, en el que los derivados conservan la actividad enzimática de una enzima natural aislada. 2. Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además un recipiente para contener dicha muestra. 3. Kit de prueba según la reivindicación 1, estando presente dicha cistationina ß-sintasa en una concentración final de 0,1 a 100 KU/l. 4. Kit de prueba según la reivindicación 1, estando presente dicha L-serina en una concentración final de 1 µM a 50 µM. 5. Kit de prueba según la reivindicación 1, estando presente dicha cistationina ß-liasa en una concentración final de 0,01 a 100 KU/l. 6. Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende lactato deshidrogenasa y NADH. 7. Kit de prueba según la reivindicación 6, estando presente dicha lactato deshidrogenasa en una concentración final de 30 a 5.000 U/l. 8. Kit de prueba según la reivindicación 6, estando presente dicha NADH en una concentración final de 0,1 mM a 2 mM. 9. Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además un colorante que puede experimentar un cambio de color cuando se oxida. 10. Kit de prueba según la reivindicación 9, en el que dicho colorante es seleccionado de entre el grupo constituido por 5,5-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), 2,6-diclorofenolindofenol, compuesto de tetrazolio, metosulfato de fenazina o metilo viológeno. 11. Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además un recipiente separado, conteniendo dicho recipiente separado un agente reductor. 12. Kit de prueba según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor comprende una sal de borohidruro o un agente reductor de tiol. 13. Kit de prueba según la reivindicación 12, en el que dicho agente reductor de tiol es seleccionado de entre el grupo constituido por ß-mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, TCEP o ácido tioacético, o cualquier sal de cada uno de los mismos. 14. Kit de prueba según la reivindicación 13, estando presente dichos ditiotreitol, ß-mercaptoetanol, ditioeritritol o ácido tioacético en una cantidad de 0,2 mM a 3 mM. 15. Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además cistationina -liasa, o un derivado de la misma, en el que el derivado conserva la actividad enzimática de una enzima natural aislada. 16. Kit de prueba según la reivindicación 2, 16 ó 15, en el que dicha cistationina ß-sintasa, o un derivado de la misma, cistationina ß-liasa, o un derivado de la misma, cistationina -liasa, o un derivado de la misma, lactato deshidrogenasa, o un derivado de la misma, están inmovilizadas dentro de dicho recipiente, en el que los derivados conservan la actividad enzimática de una enzima natural aislada. 17. Kit de prueba según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada una de las enzimas se construye como proteínas de fusión. 18. Enzima aislada que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 19 y nº 20. 19. Procedimiento de utilización de cistationina como calibrador del ensayo de homocisteína que comprende las etapas siguientes: (a) tomar una concentración conocida de cistationina; (b) añadir dicha concentración conocida a una muestra biológica; 39   (c) utilizar dicha muestra que contiene cistationina en una reacción enzimática que convierte la homocisteína en cistationina y reconvierte la cistationina en homocisteína con la producción acompañante de piruvato y amoniaco; (d) medir las cantidades de piruvato o amoniaco producidas; y (e) utilizar dichas cantidades medidas de piruvato o amoniaco como patrones de referencia para dicho ensayo de homocisteína.   41   42   43   44     46   47   48   49