DETECCIÓN ÓPTICA Y ANÁLISIS DE PARTÍCULAS.

Un procedimiento para la detección óptica y/o el análisis de particulados sub-micrométricos,

que comprende las etapas de: i. iluminar, con un haz óptico enfocado, un substrato (1), parte de una superficie de cuyo substrato se ha recubierto con una película (2) que comprende un metal ópticamente opaco, y parte (3) de cuya superficie se ha dejado sin recubrir, de tal modo que la superficie tiene una porción recubierta y una porción adyacente sin recubrir, siendo el haz óptico enfocado incidente sobre el substrato en un punto de la porción sin recubrimiento de la superficie recubierta que es adyacente a, o que cae dentro de 5 mm de, pero que no es coincidente con, la porción de la superficie recubierta con película metálica, y formando un ángulo tal que se provoca que al menos una porción del haz óptico se propague por encima de, pero paralelo o formando un ángulo menor de 5º con, la superficie de la película metálica; ii. colocar sobre la superficie el substrato una muestra (6) que contiene una partícula o una población de partículas (7) de dimensiones sub-micrométricas, de tal modo que las partículas entran en una región iluminada por el haz óptico que se propaga por encima de la película metálica, y iii. detectar, mediante una lente y una disposición detectora (8) adecuadas, situadas en el campo lejano en posición normal al, o formando un ángulo grande con el, plano de la película metálica, la radiación óptica esparcida individualmente por, o que de otro modo se provoca que sea emanada desde, las partículas en virtud de su interacción con el haz óptico

La presente invención se refiere a la detección óptica y al análisis de partículas de dimensiones nanométricas o sub-micrométricas.

Existe un gran número de principios y técnicas mediante los que pueden ser analizadas las partículas en cuanto a su número, tamaño, forma, composición y movimiento. Históricamente, la observación y la caracterización de partículas ha estado basada en el campo de la microscopía en el que se generan imágenes de partículas considerablemente aumentadas mediante el uso de sistemas de lentes de alta potencia, y que pueden ser vistas directamente por el ojo

o pueden ser capturadas mediante una cámara para su interpretación posterior por parte del operador o por medio de un sistema de análisis de imágenes.

Existen muchos tipos de sistemas de microscopio capacitados para caracterizar la partícula en términos de su interacción con la iluminación incidente. Por ejemplo, la partícula puede absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz tal como ocurre en absorción diferencial, la técnica más común en la microscopía de transmisión convencional. Existen otras variantes microscópicas que monitorizan selectivamente longitudes de onda específicas generadas por la partícula cuando se ilumina mediante una iluminación incidente, tal como la microscopía fluorescente que es útil para la reducción de la interferencia de fondo y que puede ser utilizada para identificar estructuras específicas mediante el uso de etiquetas fluorescentes. Todavía otras técnicas microscópicas utilizan la manera en la que una partícula induce un cambio de fase en la luz incidente, tal como microscopía de contraste de fase o de interferencia. Otras técnicas microscópicas, tal como la microscopía epiluminiscente, emplean dispersión de luz en grandes ángulos para permitir que las partículas de bajo contraste sean visualizadas contra un fondo sin iluminar. Se utilizan otras versiones similares de esta técnica en microscopía, de las que la más común se conoce como microscopía de campo oscuro. En este caso, la muestra se ilumina mediante una fuente de alta apertura numérica, y la porción central del cono de iluminación se bloquea en cuanto a la entrada del objetivo de detección mediante un tope óptico de modo que la partícula se ilumina solamente según un ángulo oblicuo.

Los procedimientos de iluminación varían considerablemente y, en determinadas circunstancias la muestra (típicamente, una suspensión acuosa de partículas) puede ser colocada sobre un substrato óptico transparente (típicamente, de vidrio o sílice), el cual puede ser iluminado mediante un haz óptico adecuadamente definido y colimado, formando un cierto ángulo llamado ángulo crítico, al que la luz incidente es reflejada a lo largo del plano del elemento óptico sobre el que se ha colocado la muestra líquida. Una pequeña porción del haz, denominada onda evanescente, se propaga a una corta distancia en la fase de muestra por encima del substrato óptico, y las partículas que entran en esta región evanescente actúan de modo que dispersan algo de este campo de otro modo no radiativo. La luz acoplada (es decir, esparcida por la partícula por dentro del campo evanescente), puede ser detectada a continuación en el campo lejano, ya sea por medio del ojo o ya sea por medio de un detector adecuado situado normal al, o formando un ángulo grande con el, plano de la superficie. Cuando se emplea en una configuración de microscopio, esta técnica se conoce como microscopía de campo evanescente y se basa en el principio de reflexión interna total incompleta.

Existen numerosos procedimientos que no incluyen formación de imágenes, para el análisis óptico de suspensiones de partículas sub-m o de soluciones de partículas a escala del nm, tales como moléculas biológicas o macromoléculas. Muchas de estas técnicas monitorizan la interacción entre moléculas biológicas y, con el fin de definir una región dentro de tales interacciones, pueden ser detectadas específicamente dentro de una interferencia mínima de otras especies en la masa volúmica de la fase de solución, siendo tales análisis llevados a cabo frecuentemente en la interfaz de un guía ondas óptico con una estructura de fibra óptica sobre cuya superficie se han inmovilizado moléculas biológicas capturadas, tales como anticuerpos, específicas para el analito objetivo. En guía ondas o sistemas de fibra óptica convencionales, se hace uso de los cambios en las propiedades de índice de refracción de la interfaz a continuación de la unión de moléculas biológicas específicas en la región de campo evanescente de la estructura óptica asociada a la superficie. Este campo se extiende, sin embargo, solamente alrededor de 100-200 nm en la fase de solución de masa, y está por consiguiente limitado en cuanto a su capacidad de monitorizar interacciones débiles que incluyan números limitados de interacciones moleculares. Un procedimiento de este tipo se ha divulgado en el documento DE 4307042 (930305), en el que una capa simple o múltiple de moléculas receptoras es depositada sobre un dispositivo sensor evanescente guía ondas, y el cual está capacitado para detectar y cuantificar varias especies químicas y bioquímicas en solución. Un procedimiento similar se ha divulgado en el documento WO 9005295 que reivindica prioridad del documento SE 884075 (881110) en el que se utiliza un prisma en forma de cuña para permitir que la luz reflejada con diferentes ángulos hacia fuera del lado inferior del elemento de sensor óptico, sea representada en imágenes y analizada para cuantificar especies específicas en solución. De forma similar, el documento EP 677735, que reivindica prioridad del documento US 228233 (940415), describe una cavidad resonadora óptica en la que la luz es reflejada a partir de una cavidad reflectora interna total (TIR) que está en contacto con una solución cuyos componentes interactúan con el campo evanescente en el interior de la cavidad TIR, permitiendo la cuantificación de especies en la solución. Estas técnicas están caracterizadas por su fiabilidad respecto al análisis de la luz que es reflejada desde el lado inferior de la superficie de un elemento de detección.

La capacidad para seguir números tan bajos de interacciones o eventos de unión puede verse, no obstante, significativamente incrementada en uno o dos órdenes de magnitud con el empleo de técnicas de Resonancia de Plasmón Superficial, en las que la superficie de una estructura de guía ondas óptico está recubierta con una película delgada de un metal conductor, típicamente oro, plata o aluminio, en la que las ondas electromagnéticas, denominadas Plasmones Superficiales, pueden ser inducidas por un haz de luz incidente sobre la interfaz de vidrio-metal con un ángulo específico denominado ángulo de Resonancia de Plasmón Superficial. La modulación del índice de refracción de la región interfacial entre la solución y la superficie metálica a continuación de la unión de las macromoléculas capturadas, provoca un cambio en el ángulo SPR que, o bien puede ser medido directamente, o bien provoca que la cantidad de luz reflejada desde el lado inferior de la superficie metálica cambie. Tales cambios pueden estar relacionados directamente con la masa y con otras propiedades ópticas de las moléculas que se unen a la superficie del dispositivo SPR. Se han divulgado diversos sistemas biosensores basados en tales principios. Así, el documento WO 9005305 que reivindica prioridad del documento SE884974 (881110), describe el uso de una película metálica depositada sobre un lado de una unidad de bloque de instrumentación óptica, de la que un lado multi-funcionalizado está en contacto con una solución de reactivos o muestras que han de ser medidas, estando el otro lado iluminado por medio de un haz óptico en el interior de la unidad de bloque de instrumentación óptica de modo que causa la reflexión hacia fuera de la superficie metálica con un ángulo tal que la reflectancia se modifica mediante la unión selectiva de ligandos sobre la superficie funcionalizada. La medición del haz reflejado puede estar correlacionada con concentraciones de especies específicas que se unen a la superficie detectora funcionalizada.

De manera similar, el documento EP 341927, que reivindica prioridad del documento GB881154 (880510), describe un sensor de prueba biológica o bioquímica, que comprende un sensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) y una superficie de anticuerpo de muestra dispuesta de manera que influye en las características de resonancia. El sensor SPR comprende un portaobjetos de vidrio metalizado sobre cuya interfaz de vidrio-metal se dirige un... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección óptica y/o el análisis de particulados sub-micrométricos, que comprende las etapas de:

i. iluminar, con un haz óptico enfocado, un substrato (1), parte de una superficie de cuyo substrato se ha recubierto con una película (2) que comprende un metal ópticamente opaco, y parte (3) de cuya superficie se ha dejado sin recubrir, de tal modo que la superficie tiene una porción recubierta y una porción adyacente sin recubrir, siendo el haz óptico enfocado incidente sobre el substrato en un punto de la porción sin recubrimiento de la superficie recubierta que es adyacente a, o que cae dentro de 5 mm de, pero que no es coincidente con, la porción de la superficie recubierta con película metálica, y formando un ángulo tal que se provoca que al menos una porción del haz óptico se propague por encima de, pero paralelo o formando un ángulo menor de 5º con, la superficie de la película metálica;

ii. colocar sobre la superficie el substrato una muestra (6) que contiene una partícula o una población de partículas (7) de dimensiones sub-micrométricas, de tal modo que las partículas entran en una región iluminada por el haz óptico que se propaga por encima de la película metálica, y

iii. detectar, mediante una lente y una disposición detectora (8) adecuadas, situadas en el campo lejano en posición normal al, o formando un ángulo grande con el, plano de la película metálica, la radiación óptica esparcida individualmente por, o que de otro modo se provoca que sea emanada desde, las partículas en virtud de su interacción con el haz óptico.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que: el substrato comprende, o está formado a partir, un material que es total o sustancialmente transparente ópticamente.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el haz óptico enfocado que es incidente sobre una superficie del substrato, es refractado durante su paso a través del substrato, y emerge por la superficie opuesta paralelo a, o formando un ángulo menor de 5º con, la porción recubierta de película metálica de dicha superficie.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas partículas son analizadas en términos de su número, concentración, tamaño, distribución por tamaño, forma o movimiento.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas partículas son analizadas en términos de la intensidad y/o longitud de onda de la radiación fluorescente u otra radiación no esparcida que las mismas emiten o que se provoca que emitan en virtud de su interacción con la radiación de iluminación.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas partículas son analizadas en términos de sus propiedades de polarización o de modulación de fase.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se provoca que dichas partículas entren en el volumen iluminado por el haz óptico sobre una base individual.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una pluralidad de partículas están presentes simultáneamente en el haz óptico, y la señal óptica procedente de cada una de la pluralidad de partículas es diferenciada con el fin de permitir que las citadas partículas sean caracterizadas individualmente.

9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas de la muestra son etiquetadas con moléculas fluorescentes para permitir que las mismas sean distinguidas de otras partículas y/o del ruido de fondo.

10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos parte de la superficie del substrato que va a estar en contacto con la muestra, está diversificada con una o más especies moleculares.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la una o más especies moleculares se unen específicamente a partículas de la muestra.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que la una o más especies moleculares comprenden moléculas de captura biológica tales como anticuerpos que se vinculan tipos específicos de partículas como una función de sus características estructurales moleculares.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el movimiento Browniano dinámico o el comportamiento asociado a interacciones entre partículas en la muestra, se detecta y se analiza mediante técnicas analíticas adecuadas tales como espectroscopia de fluctuación numérica, espectroscopia de correlación de fluorescencia, o mediante procedimientos de análisis de imagen para movimiento de rastreo de fuentes de señal específicas.

14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas detectables son parte de una estructura supramolecular más grande.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha estructura supramolecular es una célula

o un componente celular, un biofilm, o una capa polimérica.

16. Aparato para llevar a cabo el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende: un substrato (1), del que una parte de una superficie está recubierta con una película (2) que comprende un metal ópticamente opaco, y una parte (3) de cuya superficie se ha dejado sin recubrir, de tal modo que la superficie tiene una porción recubierta y una porción adyacente sin recubrir; medios (4, 5) para iluminar dicho substrato con un haz óptico enfocado, comprendiendo dichos medios una fuente de iluminación óptica, de tal modo que el haz óptico es incidente sobre el substrato en un punto sobre la porción sin recubrimiento de la superficie recubierta que es adyacente a, o que cae dentro de 5 mm de, pero no es coincidente con, la porción recubierta de película metálica de la superficie, y que forma un ángulo tal que se provoca que el haz óptico se propague por encima de, pero paralelo o formando un ángulo menor de 5º con, la superficie de la película metálica; y un detector

(8) situado en el campo lejano para detectar la radiación óptica esparcida por, o que se provoca de otro modo que emane desde, la partícula a través de su interacción con el haz óptico.

17. Aparato de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la fuente es un láser.

18. Aparato de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en el que el detector comprende un microscopio convencional.

19. Aparato de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en combinación con un instrumento citómetro de flujo.

20. Aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que el substrato comprende, o está formado a partir de, un material total o sustancialmente transparente.

21. Aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-20, en el que el haz óptico enfocado que es incidente sobre una superficie del substrato, es refractado durante su paso a través del substrato, y emerge por la superficie opuesta paralelo a, o formando un ángulo menor de 5º con, la porción de dicha superficie recubierta con película metálica.

22. Un microscopio o un citómetro de flujo que comprende un aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-21.