ANALISIS DE MEZCLAS BIOLOGICAS Y/O QUIMICAS UTILIZANDO PARTICULAS MAGNETICAS.

Método de análisis de una mezcla de componentes biológicos y/o químicos,

que comprende:

- seleccionar un componente para fijar partículas magnéticas al mismo o un componente que ya está fijado a partículas magnéticas, siendo este componente seleccionado o bien el analito o bien otro componente que permite generar datos cuantitativos sobre la evaluación del contenido del analito en la mezcla que se está analizando,

- disponer espacialmente dicho componente seleccionado, y agrupar este componente en un volumen de sonda,

- fijar partículas magnéticas a dicho componente seleccionado o usar dicho componente seleccionado que ya está fijado a partículas magnéticas,

- exponer dichas partículas magnéticas a un campo magnético,

- registrar una señal debida a la inducción magnética producida por dichas partículas magnéticas como consecuencia de su exposición al campo magnético,

- evaluar el contenido del analito en la mezcla que se está analizando a partir del valor de dicha señal, caracterizado porque:

- dicho campo magnético es alterno, y su espectro se preconfigura con por lo menos dos componentes espectrales en dos frecuencias diferentes, por lo menos uno de dichos componentes espectrales tiene una amplitud que garantiza una dependencia no lineal de dicha inducción magnética con respecto a la intensidad de dicho campo magnético;

- dicha señal se está registrando a una frecuencia que es una combinación lineal de las frecuencias de los componentes espectrales, durante la exposición de dichas partículas magnéticas a dicho campo magnético

Análisis de mezclas biológicas y/o químicas utilizando partículas magnéticas.

Campo de la invención

El método propuesto se refiere al campo del desarrollo y la mejora de medios para análisis bioquímicos y al campo de los sensores químicos y los biosensores.

Antecedentes de la invención

Se conocen métodos de análisis bioquímico de una mezcla de componentes con el uso de partículas magnéticas a partir de los documentos WO 99/27367, WO 97/45740. [Ch. B. Kriz, K. Radevik, D. Kriz, Magnetic Permeability Measurements in Bioanalysis and Biosensors/Anal. Chem. 68, 1996, págs. 1966 a 1970] dan a conocer otro método, que incluye lo siguiente:

- se hace uso de un componente seleccionado fijado a partículas magnéticas;

- se exponen dichas partículas magnéticas a un campo magnético,

- se registra una señal debida a la inducción magnética producida por dichas partículas magnéticas como consecuencia de su exposición al campo magnético,

- se evalúa el contenido del analito en la mezcla que se está analizando a partir del valor de dicha señal.

Según este método, se introducen partículas en una muestra de la mezcla a analizar, portando dichas partículas elementos de reconocimiento que unen selectivamente al analito. Además, en la mezcla que se está analizando, debería haber un componente seleccionado fijado a partículas magnéticas. Este componente se une selectivamente al analito después de la unión de este último a los elementos de reconocimiento, o compite con el analito para unirse a los elementos de reconocimiento. En casos excepcionales en los que el analito contenga partículas magnéticas, el componente seleccionado puede ser el propio analito.

Desarrollándose esto así, este método incluye necesariamente retirar de la muestra aquellas partículas magnéticas que parecen no estar unidas a las partículas portadoras después del transcurso de las reacciones antes mencionadas. Para realizar esto, la muestra se somete a sedimentación, centrifugación, y enjuague con una solución tampón de unión. A continuación, una cierta dosis de la muestra se coloca en un tubo de ensayo, que se inserta en una bobina de inducción. A partir del cambio de la inducción magnética de la bobina después de insertar la muestra en la misma, se evalúa el contenido del analito en el medio que se está analizando.

El inconveniente de este equivalente consiste en su alta complejidad y bajo rendimiento debido a un número elevado de operaciones. Esto conduce también a un coste elevado, una fiabilidad insuficiente y una baja precisión de los resultados obtenidos.

El más próximo al método propuesto es un método equivalente de análisis de polinucleótidos y proteínas que usa fracciones magnetizables [patente US nº 5.656.429 de 12.08.97, Polynucleotide and protein analysis method using magnetizable moieties, Int. Cl.: C12 Q 1/68, U.S. Cl.: 435/6,], que comprende las siguientes operaciones:

- seleccionar un componente para fijar partículas magnéticas al mismo o un componente que ya está fijado a partículas magnéticas, siendo este componente seleccionado o bien el analito o bien otro componente que permite evaluar el contenido del analito en la mezcla que se está analizando,

- disponer espacialmente dicho componente seleccionado,

- fijar partículas magnéticas a dicho componente seleccionado o se usa dicho componente seleccionado que ya está fijado a partículas magnéticas,

- exponer dichas partículas magnéticas a un campo magnético,

- registrar una señal debida a la inducción magnética producida por dichas partículas magnéticas como consecuencia de su exposición al campo magnético,

- evaluar el contenido del analito en la mezcla que se está analizando a partir del valor de dicha señal.

Al realizar esto, se distribuyen componentes de una manera preestablecida (por ejemplo, por electrofóresis) sobre la superficie de un sustrato según el tamaño molecular y la cantidad de los componentes en la mezcla que se está analizando. Se fijan partículas magnéticas a uno u otro componente de la mezcla antes o después de distribuir los componentes sobre la superficie del sustrato. A continuación, se registra la distribución resultante por lectura magnética de la superficie del sustrato de forma similar a la lectura de información de un disco magnético. A partir de dicha distribución, se obtiene información sobre el contenido de uno u otro componente en la mezcla que se está analizando. Para posibilitar la lectura magnética, las partículas son magnetizadas por un campo magnético dc antes o después de distribuirlas sobre la superficie del sustrato. La lectura magnética en sí consiste en la medición de la inducción magnética resultante de la magnetización residual de las partículas. Una cualidad importante del método equivalente es la disposición espacial de partículas magnéticas que están unidas con el analito o el componente seleccionado. Esta disposición tiene lugar sobre la superficie del sustrato con una gran proximidad a un lector magnético. Consecuentemente, se incrementa la fiabilidad de los resultados, se minimizan las dimensiones del aparato requerido, y se garantiza la compatibilidad del aparato con tecnologías microelectrónicas.

Los inconvenientes de este método equivalente son la baja sensibilidad del método y la baja precisión de los resultados que produce, debido a varias razones. Las mismas son: en primer lugar, baja concentración de las partículas magnéticas que se están registrando, las cuales están "dispersas" sobre la superficie del sustrato; en segundo lugar, una magnetización residual muy baja de partículas conocidas de tamaño micrónico y submicrónico; y, en tercer lugar, aspectos negativos bien conocidos de las mediciones dc. Las razones mencionadas dan como resultado un área de aplicación restringida de este método.

Se conoce un aparato equivalente para leer resultados para el método de análisis bioquímico de una mezcla de sustancias, usando etiquetas magnéticas [Ch. B Kriz, K. Radevik, D. Kriz, Magnetic Permeability Measurements in Bioanalysis and Biosensors/Anal. Chem., 68, 1996, págs. 1966 a 1970], que comprende:

- unas partículas magnéticas fijadas a un componente seleccionado de la mezcla que se está analizando, directamente o a través de un material intermedio;

- un generador de campos magnéticos, bajo cuya acción están situadas dichas partículas magnéticas;

- un medidor de la inducción magnética producida por dichas partículas magnéticas;

- un receptor de señales de salida;

- un bloque que genera el resultado, estando conectada su entrada a la salida del receptor de señales de salida.

En este aparato, el medidor de inducción magnética, que se realiza en forma de una bobina de inducción, se inserta en un brazo de un circuito puente, cuya entrada está conectada a la salida del generador de campos magnéticos y la entrada del circuito se conecta a la entrada del receptor de señales de salida.

El funcionamiento de este aparato equivalente se basa en que la presencia de partículas magnéticas en la muestra que se está analizando y situada en el interior de la bobina de inducción, que actúa como medidor de inducción magnética, conduce a un cambio de esta inductancia y, por lo tanto, a una pérdida de equilibrio del circuito puente. Esto provoca la generación de la señal de salida del aparato descrito.

Los inconvenientes de este aparato equivalente son su alta complejidad y bajo rendimiento ya que el puente se debería equilibrar de forma precisa para cada medición nueva. Esto conduce también a un coste elevado y, teniendo en cuenta inestabilidades de temperatura del entorno (especialmente en variantes portátiles del aparato), a una baja precisión de los resultados obtenidos.

El más próximo al aparato propuesto es un aparato equivalente usado para la lectura de información en el método de análisis de polinucleótidos y proteínas que usa fracciones magnetizables. [Patente US nº 5.656.429 de 12.08.97, Polynucleotide and protein analysis method using magnetizable moieties, Int. Cl.: C12 Q 1/68, U.S. Cl.: 435/6], que comprende:

- un componente seleccionado de la mezcla que se está analizando, estando dispuesto espacialmente de una manera preestablecida dicho componente;

- unas partículas magnéticas fijadas al componente seleccionado de la mezcla que se está analizando...

1. Método de análisis de una mezcla de componentes biológicos y/o químicos, que comprende:

- seleccionar un componente para fijar partículas magnéticas al mismo o un componente que ya está fijado a partículas magnéticas, siendo este componente seleccionado o bien el analito o bien otro componente que permite generar datos cuantitativos sobre la evaluación del contenido del analito en la mezcla que se está analizando,

- disponer espacialmente dicho componente seleccionado, y agrupar este componente en un volumen de sonda,

- fijar partículas magnéticas a dicho componente seleccionado o usar dicho componente seleccionado que ya está fijado a partículas magnéticas,

- exponer dichas partículas magnéticas a un campo magnético,

- registrar una señal debida a la inducción magnética producida por dichas partículas magnéticas como consecuencia de su exposición al campo magnético,

- evaluar el contenido del analito en la mezcla que se está analizando a partir del valor de dicha señal,

caracterizado porque:

- dicho campo magnético es alterno, y su espectro se preconfigura con por lo menos dos componentes espectrales en dos frecuencias diferentes, por lo menos uno de dichos componentes espectrales tiene una amplitud que garantiza una dependencia no lineal de dicha inducción magnética con respecto a la intensidad de dicho campo magnético;

- dicha señal se está registrando a una frecuencia que es una combinación lineal de las frecuencias de los componentes espectrales, durante la exposición de dichas partículas magnéticas a dicho campo magnético.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha combinación lineal de las frecuencias de dichos componentes espectrales es la suma o la diferencia de estas frecuencias.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la combinación lineal de frecuencias de dichos componentes espectrales se define mediante la siguiente relación:

f_i = mf₁ + nf₂

en la que:

f₁ y f₂ son las frecuencias de los componentes espectrales de dicho campo magnético,

n y m son enteros positivos o negativos diferentes de cero.

4. Método según la reivindicación 3, en el que m es igual a uno y n es igual a más o menos dos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las amplitudes A_h y A₁ de dichos componentes espectrales, que pertenecen, respectivamente, a las frecuencias superior e inferior, se seleccionan según la relación A₁/A_h > 2.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los vectores de intensidad del campo magnético pertenecientes a, por lo menos, dichos dos componentes espectrales, se orientan de forma no colineal entre sí.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las partículas magnéticas se realizan con un material magnético blando.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las partículas magnéticas son superparamagnéticas.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en dicho volumen de sonda se forma una superficie de trabajo, y dicho componente seleccionado se está disponiendo espacialmente a través de la unión de este componente a la superficie de trabajo.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la superficie de trabajo se forma a través del llenado del volumen de sonda con microgránulos.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dichos microgránulos se realizan con polietileno.

12. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la superficie de trabajo se forma a través del llenado del volumen de sonda con una estructura capilar-porosa.

13. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la superficie de trabajo se forma a través del llenado del volumen de sonda con un material capilar-poroso en forma de una tira o un tubo.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque la superficie de trabajo se forma con la inmovilización de un reactivo en la misma, que es capaz de unir el analito de una manera selectiva, y, a través de este reactivo, dicho componente seleccionado se une a la superficie de trabajo.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque dicho volumen de sonda se forma a partir de varias zonas separadas espacialmente, y se garantiza la posibilidad de registrar dicha señal para cada una de dichas zonas.

16. Método según la reivindicación 15, caracterizado porque, en dichas zonas, se forma una superficie de trabajo y, en esta superficie de trabajo, se inmovilizan varios reactivos, que son capaces de unir varios analitos selectivamente y, a través de los cuales, componentes seleccionados se unen a la superficie de trabajo, y, a partir del registro de dicha señal para cada una de dichas varias zonas, se obtiene la información sobre el contenido de varios analitos en la mezcla que se está analizando.

17. Método según la reivindicación 16, caracterizado porque dichas zonas se forman como agrupaciones bidimensionales de celdas de reacción, o como placas de titulación.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el agrupamiento se realiza a través de exposición a un campo magnético no homogéneo.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el agrupamiento se realiza a través de filtración o sedimentación.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque se introduce la generación de una señal de referencia en un armónico de dicha frecuencia del campo magnético, usándose esta señal de referencia para una filtración sincronizada y para escoger dicha señal que se está registrando.

21. Aparato para el análisis de una mezcla de componentes biológicos y/o químicos, estando fijado por lo menos uno de ellos a partículas magnéticas, comprendiendo dicho aparato:

- un volumen (2) de sonda,

- un generador (1) de campos magnéticos adaptado para inducir en el volumen de sonda un campo magnético,

- unos medios (3) de medición adaptados para cuantificar las partículas magnéticas dentro del volumen de sonda mediante la medición de la inducción magnética producida por dichas partículas magnéticas dentro del volumen de sonda,

caracterizado porque: el generador de campos magnéticos está adaptado además para inducir un campo magnético que se preconfigura con por lo menos dos componentes espectrales a dos frecuencias diferentes y para las que las partículas magnéticas poseen una respuesta no lineal al campo magnético, y los medios de medición están adaptados además para medir la inducción magnética producida por dichas partículas a una frecuencia escogida que es una combinación lineal de las frecuencias de los componentes espectrales.

22. Aparato según la reivindicación 21, caracterizado porque dicha combinación lineal de las frecuencias de dichos componentes espectrales es la suma o la diferencia de estas frecuencias.

23. Aparato según la reivindicación 21, caracterizado porque la combinación lineal de frecuencias de dichos componentes espectrales se define mediante la siguiente relación:

f_i = mf₁ + nf₂

en la que:

- f₁ y f₂ son las frecuencias de los componentes espectrales de dicho campo magnético,

- n y m son enteros positivos o negativos diferentes de cero.

24. Aparato según la reivindicación 23, caracterizado porque m es igual a uno y n es igual a más o menos dos.

25. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque los medios de medición comprenden:

- un medidor (3) de inducción magnética;

- un receptor (5) de señales de salida;

- un filtro (4) de radiofrecuencia cuya entrada está conectada a la salida del medidor de inducción magnética, y la salida del filtro está conectada al receptor de señales de salida, sintonizándose el filtro para dejar pasar la señal a la frecuencia escogida;

- un bloque (6) que genera el resultado, cuya entrada está conectada a la salida del receptor de señales de salida.

26. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque el generador (1) de campos magnéticos comprende un generador (7) de corriente alterna (ac) realizado para permitir la preconfiguración del espectro frecuencial de su señal de salida con componentes espectrales a dos frecuencias, y un bloque inductivo (8) conectado a la salida de dicho generador ac, siendo la salida del bloque inductivo (8) la salida del generador de campos magnéticos.

27. Aparato según las reivindicaciones 25 y 26, caracterizado porque dicho bloque inductivo (8) actúa como dicho medidor de inducción magnética.

28. Aparato según la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque dicho bloque inductivo está realizado en forma de una bobina (9) de inducción sin núcleo, estando conectado el primer conductor de la bobina a la salida de dicho generador ac y estando conectado el segundo conductor al chasis.

29. Aparato según la reivindicación 25 y la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque dicho bloque inductivo comprende dos bobinas (9, 10) de inducción sin núcleos, estando conectados, respectivamente, los primeros conductores de dichas bobinas a la primera y la segunda salida de dicho generador ac, estando conectados los segundos conductores de las bobinas (9, 10) al chasis, y, además, estando conectado el primer conductor de una de dichas bobinas a la entrada de dicho filtro de radiofrecuencia.

30. Aparato según la reivindicación 29, caracterizado porque los ejes de dichas bobinas (9, 10) están inclinados uno con respecto a otro.

31. Aparato según la reivindicación 30, caracterizado porque el ángulo entre los ejes de dichas bobinas es 90º.

32. Aparato según la reivindicación 29, caracterizado porque un regulador (11) de fase está insertado entre una de las salidas de dicho generador ac (7) y el primer conductor asociado de una de dichas bobinas, estando provisto, dicho regulador (11) de fase, de una entrada de control para introducir los datos sobre el ángulo que forma el eje de esta bobina con el eje de la otra bobina.

33. Aparato según la reivindicación 25 ó las reivindicaciones 25 y 26, caracterizado porque el medidor de inducción magnética comprende un elemento inductivo sin núcleo, no siendo, dicho elemento, parte de dicho generador de campos magnéticos.

34. Aparato según la reivindicación 25 ó la reivindicación 25 y cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, caracterizado porque el medidor de inducción magnética comprende un elemento sensible magnetorresistivo (magnetoimpedancia).

35. Aparato según la reivindicación 25 ó la reivindicación 25 y 26, caracterizado porque el medidor de inducción magnética comprende un elemento sensible basado en el efecto Hall.

36. Aparato según la reivindicación 25 ó las reivindicaciones 25 y 26, caracterizado porque el medidor de inducción magnética está realizado en forma de una estructura microelectrónica plana.

37. Aparato según la reivindicación 25 ó la reivindicación 25 y cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, caracterizado porque el filtro (4) de radiofrecuencia tiene la propiedad de rechazar la señal de aquella de las frecuencias de dichos componentes espectrales que es la más próxima a dicha frecuencia escogida.

38. Aparato según la reivindicación 25 ó la reivindicación 25 y cualquiera de las reivindicaciones 26 a 37, caracterizado porque el filtro (4) de radiofrecuencia tiene la propiedad de rechazar la señal de aquella de las frecuencias de dichos componentes espectrales que es la más próxima a dicha frecuencia escogida, y, además, el filtro (4) de radiofrecuencia es controlable, estando conectada la entrada de control del filtro (4) de radiofrecuencia a la salida de control de dicho generador ac (7).

39. Aparato según las reivindicaciones 25 y 26 ó las reivindicaciones 25 y 26 y cualquiera de las reivindicaciones 29 a 38, caracterizado porque está insertado un generador (12) de señales de referencia, el cual está conectado a través de su entrada a la salida de dicho generador ac (7), a través de la segunda entrada, de control, a la salida del receptor (5) de señales de salida, y, a través de su salida, a la segunda entrada de dicho filtro (4) de radiofrecuencia, haciéndose que dicho filtro esté sincronizado.

40. Aparato según las reivindicaciones 25 y 26 ó las reivindicaciones 25 y 26 y cualquiera de las reivindicaciones 27 a 38, caracterizado porque está insertado un generador (12) de señales de referencia, estando conectada una salida del generador de señales de referencia, que produce una señal armónica a una frecuencia combinatoria, con la entrada de dicho filtro sincronizado, realizándose este filtro en forma de un multiplicador.

41. Aparato según las reivindicaciones 25 y 26 ó las reivindicaciones 25 y 26 y cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, caracterizado porque está insertado un bloque (13) de control, cuyas primera y segunda salidas están conectadas a las entradas de control de dicho generador ac (7) y dicho filtro (4) de radiofrecuencia, respectivamente, y la entrada está conectada a la salida de control del receptor (5) de señales de salida.

42. Aparato según la reivindicación 39, caracterizado porque el generador de señales de referencia y el receptor de señales de salida están realizados en forma de un procesador (14).

43. Aparato según la reivindicación 39, caracterizado porque el generador (12) de señales de referencia, el receptor (5) de señales de salida, y dicho generador ac (7) se realizan en forma de un procesador (14).

44. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 43, caracterizado porque dicho volumen (2) de sonda consta de varias zonas separadas espacialmente, estando provista, cada una de estas zonas, de unos medios de medición independientes.

45. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 43, caracterizado porque dicho volumen (2) de sonda consta de varias zonas separadas espacialmente y dichos medios de medición están adaptados para posibilitar pruebas sucesivas de dichas zonas.

46. Aparato según una de las reivindicaciones 25 y 26, caracterizado porque el generador ac (7) y el receptor (5) de señales de salida están realizados en forma de un procesador (14).