Unidades de expresión de PEF-TU.

Proceso para aumentar el grado de transcripción de genes en microorganismos del género Corynebacterium encomparación con el tipo silvestre mediante regulación de la transcripción de genes en el microorganismo medianteácidos nucleicos con actividad promotora que contienen

A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.

ID.NO. 1 o

B) una secuencia derivada de esta secuencia mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, quepresenta una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1En cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad promotora.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07123785.

Solicitante: BASF SE.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: 67056 LUDWIGSHAFEN ALEMANIA.

Inventor/es: KROGER, BURKHARD, SCHRODER, HARTWIG, ZELDER, OSKAR, HAEFNER,Stefan, KLOPPROGGE,Corinna.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/34 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Corynebacterium (G).
  • C12N1/21 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/77 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para Corynebacterium; para Brevibacterium.
  • C12P13/08 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
  • C12P13/12 C12P 13/00 […] › Metionina; Cisteína; Cistina.

PDF original: ES-2439946_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Unidades de expresión de PEF-TU

La presente invención se refiere a un método para incrementar la tasa de transcripción y/o tasa de expresión de genes así como a microorganismos genéticamente modificados del género Cor y nebacterium con tasa de transcripción y/o tasa de expresión elevadas así como a un método para producir productos biosintéticos mediante el cultivo de microorganismos genéticamente modificados del género Cor y nebacterium, tal como se define en las reivindicaciones.

Los diversos productos biosintéticos como, por ejemplo, productos químicos finos, tales como, entre otros, aminoácidos, vitaminas pero también proteínas, se producen en las células mediante procesos metabólicos naturales y se usan muchos ramos de la industria, incluida la industria alimenticia, de comida para animales, de cosméticos, y la industria farmacéutica estas sustancias que se denominan conjuntamente productos químicos finos/proteínas comprenden, entre otros, ácidos orgánicos, aminoácidos, tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores así como proteínas y enzimas. Su producción se efectúa de la manera más conveniente a gran escala por medio de cultivo de bacterias que han sido desarrolladas con el fin de producir y excretar grandes cantidades de la sustancia respectivamente deseada. Para este propósito, los organismos particularmente adecuados son bacterias corineiformes, bacterias no patogénicas gram-positivas.

Es conocido que los aminoácidos se producen mediante fermentación de cepas de bacterias corineiformes, principalmente Cor y nebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia permanentemente se trabaja en el mejoramiento de los métodos de producción. Los mejoramientos del proceso pueden referirse a medidas industriales de fermentación como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los nutrientes como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el procesamiento hasta un producto, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico pero también mediante secamiento por aspersión, o las propiedades de desempeño intrínsecas del microorganismo mismo.

Desde hace algunos años se usan igualmente métodos de la técnica de ADN recombinante para mejorar las cepas de Cor y nebacterium que producen químicos finos/proteínas, amplificando genes individuales e investigando el efecto sobre la producción de productos químicos finos/proteínas.

Otras formas para desarrollar un procedimiento para la preparación de productos químicos finos, aminoácidos o proteínas, o para aumentar y/o mejorar la productividad de un procedimiento ya existente para la preparación de productos químicos puros, aminoácidos o proteínas, son aumentar y/o modificar la expresión de uno o más genes, y/o influir sobre la traducción de un ARNm mediante secuencias de polinucleótidos adecuadas. La influencia puede comprender en este contexto el aumento, la disminución, o también otros parámetros de la expresión de genes, como modelos de expresión temporales El experto conoce diferentes componentes de las secuencias de regulación bacterianas. Se diferencian los sitios de unión de los reguladores, también denominados operadores, los sitios de unión de las holoenzimas ARNpolimerasas, también denominadas regiones -35 y -10, y el sitio de unión del 16S-ARN ribosómico, también denominado sitio de unión ribosómico o también secuencia de Shine-Dalgarno.

Como secuencia de un sitio de unión ribosómico, también denominado secuencia de Shine-Dalgarno, en el sentido de esta invención, se entienden secuencias de polinucleótidos que se encuentran hasta 20 bases corriente arriba del codón de iniciación de la traducción.

En la bibliografía (E. coli y S. typhimurium, Neidhardt F.C., 1995, ASM Press) se describe que tanto la composición de la secuencia de polinucleótidos de la secuencia de Shine-Delgarno, el orden de la secuencia de las bases, pero también la distancia de una secuencia de polinucleótidos contenida en la secuencia de Shine-Delgarno tiene una influencia sustancial sobre el grado de iniciación de la traducción Las secuencias de ácidos nucleicos con actividad promotora pueden influir sobre la formación del ARNm de diferente manera. Los promotores, cuya actividad es independiente de la fase de crecimiento fisiológica del organismo, son denominados constitutivos. Por otro lado, otros promotores reaccionan tanto frente a estímulos químicos externos, como físicos, como oxígeno, metabolitos, calor, pH, etc. Otros muestran en diferentes fases de crecimiento una fuerte dependencia de su actividad. Por ejemplo, en la bibliografía se describen promotores que muestran durante la fase de crecimiento exponencial de microorganismos una actividad especialmente marcada, o también exactamente en la fase estacionaria del crecimiento microbiano. Ambas características de los promotores pueden tener una influencia favorable sobre la productividad para una producción de productos químicos finos y proteínas según la vía de metabolismo.

Por ejemplo, los promotores que durante el crecimiento desconectan la expresión de un gen, pero que después de un crecimiento óptimo la conectan, pueden usarse para regular un gen que controla la producción de un metabolito. La cepa modificada presenta entonces los mismos parámetros de crecimiento que la cepa de partida, pero produce más producto por célula. Este tipo de modificación puede aumentar tanto el título (g de producto/litro) como también el rendimiento de C (g de producto/g de fuente C) .

En la especie de Cor y nebacterium pudieron aislarse ya tales secuencias de nucleótidos, las que pueden ser utilizadas para aumentar y/o debilitar la expresión génica. Estos promotores regulados pueden aumentar o disminuir el grado con el cual se transcribe un gen, dependiendo de las condiciones internas y/o externas de la célula. La presencia de un factor determinado, conocido como inductor, puede estimular en parte el grado de la transcripción del promotor. Los inductores pueden influir directa o indirectamente sobre la transcripción del promotor. Otra clase de factores, conocidos como supresores, puede reducir o inhibir la transcripción del promotor. Como los inductores, los supresores también pueden actuar en forma directa o indirecta. Se conocen sin embargo también promotores que pueden ser regulados a través de la temperatura. Así el nivel de la transcripción de tales promotores puede ser aumentado o disminuido, por ejemplo, mediante un aumento de la temperatura de crecimiento por encima de la temperatura de crecimiento normal de la célula.

Hasta ahora se ha descrito una cantidad reducida de promotores de C. glutamicum. El promotor del gen de Malatosintasa de C. glutamicum se describió en la DE 4440118. Este promotor se colocó delante de un gen estructural que codifica para una proteína. Después de la transformación de un constructo como éste en una bacteria corineiforme se regula la expresión del gen estructural colocado detrás del promotor. La expresión del gen estructural se induce tan pronto como se agrega al medio un inductor correspondiente.

Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999) describieron una fusión transcripcional entre el promotor pta-ack de C. glutamicum y un gen indicador (cloranfenicol acetiltransferasa) . Las células de C. glutamicum, que contienen una fusión transcripcional como ésta, presentaban una expresión aumentada del gen indicador al crecer en un medio que contenía acetato. En comparación, las células transformadas, que crecían sobre glucosa, no mostraron una expresión aumentada de este gen indicador.

En Pa’tek et al., Microbiology 142:1297 (1996) se describieron algunas secuencias de ADN de c. glutamicum, que pueden reforzar la expresión de un gen indicador en células de C. glutamicum. Estas secuencias se compararon entre sí, para definir secuencias de consenso para promotores de C. glutamicum.

Otras secuencias de ADNA de C. glutamicum, que pueden usarse para la regulación de la expresión génica, se describieron en la patente WO 02/40679. Estos polinucleótidos aislados representan unidades de expresión de Cor y nebacterium glutamicum, las que pueden ser usadas para el aumento o para la disminución de una expresión génica. Además, se describen en esta patente plásmidos recombinantes, sobre los cuales se asocian las unidades de expresión de Cor y nebacterium glutamicum con genes heterólogos. El método aquí descrito, la fusión de un promotor de Cor y nebacterium glutamicum con un gen heterólogo, puede ser usado, entre otros, para la regulación del gen de la biosíntesis... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proceso para aumentar el grado de transcripción de genes en microorganismos del género Cor y nebacterium en comparación con el tipo silvestre mediante regulación de la transcripción de genes en el microorganismo mediante ácidos nucleicos con actividad promotora que contienen

A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o B) una secuencia derivada de esta secuencia mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, que presenta una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1

En cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad promotora.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo mediante los ácidos nucleicos con actividad promotora se logra

b1) introduciendo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad promotora de acuerdo con la reivindicación 1 al genoma del microorganismo, de modo que la transcripción de uno o de varios genes endógenos se efectúe bajo el control de los ácidos nucleicos con actividad promotora introducidos o b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo, de modo que la transcripción de uno o de varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad promotora de acuerdo con la reivindicación 1 o b3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácidos nucleicos que contienen un ácido nucleico con actividad promotora de acuerdo con la reivindicación 1 y une funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.

3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque los genes se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo caso los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.

4. Proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque las proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se selecciona del grupo de aspartatoquinasa, aspartato-semialdehído-deshidrogenasa, diaminopimelatodeshidrogenasa, diaminopimelatodescarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinaldehído-3-fosfatodeshidrogenasa, 3-fosfoglicerato-quinasa, piruvato-carboxilasa, triosafosfato-isomerasa, regulador transcripcional LuxR, regulador transcripcional LysR1, regulador transcripcional LysR2, malatoquinonaoxidorreductasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serinahidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metileno-tetrahidrofolato-reductasa, fosfoserinaaminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserinadeshidrogenasa, homoserinadeshidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, treonina-exportador-transportador, treonina-deshidratasa, piruvatooxidasa, lisina-exportador, biotina-ligasa, cisteína-sintasa I, cisteína-sintasa II, metionina-sintasa dependiente de la coenzima B12, metionina-sintasa independiente de la coenzima B12, sulfatoadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginil-t-ARN-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinahidroximetiltransferasa, fructosa-1, 6-bisfosfatasa, proteína de la sulfato-reducción RXA077, proteína de la sulfato-reducción RXA248, proteína de la sulfato-reducción RXA247 , proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6-fosfofructoquinasa.

5. Microorganismo genéticamente modificado del género Cor y nebacterium, en cuyo caso la modificación genética conduce a un aumento del grado de transcripción de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre y está condicionada por la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo mediante ácidos nucleicos con actividad promotora, que contienen

A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o B) una secuencia derivada de esta secuencia mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, que presenta una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1

en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad promotora.

6. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 5, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo se logra mediante ácidos nucleicos con actividad promotora b1) introduciendo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad promotora de acuerdo con la reivindicación 5 al genoma del microorganismo, de modo que la transcripción de uno o de varios genes endógenos se efectúe bajo el control de los de los ácidos nucleicos con actividad promotora introducidos o b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo, de modo que la transcripción de uno o de varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad promotora de acuerdo con la reivindicación 5, o b3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácidos nucleicos que contienen un ácido nucleico con actividad promotora de acuerdo con la reivindicación 5 y une funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.

7. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque los genes se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo caso los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.

8. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 7, caracterizado porque las proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se selecciona del grupo de aspartatoquinasa, aspartato-semialdehídodeshidrogenasa, diaminopimelato-deshidrogenasa, diaminopimelatodescarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinaldehído-3-fosfatodeshidrogenasa, 3-fosfoglicerato-quinasa, piruvatocarboxilasa, triosafosfato-isomerasa, regulador transcripcional LuxR, regulador transcripcional LysR1, regulador transcripcional LysR2, malato-quinonaoxidorreductasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, 6-fosfogluconatodeshidrogenasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metileno-tetrahidrofolatoreductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserinadeshidrogenasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, treoninaexportador-transportador, treonina-deshidratasa, piruvatooxidasa, lisina-exportador, biotina-ligasa, cisteína-sintasa I, cisteína-sintasa II, metionina-sintasa dependiente de la coenzima B12, metionina-sintasa independiente de la coenzima B12, sulfatoadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfitoreductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginil-t-ARN-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinahidroximetiltransferasa, fructosa-1, 6-bisfosfatasa, proteína de la sulfato-reducción RXA077, proteína de la sulfato-reducción RXA248, proteína de la sulfato-reducción RXA247 , proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6fosfofructoquinasa.


 

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