Superficies de unión para ensayos de afinidad.

Una superficie de unión insaturada en forma de micropartículas para un ensayo de afinidad que comprende:

a) un soporte de micropartículas;

b) acoplado covalentemente a una superficie del soporte, comprendiendo al menos un acoplador a soporte una proteína,

en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en albúmina de suero bovino

(BSA), ovoalbúmina, un fragmento de BSA, un fragmento de ovoalbúmina o mezclas de los mismos;

c) un ligando acoplado a la proteína,

en donde el ligando está presente a una densidad de 2x10-2 a 2x10-1 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte,

además, en donde el ligando es biotina y en donde la biotina está presente en una proporción molar de biotina respecto a proteína inferior o igual a 5:1; y

d) un copolímero en bloque en contacto con la superficie del soporte de ensayo, en donde la molécula de copolímero en bloque comprende un grupo de cabeza hidrófobo flanqueado por al menos dos grupos de cola hidrófilos, y en donde el grupo de cabeza hidrófobo está en contacto con el soporte en forma de micropartículas.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/023033.

Solicitante: BECKMAN COULTER, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 250 S. KRAEMER BOULEVARD BREA, CA 92821 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: SOLDO,JOSHUA C, SACKRISON,JAMES L.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA,... > B01L99/00 (Materia no prevista en otros grupos de esta subclase)

PDF original: ES-2537564_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Superficies de unión para ensayos de afinidad Campo de la invención La presente invención se refiere a soportes que tienen superficies de unión que están insaturadas o insaturadas y orientadas, incluidos soportes que tienen superficies de unión que contienen ligandos para usar en ensayos de afinidad. Aspectos particulares de la invención se refieren a superficies de unión que contienen biotina o biotina y un conector de ligando específico de biotina, tal como estreptavidina (SA) . Se proporcionan superficies de unión para inmunoensayos, que incluyen superficies de unión que contienen antígenos o anticuerpos, o fragmentos de los mismos. Otras realizaciones de la presente invención se refieren a superficies de soporte sólido bloqueadas y micropartículas dispersadas. Se proporcionan métodos para preparar y utilizar tales soportes.

Antecedentes de la invención Se utilizan superficies de unión en una amplia variedad de aplicaciones que incluyen, por ejemplo, ensayos de afinidad. Las superficies de unión convencionales normalmente se preparan maximizando la cantidad de conectores de ligando por unidad de área superficial de la superficie de soporte en fase sólida. Aunque el método convencional proporciona una superficie de soporte con una elevada cantidad de conectores de ligando, maximizar únicamente el número de conectores de ligando sobre la superficie de soporte no siempre mejora el rendimiento de la superficie de unión. Algunas superficies de unión convencionales utilizadas en ensayos de afinidad maximizan la capacidad de unión depositando directamente un conector de ligando tal como un anticuerpo, o un conector de ligando específico de biotina tal como SA, sobre una fase sólida y bloqueando la fase sólida con albúmina de suero bovino (BSA) u ovoalbúmina. A pesar de que esto maximiza la capacidad de unión a antígeno o biotina de la superficie de unión, los respectivos anticuerpos o conectores de ligando específicos de biotina se acumulan sobre la superficie de unión sin una orientación específica, y las estrategias de bloqueo tradicionales no evitan ni atenúan necesariamente el desprendimiento de la superficie de unión de los anticuerpos o los conectores de ligando específicos de biotina. Además, el desprendimiento puede dar lugar a una baja sensibilidad del ensayo (relación señal-ruido por debajo del nivel óptimo) , exactitud, precisión, estabilidad o factibilidad de producción, o combinaciones de las mismas. La acumulación y la orientación aleatoria en la superficie de unión puede disminuir la eficacia o capacidad de unión de la superficie de unión debido a impedimentos estéricos. En consecuencia, se necesitan superficies de unión y composiciones y métodos mejorados para preparar superficies de unión mejoradas que no dependan simplemente de maximizar la densidad de conectores de ligando sobre la superficie de unión.

El documento US-2004/0072262 se refiere a métodos y sistemas para detectar péptidos de unión MHC de clase 1.

El documento WO 2005/010026 se refiere a métodos para detectar la activación de células T mediante péptidos de unión MHC.

El documento US-6.638.728 se refiere a superficies recubiertas con una elevada capacidad de captar moléculas diana.

El documento DE-197 24 787 se refiere a superficies recubiertas con estreptavidina.

El documento US-4.480.042 se refiere a reactivos en forma de partícula con un índice de refracción elevado y con enlace covalente y su uso en inmunoensayos de dispersión de luz.

El documento US-5.728.588 se refiere al recubrimiento de superficies hidrófobas para volverlas resistentes a proteínas y permitir, simultáneamente, el anclaje covalente de ligandos específicos.

El documento EP-1.650.565 se refiere a la inhibición de la adsorción no específica de la superficie del material base.

Sumario de la invención La presente invención proporciona:

(1) Una superficie de unión insaturada en forma de micropartículas para un ensayo de afinidad, que consta de:

a) un soporte en forma de micropartícula;

b) acoplado covalentemente a una superficie del soporte, comprendiendo al menos un acoplador a soporte una proteína, donde la proteína se selecciona del grupo compuesto por albúmina de suero bovino (BSA) , ovoalbúmina, un fragmento de BSA, un fragmento de ovoalbúmina o mezclas de ellos;

c) un ligando acoplado a la proteína,

donde el ligando está presente a una densidad de 2x10-2 hasta 2x10-1 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte, además, donde el ligando es biotina y donde la biotina está presente en una proporción molar de biotina respecto a proteína inferior o igual a 5:1; y d) un copolímero en bloque en contacto con la superficie del soporte de ensayo, en donde la molécula del copolímero en bloque consta de un grupo de cabeza hidrófobo flanqueado por al menos dos grupos de cola hidrófilos, y donde el grupo de cabeza hidrófobo está en contacto con el soporte en forma de micropartícula.

(2) La superficie de unión en forma de micropartículas de (1) en donde el ligando está presente a una densidad de 15 (a) de 1, 9x10-2 a 1, 6x10-1 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte,

(b) de 1, 9x10-2 a 6, 6x10-2 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte, o

(c) de 1, 6x10-2 a 6, 6x10-2 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte.

(3) La superficie de unión en forma de micropartículas de (1) en donde, en el copolímero en bloque, la longitud de las dos o más colas hidrófilas puede ser independientemente entre sí de 2 hasta 2, 5 veces la longitud del grupo de cabeza hidrófobo.

(4) La superficie de unión en forma de micropartículas de (1) en donde el soporte de ensayo en forma de micropartículas consta de un polímero o copolímero orgánico que es hidrófobo.

(5) La superficie de unión en forma de micropartículas de (1) en donde el soporte en forma de micropartículas consta de un material paramagnético o superparamagnético.

(6) La superficie de unión en forma de micropartículas de (1) en donde la proteína es BSA y el ligando es biotina, donde además

la biotina está presente a una densidad de 1, 9x10-2 hasta 6, 6x10-2 micromoles de biotina por metro cuadrado de 35 soporte, y la BSA está presente a una densidad de 1, 6x10-2 a 2, 9x10-2 micromoles de BSA por metro cuadrado de soporte.

(7) La superficie de unión en forma de micropartículas de (3) que contiene además un conector de ligando que es al menos bivalente que está acoplado con la biotina.

(8) La superficie de unión en forma de micropartículas de (7) en donde el conector de ligando se selecciona del grupo consistente en avidina, estreptavidina (SA) , neutravidina, un fragmento de SA, un fragmento de avidina, un fragmento de neutravidina, o mezclas de los mismos, preferiblemente en donde el conector de ligando es estreptavidina.

(9) La superficie de unión en forma de micropartículas de (7) que contiene además un resto de captura asociado con el conector de ligando.

(10) La superficie de unión en forma de micropartículas de (9) en donde el resto de captura está biotinilado.

(11) La superficie de unión en forma de micropartículas de (3) en donde las moléculas del copolímero en bloque constan cada una de un polímero donde el grupo de cabeza hidrófobo es un bloque de óxido de polipropileno y los grupos de cola hidrófilos son cada uno bloques de óxido de polietileno.

(12) Una dispersión en una solución acuosa de una multitud de micropartículas de (3) y un copolímero en bloque que tiene un grupo de cabeza hidrófobo flanqueado por al menos dos grupos de cola hidrófilos.

(13) La dispersión de micropartículas de (12) en donde el soporte de ensayo en forma de micropartículas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una superficie de unión insaturada en forma de micropartículas para un ensayo de afinidad que comprende:

a) un soporte de micropartículas;

b) acoplado covalentemente a una superficie del soporte, comprendiendo al menos un acoplador a soporte una proteína, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en albúmina de suero bovino (BSA) , ovoalbúmina, un fragmento de BSA, un fragmento de ovoalbúmina o mezclas de los mismos;

c) un ligando acoplado a la proteína, en donde el ligando está presente a una densidad de 2x10-2 a 2x10-1 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte, además, en donde el ligando es biotina y en donde la biotina está presente en una proporción molar de biotina respecto a proteína inferior o igual a 5:1; y d) un copolímero en bloque en contacto con la superficie del soporte de ensayo, en donde la molécula de copolímero en bloque comprende un grupo de cabeza hidrófobo flanqueado por al menos dos grupos de cola hidrófilos, y en donde el grupo de cabeza hidrófobo está en contacto con el soporte en forma de micropartículas.

2. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 1 en donde el ligando está presente a una densidad de

(a) 1, 9x10-2 a 1, 6x10-1 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte,

(b) 1, 9x10-2 a 6, 6x10-2 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte, o

(c) 1, 6x10-2 a 6, 6x10-2 micromoles de ligando por metro cuadrado de soporte.

3. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 1 en donde, en el copolímero en bloque, la longitud de las dos o más colas hidrófílas puede ser cada una independientemente de 2 a 2, 5 veces la longitud del grupo de cabeza hidrófobo.

4. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 1 en donde el soporte de ensayo en forma de micropartículas comprende un polímero o copolímero orgánico que es hidrófobo.

5. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 1 en donde el soporte en forma de micropartículas comprende un material paramagnético o superparamagnético.

6. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 1 en donde la proteína es BSA y el ligando es biotina, en donde además

la biotina está presente a una densidad de 1, 9x10-2 a 6, 6x10-2 micromoles de biotina por metro cuadrado de soporte, y la BSA está presente a una densidad de 1, 6x10-2 a 2, 9x10-2 micromoles de BSA por metro cuadrado de soporte.

7. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 3 que comprende además un conector de ligando que es al menos bivalente que está acoplado con la biotina. 55

8. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 7 en donde el conector de ligando se selecciona del grupo que consiste en avidina, estreptavidina (SA) , neutravidina, un fragmento de SA, un fragmento de avidina, un fragmento de neutravidina o mezclas de los mismos, preferiblemente en donde el conector de ligando es estreptavidina.

9. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 7 que comprende además un resto de captura asociado con el conector de ligando.

10. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 9 en donde el resto de captura está 65 biotinilado.

11. La superficie de unión en forma de micropartículas de la reivindicación 3 en donde las moléculas del copolímero en bloque comprenden cada una un polímero en donde el grupo de cabeza hidrófobo es un bloque de óxido de polipropileno y los grupos de cola hidrófilos son cada uno bloques de óxido de polietileno.

12. Una dispersión en una solución acuosa de una pluralidad de las micropartículas de la reivindicación 3 y un copolímero en bloque que tiene un grupo de cabeza hidrófobo flanqueado por al menos dos grupos de cola hidrófilos.

13. La dispersión de micropartículas de la reivindicación 12 en donde el soporte de ensayo en forma de micropartículas comprende un polímero o copolímero orgánico que es hidrófobo.

14. La dispersión de micropartículas de la reivindicación 12 en donde el soporte en forma de micropartículas comprende un material paramagnético o superparamagnético. 15

15. La dispersión de micropartículas de la reivindicación 12 en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en BSA, ovoalbúmina, un fragmento de BSA, un fragmento de ovoalbúmina, o mezclas de los mismos.

16. La dispersión de micropartículas de la reivindicación 12 que comprende además un conector de ligando que es 20 al menos bivalente que está acoplado con la biotina.

17. La dispersión de micropartículas de la reivindicación 16 en donde el conector de ligando se selecciona del grupo que consiste en avidina, SA, neutravidina, un fragmento de SA, un fragmento de avidina, un fragmento de neutravidina, o mezclas de los mismos, preferiblemente en donde el conector de ligando es estreptavidina.

18. La dispersión de micropartículas de la reivindicación 12 que comprende además un resto de captura asociado con el conector de ligando.

19. La dispersión de micropartículas de la reivindicación 18 en donde el resto de captura está biotinilado.