Procedimientos de identificación de inhibidores del sistema de secreción de tipo III.

Un procedimiento para determinar si un compuesto de ensayo tiene la capacidad de inhibir la función del sistema de secreción de tipo 3 T3SS,

en el que un compuesto de ensayo se pone en contacto con células bacterianas que tiene un T3SS, y se ensaya:

a. en una primera etapa, su capacidad para inhibir la secreción de una proteína efectora en dichas células bacterianas determinando la cantidad de una proteína efectora secretada debido a su unión a su molécula de chaperona cognada, en el que una cantidad reducida de proteína efectora unida a dicha chaperona, comparada con la cantidad en una muestra control procedente de células que no han sido tratadas con dicho compuesto de ensayo, es indicativa de un efecto inhibidor de dicho compuesto sobre la secreción de dicha proteína efectora, y

b. en una segunda etapa, su capacidad para inhibir el ensamblaje de los componentes estructurales para formar el complejo de la aguja de T3SS.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/054379.

Solicitante: IMBA-INSTITUT FÜR MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE GMBH.

Nacionalidad solicitante: Austria.

Dirección: Dr. Bohrgasse 3 1030 Wien AUSTRIA.

Inventor/es: MARLOVITS,THOMAS C, RADICS,JULIA, SCHMIED,WOLFGANG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/18 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › Investigación o análisis de la actividad antimicrobiana de un material.

PDF original: ES-2526316_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimientos de identificación de inhibidores del sistema de secreción de tipo III

La presente invención se refiere a procedimientos de identificación de agentes antibacterianos que se dirigen al sistema de secreción de tipo III (T3SS).

Aunque los antibióticos se encuentran entre los fármacos más eficaces, están asociados con graves problemas, por ejemplo, su falta de especificidad por las bacterias patógenas, afectando asi a la flora bacteriana normal, lo cual provoca la aparición de bacterias resistentes. En la búsqueda de fármacos antlbacterlanos alternativos, el T3SS ha surgido como una diana terapéutica prometedora para el desarrollo de nuevos productos terapéuticos, debido a que es un mecanismo clave de la virulencia que está muy conservado y es absolutamente necesario para la virulencia de muchos patógenos bacterianos Gram-negativos, lo cual hace que el T3SS sea una diana atractiva.

Los sistemas de secreción de tipo III son máquinas moleculares que son fundamentales para la virulencia de importantes patógenos bacterianos, ya que transportan las toxinas bacterianas ("efectores" o "proteínas efectoras") hacia las células hospedantes, que incluyen Salmonella entérica, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella enteritica, todas las demás especies de Salmonella, Shigella spp. (que incluye S. Ilexneri y S. dysenteriae), Yersinia spp. (Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica), cepas enteropatógenas de E. coli (EPECJ, E. coli enterohemorrágica (EHEC), Vibrio cholerae, Hafnia alvei, Bordetella sp. y especies de Chlamydia. Además, la vía de secreción conservada es necesaria para provocar la enfermedad en patógenos animales, tales como E. coli de conejo (RDEC-1), y Citrobacter rodentiii. También es crítica para la producción de la enfermedad en varios patógenos vegetales importantes. Varios patógenos Gram-negativos que provocan daños importantes desde el punto de vista económico en cultivos vegetales utilizan el sistema de secreción de tipo III, al igual que los patógenos humanos. Los patógenos vegetales incluyen Pseudomonas syringe, P. solanacearum, y Xanthamonas campestris.

Los efectores secretados tienen la capacidad de modular diversas funciones de la célula eucarlota, que puede ser una célula de mamífero o una célula vegetal, que incluyen la dinámica del citoesqueleto, el tráfico de vesículas, el avance del ciclo celular y la transcripción. Una infección provoca síntomas clínicos que varían de cefaleas suaves y diarrea a enfermedades que pueden ser mortales, tales como la fiebre tifoidea o la peste bubónica. En el centro del T3SS se encuentra el complejo de la aguja, que está Incrustado dentro de la membrana bacteriana interna y externa, abarca el espacio periplásmico y se extiende hacia el entorno extracelular con un filamento similar a una aguja. El complejo de la aguja con forma cilindrica ("inyectisoma") está compuesto por proteínas estructurales que forman una base de múltiples anillos asociada con la envuelta bacteriana, y una extensión similar a una aguja que sobresale varios nanómetros desde la superficie bacteriana. La aguja está anclada a la base a través de otra subestructura, la varilla interna, que junto con el filamento de la aguja forma un canal que actúa como conducto para las proteínas efectoras que viajan a través de esta vía de secreción (Marlovits et al., 24, Science, 36, 14-142). El ensamblaje del complejo de la aguja se produce en etapas discretas que primero conducen al ensamblaje de la subestructura de la base.

El ensamblaje y el funcionamiento del Inyectisoma implica a pequeñas chaperonas (12-18 kDa) que permanecen en el citosol bacteriano (véase, por ejemplo, Ghosh, 24, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 68:771-795). Aunque algunas de estas chaperonas están implicadas en el ensamblaje del inyectisoma (clase III) o el poro de translocación (clase II), otras están subordinadas a los efectores. Este último grupo de chaperonas se clasifica como chaperonas de clase I (Letzelter et al., 26, The EMBO Journal (26), 25, 3223-3233), y también se denomina "chaperonas de clase 1A". Estas chaperonas habitualmente se unen a un efector, y la mayoría son codificadas por genes localizados adyacentes al gen que codifica los efectores cognados. Son proteínas ácldas (pl: 4-5), habltualmente diméricas, que se unen a su efector cognado en sus primeros 1 aminoácidos, justo cadena abajo de la señal de secreción N-terminal corta. A menudo, pero no siempre, son codificadas al lado del gen que codifica su proteína efectora compañera. Aunque su similitud de secuencia es baja, su estructura está bastante bien conservada. Antes de su translocación hacia las células hospedantes, las chaperonas son retiradas de sus efectores por la ATPasa que es parte del inyectisoma (Akeda y Galan, 25, Nature, 437:911-915).

Los procedimientos indicados de identificación de inhibidores de T3SS principalmente se centran en la secreción de las proteínas efectoras y se basan en sistemas indicadores: el documento W29/145829 describe un procedimiento de selección de alta capacidad de procesamiento basado en una proteína indicadora recombinante (P-lactamasa), cuya secreción depende del sistema de secreción de proteínas de tipo III, en el que un cambio en la cantidad de proteína indicadora que se segrega hacia fuera de la célula hospedante bacteriana recomblnante es indicativo de un efecto inhibidor o activador de un compuesto de ensayo sobre el T3SS.

El documento WO29/137133 describe un procedimiento que comprende, como una etapa de selección primaria, un ensayo indicador similar, en el que el compuesto se ensaya para la inhibición de la secreción, y tras esta

selección primaria se realizan ensayos secundarios para eliminar los inhibidores no específicos. En el ensayo secundario, el compuesto se ensaya para la regulación transcripcional de una proteína de T3SS y/o la expresión de un compoenente estructural del T3SS.

El procedimiento de selección para identificar compuestos que afectan a la secreción de tipo III se describe en el documento W29/61491, que implica ensayar para moléculas Inhibidoras que afectan a la denominada "respuesta de calcio bajo" en bacterias que tienen un sistema de secreción de tipo III. El ensayo de selección primarlo se basa en la medición del crecimiento bacteriano, opcionalmente empleando un sistema indicador. Un ensayo de confirmación secundario mide el efecto de un compuesto de ensayo sobre el nivel de las proteínas segregadas, es decir, las proteínas efectoras, que, en el caso de Yersinia, se conocen como YOP (proteínas externas de Yersinia).

Gauthler et al., Antlmicrobial Agents and Chemotherapy, octubre 25, 411-419, describen un ensayo de alta capacidad de procesamiento basado en ELISA para controlar el efecto de compuestos de ensayo sobre la proteína efectora EspB de Escherichia coli enteropatógena (EPEC), un patógeno humano responsable de brotes de diarrea.

Veenendal et al., J. Bact., 191(2), 29:563-57, se refiere a salicilidenacilhldrazldas como Inhibidores potenciales del complejo de la aguja de T3SS y a métodos para detectar complejos de la aguja de diferentes longitudes.

Sanl et al., Blochem. Bioph. Acta, 177(2), 27:37-311 describen características de densidad en la punta del complejo de la aguja debido a entrecruzamientos.

Un objeto de la presente invención es proporcionar nuevos procedimientos para determinar si un compuesto de ensayo afecta a la función del T3SS y, con ello, a la virulencia de una bacteria que depende del T3SS. En particular, los nuevos procedimientos deberían proporcionar un ensayo muy sensible para Identificar compuestos que son muy específicos, ya que afectan a la función del complejo de la aguja, es decir, Interfieren con el ensamblaje de sus componentes estruturales.

Así, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar si un compuesto de ensayo tiene la capacidad de inhibir la función del sistema de secreción de tipo 3 T3SS, en el que un compuesto de ensayo se pone en contacto con células bacterianas que tiene un T3SS, y se ensaya:

a. en una primera etapa, su capacidad para Inhibir la secreción de una proteína efectora en dichas células bacterianas determinando la cantidad de una proteína efectora secretada debido a su unión a su molécula de chaperona cognada, en el que una cantidad reducida de proteína efectora unida a dicha chaperona, comparada con la cantidad en una muestra control procedente de células que no han sido tratadas con dicho compuesto de ensayo, es indicativa de un efecto inhibidor de dicho compuesto sobre la secreción de dicha proteína efectora, y

b. en una segunda etapa, su capacidad para Inhibir el ensamblaje de los componentes estructurales para formar... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.- Un procedimiento para determinar si un compuesto de ensayo tiene la capacidad de inhibir la función del sistema de secreción de tipo 3 T3SS, en el que un compuesto de ensayo se pone en contacto con células bacterianas que tiene un T3SS, y se ensaya:

a. en una primera etapa, su capacidad para inhibir la secreción de una proteína efectora en dichas células bacterianas determinando la cantidad de una proteína efectora secretada debido a su unión a su molécula de chaperona cognada, en el que una cantidad reducida de proteína efectora unida a dicha chaperona, comparada con la cantidad en una muestra control procedente de células que no han sido tratadas con dicho compuesto de ensayo, es indicativa de un efecto inhibidor de dicho compuesto sobre la secreción de dicha proteína efectora, y

b. en una segunda etapa, su capacidad para inhibir el ensamblaje de los componentes estructurales para formar el complejo de la aguja de T3SS.

2- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el efector se selecciona de SptP y SipA-Flag, y la chaperona se selecciona de SicP e InvB, respectivamente.

3.- El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la cantidad de proteína efectora o translocadora secretada se determina mediante un ELISA.

4.- El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el ELISA se convierte en un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado, y se ensaya en el formato de alta capacidad de procesamiento.

5.- Un procedimiento para controlar el ensamblaje de los componentes estructurales para formar el complejo de la aguja de T3SS, en el que el ensamblaje del complejo de la aguja se determina detectando un componente estructural unido por láser [x] cuando está asociado con un componente estructural preexistente [x-1], o con un complejo preformado que contiene el componente [x-1], respectivamente.

6.- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en dicha segunda etapa, el ensamblaje del complejo de el agua se determina detectando un componente estructural unido por láser [x] cuando está asociado con un componente estructural preexistente [x-1], o con un complejo preformado que contiene el componente [x-1], respectivamente.

7.- El procedimiento de la reivindicación 5 o 6, en el que la unión del componente [x-1] al componente [x] se determina mediante un ELISA, en el que el componente [x-1] o un complejo que lo contenga se conjuga sobre un soporte sólido, y el componente [x] se detecta cuando está unido a [x-1].

8.- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que Prgl de Salmonella typhimurium, o uno de sus homólogos procedente de otra bacteria Gram-negativa, es el componente [x], y en el que PrgH de Salmonella typhimurium, o uno de sus homólogos procedente de otra bacteria Gram-negativa, es el componente [x-

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