Procedimientos y composiciones para cianobacterias productoras de etanol.

La presente invención se refiere a procedimientos y sistemas para la producción de etanol mediante cianobacterias. Más específicamente, los procedimientos se pueden usar para producir etanol usando cianobacterias genéticamente modificadas que responden a la luz

Procedimientos y composiciones para cianobacterias productoras de etanol.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica las ventajas de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/758.683, presentada el 13 de enero de 2006, cuya descripción se incorpora como referencia en su totalidad.

Antecedentes de la invención

La sociedad y la industria aceptan rápidamente el desarrollo de energías renovables para cumplir los objetivos de aumento de energía y de reducción de emisiones. Desde la revolución industrial, la economía mundial se ha basado en gran medida en combustibles fósiles como fuentes de energía. La dependencia de estas fuentes de energía ha creado varios problemas que suponen un reto, tales como la reducción del suministro de recursos de combustibles fósiles, la contaminación ambiental y el efecto de calentamiento global consiguiente. Una alternativa a los combustibles fósiles es el etanol. Actualmente, la producción mundial de etanol a partir de cultivos de azúcar es del 60%, a partir de otros cultivos es del 33% y a partir de síntesis química es del 7%. Los procesos de producción de etanol a partir de biomasa tradicionales requieren grandes cantidades de tierras arables y la necesidad de aportar energía para el crecimiento de la materia prima. Además, los procedimientos de fermentación tradicionales liberan cantidades considerables de CO₂ como subproducto del proceso de fermentación. Por ejemplo, una planta de etanol de biomasa de 40 MMGY (millones de galones por año) puede liberar 121.000 toneladas de CO₂ cada año al medio ambiente (BBI, 2003). Este gas invernadero empeorará el efecto de calentamiento global.

El bioetanol ha entrado recientemente en la vanguardia de la tecnología de combustibles renovables. Proporciona una alternativa viable a los combustibles basados en petróleo, ofreciendo un control tanto sobre los procesos de producción como sobre los procesos de consumo. Además, el etanol derivado de sistemas biológicos es particularmente atractivo porque puede integrarse fácilmente en numerosas infraestructuras existentes; considerando tanto la industria de producción como la industria de combustibles. Se han investigado diversos procedimientos para la producción de etanol por organismos vivos. La producción de etanol por microorganismos, en gran parte, se ha investigado usando la levadura Saccharomices cerevisiae y la bacteria etanogénica obligada Zymomonas mobilis. Estos dos microorganismos contienen la información genética para producir las enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh), que se usan para producir etanol a partir de piruvato, un producto de la ruta glicolítica. Woods y col. (Patentes de Estados Unidos Nº 6.306.639 y 6.699.696; véase también Deng y Coleman, "Ethanol Synthesis by Genetic Engineering in Cyanobacteria" Applied and Environmental Microbiology (1999) 65(2): 523-428) describen una bacteria modificada genéticamente útil para la producción de etanol. Woods y col. hablan de un nivel de producción de etanol de 5 mM después de 30 días de cultivo.

Por lo tanto, es deseable encontrar un sistema biológico sencillo, eficaz y barato para producir cantidades sustanciales de la invención.

Descripción de la invención

Las tecnologías mencionadas anteriormente tienen varios defectos. Por ejemplo, los sistemas descritos por Woods y col. tienen el inconveniente de bajos niveles de producción de etanol, largos tiempos de fermentación e inestabilidad.

En algunas realizaciones, lo que se necesita es un sistema sencillo, eficaz y barato para producir cantidades sustanciales de etanol. La presente invención se refiere a procedimientos, composiciones, células huésped y vectores para la optimización de la producción de etanol y tolerancia de una célula huésped a concentraciones de etanol económicamente relevantes.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se describe una construcción de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico comprende: un promotor con respuesta a la luz, una secuencia que codifica una enzima piruvato descarboxilasa (pdc) y una secuencia que codifica una enzima alcohol deshidrogenasa (adh).

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención se describe un vector de expresión. El vector de expresión comprende un ácido nucleico que comprende un promotor con respuesta a la luz, una secuencia que codifica una enzima piruvato descarboxilasa (pdc) y una secuencia que codifica una enzima alcohol deshidrogenasa (adh).

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención se describe una célula huésped. La célula huésped comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende un promotor con respuesta a la luz, una secuencia que codifica una enzima piruvato descarboxilasa (pdc) y una secuencia que codifica una enzima alcohol deshidrogenasa (adh).

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se describe una cianobacteria obtenida por ingeniería genética. La cianobacteria comprende una construcción que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh), donde la cianobacteria es capaz de producir etanol en cantidades recuperables mayores de aproximadamente una concentración 10 mM de etanol después de una fermentación de 5 días.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se describe un procedimiento para producir etanol. El procedimiento comprende: cultivar en un medio de cultivo cianobacterias, conteniendo las cianobacterias una construcción que comprende fragmentos de ADN que codifican enzimas pdc y adh obtenidas a partir del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis; y acumular etanol en el medio de cultivo en una cantidad mayor de aproximadamente una concentración 10 mM de etanol después de una fermentación de 5 días.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra el mapa de las construcciones plasmídicas (a) pPSBAIIKS y (b) pLOI295 usadas para crear pMota.

La Fig. 2 muestra la concentración de etanol frente al tiempo en el Reactor BIOFLO®. La concentración de etanol llegó a un valor de 13 mM después de cinco días de fermentación. El control es Synechocystis no transformado (de tipo silvestre).

Aunque a continuación se describirá la materia objeto de esta solicitud con detalle haciendo referencia a las figuras, esto se hace en relación con las realizaciones ilustrativas. Se entiende que pueden realizarse cambios y modificaciones en las realizaciones descritas sin apartarse del verdadero alcance y espíritu de la presente invención como se define, en parte, por las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención se describen secuencias de ácido nucleico, vectores, células huésped y procedimientos para la producción de altos niveles de etanol por cianobacterias.

La producción de etanol a partir de cianobacterias usando luz solar, CO₂ y nutrientes inorgánicos (posiblemente obtenidos a partir de una corriente de agua residual) es una forma atractiva para obtener un combustible renovable. Por medio de la combinación de la ruta de fijación de carbono y de generación de etanol en un solo organismo, se evitan los costes asociados con el cultivo/recolección/procesamiento de las plantas, se reduce el aporte de energía total y se incrementa el aumento neto de energía. A diferencia de lo que ocurre con los procesos de producción de etanol a partir de biomasa, los procedimientos descritos utilizarán directamente grandes cantidades de CO₂ como fuente de carbono para la producción de combustible y de esta manera ayudarán a reducir este gas invernadero de la atmósfera.

Hay numerosas ventajas en la producción de etanol usando microorganismos fotosintéticos tales como Synechocystis, incluyendo: oportunidades económicas para la producción de biocombustible, impactos positivos para el medio ambiente, reducción en el calentamiento global y mejora de la seguridad alimentaria. Los presentes procedimientos para producir etanol a partir de energía solar y CO₂ usando cianobacterias ofrecen ahorros significativos tanto en el coste de capital como en el coste de operación, en comparación con las instalaciones...

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende: un promotor de respuesta a luz, una secuencia que codifica una enzima piruvato decarboxilasa (pdc), y una secuencia que codifica una enzima alcohol deshidrogenasa (adh).

2. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que el promotor de respuesta a luz es el promotor psbAII.

3. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que las secuencias que codifican una enzima pcd y una enzima adh se obtienen del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis.

4. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc se obtiene de Zymobacter palmae.

5. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc se obtiene de Zymobacter palmae y la secuencia que codifica una enzima adh se obtiene de Zymomonas mobilis.

6. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima adh se obtiene del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis.

7. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc comprende SEQ. ID Nº.: 3 o una secuencia génica que codifica pdc y que es capaz de expresión en cianobacterias.

8. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima adh comprende SEQ. ID Nº.: 4 o una secuencia génica que codifica adh y que es capaz de expresión en cianobacterias.

9. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica una enzima pdc comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº.: 8.

10. Un vector de expresión que comprende una construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1.

11. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 10.

12. La célula huésped de la reivindicación 11, en la que el vector de expresión está integrado dentro del cromosoma de la célula huésped.

13. La célula huésped de la reivindicación 11, en la que el vector de expresión es pMota.

14. La célula huésped de la reivindicación 11, en la que la célula es una cianobacteria.

15. La célula huésped de la reivindicación 14, en la que la cianobacteria es Synechocystis.

16. La célula huésped de la reivindicación 15, en la que la cianobacteria es Synechocystis sp. PCC 6803, u otra cepa transformable de Synechocystis.

17. La célula huésped de la reivindicación 16, en la que la cianobacteria es una cepa de Synechocystis sp. PCC 6803 de tipo salvaje o es una cepa mutante NDH-2(-) de Synechocystis sp. PCC 6803.

18. La célula huésped de la reivindicación 14, en la que la cianobacteria es Synechococcus PCC 7942, u otra cepa transformable de Synechococcus.

19. La célula huésped de la reivindicación 14, en la que la célula huésped es capaz de producir etanol se produce en cantidades relativamente cuantificables después de un periodo de exposición a la luz.

20. La célula huésped de la reivindicación 19, en la que la célula huésped es capaz de producir etanol en cantidades recuperables mayores de aproximadamente etanol 10 mM después de una fermentación de 5 días.

21. La célula huésped de la reivindicación 19, en la que la célula huésped es capaz de producir etanol en cantidades recuperables de aproximadamente etanol 13 mM después de una fermentación de 5 días.

22. Una cianobacteria modificada mediante ingeniería genética que comprende una construcción que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican enzimas piruvato decarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh), en la que la cianobacteria es capaz de producir etanol en cantidades recuperables mayores que aproximadamente etanol 10 mM después de una fermentación de 5 días.

23. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas pcd y adh se obtienen a partir del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis.

24. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima pdc se obtiene de Zymobacter palmae.

25. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima pdc se obtiene de Zymobacter palmae y la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima adh se obtiene de Zymomonas mobilis.

26. La cianobacteria de la reivindicación 25, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima adh se obtiene del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis.

27. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la cianobacteria es Synechocystis.

28. La cianobacteria de la reivindicación 27, en la que la cianobacteria es Synechocystis sp. PCC 6803, u otras cepas transformables de Synechocystis.

29. La cianobacteria de 28, en la que la Synechocystis sp. PCC 6803 es una cepa Synechocystis sp. PCC 6803 de tipo salvaje o es una cepa mutante NDH-2(-) de Synechocystis sp. PCC 6803.

30. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la secuencia del ácido nucleico que codifica la enzima pdc comprende SEQ. ID Nº.: 3 o una secuencia génica que codifica pdc y que es capaz de expresión en cianobacterias.

31. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la secuencia del ácido nucleico es una secuencia que codifica la enzima pdc que comprende SEQ. ID Nº: 8.

32. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la secuencia del ácido nucleico que codifica la enzima adh comprende SEQ. ID Nº: 4.

33. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la construcción contiene un gen inducible por la luz.

34. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la construcción contiene el promotor de psbAII.

35. La cianobacteria de la reivindicación 22, en la que la construcción es pMota.

36. Un procedimiento de producir etanol, que comprende: cultivar cianobacterias en un medio de cultivo, conteniendo las cianobacterias una construcción que comprende fragmentos de ADN que codifican enzimas pdc y adh obtenidos del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis; y acumular etanol en el medio de cultivo en una cantidad mayor que aproximadamente etanol 10 mM después de fermentación de 5 días.

37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que la cianobacteria es capaz de producir etanol en cantidades recuperables de aproximadamente etanol 13 mM después de una fermentación de 5 días.

38. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que la concentración de etanol del medio de cultivo es al menos aproximadamente 5 mM después de aproximadamente cinco días de cultivo.

39. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que la concentración de etanol del medio de cultivo es al menos aproximadamente 13 mM después de aproximadamente cinco días de cultivo.

40. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que las cianobacterias son Synechocystis y dicha construcción es pMota.

41. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que la construcción comprende adicionalmente un fragmento de ADN que comprende un gen que responde a la luz.

42. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que la construcción está integrada en el cromosoma de las cianobacterias.