PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE L-AMINOÁCIDOS MEDIANDO UTILIZACIÓN DE CEPAS DE LA FAMILIA DE LAS ENTEROBACTERIÁCEAS.

Procedimiento para la producción de L-aminoácidos mediando utilización de cepas de la familia de las enterobacteriáceas Este invento se refiere a un procedimiento para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-treonina, mediando utilización de microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, en las que el gen lamB o las secuencias de nucleótidos, que codifican su producto génico maltoporina, es/son reforzado/as, en particular sobreexpresado/as, y a estos microorganismos. Estado de la técnica Los L-aminoácidos, en particular la L-treonina, encuentran aplicación en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy especialmente en la nutrición de animales. Es conocido que ciertos L-aminoácidos se producen mediante fermentación de cepas de las enterobacteriáceas, en particular de Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. A causa de la gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Ciertos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a medidas técnicas de fermentación, tales como p.ej. una agitación y un abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto, mediante p.ej. una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho. Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a antimetabolitos tales como p.ej. el compuesto análogo a treonina ácido -amino-ß-hidroxivaleriánico (AHV) o que son auxótrofos para unos metabolitos importantes en regulación y producen L-aminoácidos tales como p.ej. Ltreonina. Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de la familia de las enterobacteriáceas, que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción. Unas informaciones recopilativas sobre la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se pueden encontrar en la cita de Neidhardt (coordinador de edición): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology (Escherichia coli y Salmonella, biología celular y molecular), 2 a edición, ASM Press, Washington, D.C., EE.UU, (1996). Misión del invento Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición nuevas medidas técnicas para la producción por fermentación mejorada de L-aminoácidos, en particular de L-treonina. Descripción del invento Son objeto del invento unos microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, que contienen un gen lamB reforzado o sobreexpresado, que codifica un polipéptido con la actividad de la maltoporina LamB, y que producen de un modo mejorado L-aminoácidos, en particular L-treonina. Como punto de partida para la comparación sirven en cada caso los microorganismos no recombinantes, que no contienen ningún gen lamB reforzado. A estos microorganismos pertenecen en particular unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, en los que se refuerza un polinucleótido, que codifica un polipéptido, que es idéntico por lo menos en un 90 %, en particular por lo menos en un 95 %, de manera preferida en un 99 %, a una secuencia de aminoácidos, que se escoge entre el conjunto que se compone de las SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8, poseyendo el polipéptido la actividad de la maltoporina LamB. Se prefieren unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas a las de las SEQ ID No.4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8. Los mencionados microorganismos contienen unos polinucleótidos reforzados o sobreexpresados, que se escogen entre el conjunto que se compone de: a) un polinucleótido con las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7; 2   b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a las SEQ ID No.3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 dentro del marco de la degeneración del código genético; c) una secuencia de un polinucleótido con una secuencia, que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a las SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7; d) un polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7, que contiene unos mutantes con sentido, neutros en función, codificando los polinucleótidos el producto génico maltoporina (véase más abajo). Asimismo, es un objeto del invento un procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular de L-treonina, mediando utilización de microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, que en particular ya producen L-aminoácidos, y en los que se refuerza o respectivamente se refuerzxan por lo menos el gen lamB o unas secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico, la maltoporina LamB. De manera preferida, se emplean los microorganismos descritos. Cuando en lo sucesivo se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos, se han de entender por estos conceptos uno o varios aminoácidos inclusive sus sales, que se escogen entre el conjunto que se compone de L-asparagina, Ltreonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, Lleucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-arginina y L-homoserina. Se prefiere especialmente la L-treonina. El concepto de "refuerzo" describe en este contexto el aumento de la actividad o concentración intracelular en un microorganismo de una o varias enzima(s) o proteína(s), que es(son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se aumenta el número de copias del gen o respectivamente de los genes en por lo menos una (1) copia, se une un promotor fuerte funcionalmente con el gen o se utiliza un gen o alelo, que codifica una correspondiente enzima o respectivamente proteína con una alta actividad, y eventualmente se combinan estas medidas técnicas. Mediante las medidas técnicas del refuerzo, en particular la sobreexpresión, se aumenta la actividad o concentración de la correspondiente proteína por regla general en por lo menos un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, l50 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo en hasta un 1.000 % o 2.000 %, referida a la de la enzima de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante. Por el concepto de "microorganismo no recombinante" o de la cepa parental (en inglés "parent strain") se entiende el microorganismo, en el que se llevan a cabo las medidas técnicas del invento. Es objeto del invento un procedimiento para la producción de L-aminoácidos mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, que está caracterizado porque a) los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado, en los que se refuerza, en particular se sobreexpresa, el gen lamB o la secuencia de nucleótidos, que codifica el producto génico de éste, se cultivan en un medio en unas condiciones, en las que el L-aminoácido deseado se enriquece en el medio o en las células y, b) se aísla el L-aminoácido deseado, permaneciendo en el producto aislado o siendo eliminados de una manera total eventualmente ciertos componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa, en su totalidad o en porciones ( 0 hasta 100 %). Los microorganismos en particular recombinantes, con un gen lamB reforzado o sobreexpresado, que son asimismo un objeto del presente invento, pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, eventualmente almidones, eventualmente celulosas, o a partir de glicerol y etanol. En este caso, se trata de representantes de la familia de las enterobacteriáceas, que se escogen entre el conjunto que se compone de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Los géneros Escherichia y Serratia son preferidos. En el caso del género Escherichia se ha de mencionar en particular la especie Escherichia coli y en el caso del género Serratia se ha de mencionar en particular la especie Serratia marcescens. Unos microorganismos recombinantes se producen por lo general mediante transformación, transducción, conjugación o una combinación de estos métodos, con un vector, que contiene el deseado gen, un alelo de este gen o partes de éste, o un promotor que refuerza la expresión del gen. 3   Unas cepas adecuadas, que producen en particular L-treonina, del género Escherichia,... [Seguir leyendo]

1. Microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, que contienen un gen lamB sobreexpresado, que codifica un polipéptido con la actividad de la maltoporina LamB, y que producen Laminoácidos, y que se enriquecen en un medio, obteniéndose la sobreexpresión mediante la transformación de una cepa, que produce L-aminoácidos, con un plásmido, que lleva el gen lamB. 2. Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1, que contienen adicionalmente por lo menos un gen del operón thrABC, que codifica la aspartato cinasa, la homoserina deshidrogenasa, la homoserina cinasa y la treonina sintasa, y que producen L-treonina. 3. Microorganismo de la familia de las enterobacteriáceas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en las que se sobreexpresa un polinucleótido, que codifica un polipéptido, que es idéntico en por lo menos un 90 %, en particular en por lo menos un 95 %, de manera preferida en un 99 % a una secuencia de aminoácidos, que se escoge entre el conjunto que se compone de las SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8, poseyendo el polipéptido la actividad de la maltoporina lamB. 4. Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 3, que contienen un polinucleótido sobreexpresado, que corresponde al gen lamB, que se escoge entre el conjunto que se compone de: a) un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7; b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a las de las SEQ ID No.3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 dentro del marco de la degeneración del código genético; c) una secuencia de polinucleótidos con una secuencia, que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia complementaria con respecto a las SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 ; d) un polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7, que contiene unos mutantes con sentido, neutros en función. 5. Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 3, poseyendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 95 % a una de las secuencias, que se escogen entre el conjunto que se compone de las SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8. 6. Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 3, teniendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la de las SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8. 7. Microorganismos de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, en los que el número de copias del gen lamB o de las secuencias de polinucleótidos con esta función se presenta aumentado en por lo menos 1. 8. Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 7, realizándose que el aumento del número de copias del gen lamB en por lo menos 1 se establece mediante integración del gen o de las secuencias de polinucleótidos con esta función en el cromosoma de los microorganismos. 9. Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 7, realizándose que el aumento del número de copias del gen lamB en por lo menos 1 se consigue mediante un vector que se replica fuera del cromosoma. 10. Microorganismos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 9, en los que mediante el refuerzo del gen lamB, la concentración o la actividad del producto génico LamB (una proteína) se aumenta en por lo menos un 10 %, referido a la actividad o a la concentración del producto génico en la cepa de partida no recombinante. 11. Microorganismos de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 10, estando caracterizados los microorganismos porque se escogen entre los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. 12. Procedimiento para la producción de L-aminoácidos mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, caracterizado porque a) los microorganismos, que producen el L-aminoácido deseado de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 11 se cultivan en un medio en unas condiciones, en las que el deseado L-aminoácido se enriquece en el medio, y 28   b) se aísla el deseado L-aminoácido, realizándose que ciertos componentes del caldo de fermentación y/o la biomasa permanecen en su totalidad o en ciertas proporciones ( 0 hasta 100 %) en el producto aislado o son eliminados totalmente. 13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque para la producción de L-treonina se fermentan unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, en los que se sobreexpresa(n) adicionalmente de manera simultánea uno o varios de los genes, que se escoge(n) entre el conjunto que se compone de a) por lo menos un gen del operón thrABC, que codifica la aspartato cinasa, la homoserina deshidrogenasa, la homoserina cinasa y la treonina sintasa, b) el gen pyc, que codifica la piruvato carboxilasa, de Corynebacterium glutamicum, c) el gen pps, que codifica la fosfoenolpiruvato sintasa, d) el gen ppc, que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa, e) los genes pntA y pntB, que codifican las subunidades de la piridina transhidrogenasa, f) el gen rhtB, que codifica la proteína que media para la resistencia frente a homoserina, g) el gen rhtC, que codifica la proteína que media en la resistencia frente a treonina, h) el gen thrE, que codifica la proteína de vehículo y exportación de treonina procedente de Corynebacterium glutamicum, i) el gen gdhA, que codifica la glutamato deshidrogenasa, k) el gen pgm, que codifica la fosfoglucomutasa, l) el gen fba, que codifica la fructosa bifosfato aldolasa, m) el gen ptsH, que codifica la fosfohistidina proteína hexosa fosfotransferasa, n) el gen ptsI, que codifica la enzima I del sistema de la fosfotransferasa, o) el gen crr, que codifica el componente IIA, que es específico para la glucosa, p) el gen ptsG, que codifica el componente IIBC, que es específico para la glucosa, q) el gen lrp, que codifica el regulador del regulón de leucina, r) el gen fadR, que codifica el regulador del regulón de fad, s) el gen iclR, que codifica el regulador del metabolismo intermediario central, t) el gen ahpC, que codifica la subunidad pequeña de la alquil hidroperóxido reductasa, u) el gen ahpF, que codifica la subunidad grande de la alquil hidroperóxido reductasa, v) el gen cysK, que codifica la cisteína sintasa A, w) el gen cysB, que codifica el regulador del regulón de cys, x) el gen cysJ, que codifica la flavoproteína de la NADPH sulfito reductasa, y) el gen cysI, que codifica la hemoproteína de la NADPH sulfito reductasa, z) el gen cysH, que codifica la adenililsulfato reductasa, z1) el gen rseA, que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE, z2) el gen rseC, que codifica un regulador global del factor sigmaE, 29   z3) el gen sucA, que codifica la subunidad de descarboxilasa de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa, z4) el gen sucB, que codifica la subunidad de dihidrolipoíl transsuccinasa E2 de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa, z5) el gen sucC, que codifica la subunidad ß de la succinil-CoA sintetasa, z6) el gen sucD, que codifica la subunidad de la succinil-CoA sintetasa, z7) el gen aceE, que codifica el componente E1 del complejo de la piruvato deshidrogenasa, z8) el gen aceF, que codifica el componente E2 del complejo de la piruvato deshidrogenasa, z9) el gen rseB, que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE, z10) el gen malT, que codifica el regulador positivo de la transcripción del regulón de maltosa, z11) el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) yaaU de Escherichia coli, z12) el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) yodA de Escherichia coli y z13) el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) yibD de Escherichia coli. 14. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 12 y 13, caracterizado porque para la producción de L- treonina se fermentan unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, en los que se desconecta(n) adicionalmente de manera simultánea uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de: a) el gen tdh, que codifica la treonina deshidrogenasa b) el gen mdh, que codifica la malato deshidrogenasa, c) el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) yjfA de Escherichia coli d) el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) ytfP de Escherichia coli, e) el gen pckA, que codifica la enzima fosfoenolpiruvato descarboxilasa, f) el gen poxB, que codifica la piruvato oxidasa, g) el gen dgsA, que codifica el regulador DgsA del sistema de la fosfotransferasa, h) el gen fruR, que codifica el represor de la fructosa, i) el gen rpoS, que codifica el factor sigma 38 y j) el gen aspA, que codifica la aspartato amonio liasa. 15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se producen los L-aminoácidos que se escogen entre el conjunto que se compone de L-asparagina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, Lvalina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, Larginina y L-homoserina. 16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se producen unos L-aminoácidos, que se escogen entre el conjunto que se compone de L-isoleucina, L-valina, L-metionina, L-homoserina, L-triptófano, Ltreonina y L-lisina.   Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AlamB 31   Figura 2: Mapa del plásmido pMW218lamB 32