PROCEDIMIENTO PARA EL ANÁLISIS DE ISOFORMAS DE GLICOPROTEÍNAS POR ELECTROFÓRESIS CAPILAR.

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la purificación,

concentración, separación y determinación de las isoformas de la α-1-glicoproteína ácida (AGP), en muestras de suero sanguíneo humano, por electroforesis capilar. El nuevo procedimiento se basa en la inmunocaptura y preconcentración de la muestra dentro del capilar de separación, mediante el uso de una fase inmunoadsorbente magnéticamente inmovilizada en el interior del capilar de electroforesis, y la posterior desorción y separación de las isoformas de la glicoproteína tras la inducción de un efecto de enfoque. El nuevo procedimiento puede tener aplicaciones para el uso de la AGP como biomarcador de enfermedades tales como cáncer, enfermedades vasculares y enfermedades inflamatorias.

PROCEDIMIENTO PARA EL ANÁLISIS DE ISOFORMAS DE

GLICOPROTEÍNAS POR ELECTROFORESIS CAPILAR.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere en general al campo del análisis de proteínas, al análisis de muestras por electroforesis capilar de inmunoafinidad en particular y específicamente al análisis de isoformas de glicoproteína por electroforesis capilar de inmunoafinidad. En un modo de realización particularmente preferido, se refiere al análisis de isoformas de la α-1 glicoproteína ácida mediante electroforesis capilar de inmunoafinidad.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La α-1 glicoproteína ácida (AGP) u orosomucoide es una proteína con un pI de 2.8 a 3.8 y con un peso molecular comprendido entre 41 y 43 kDa. Las diferentes moléculas de la proteína debidas a variaciones en la glicosilación y/o en la secuencia peptídica se denominan formas y cada grupo de formas que migran en la misma banda de electroforesis se denomina isoforma. Los cambios en el perfil electroforético de isoformas de AGP en las muestras biológicas se han relacionado con diferentes estados patológicos como cáncer, inflamación y enfermedades cardiovasculares y del hígado, entre otros [Duche, J. C., Urien, S., Simon, N., Malaurie, E., Monnet, I., Barre, J., Clin Biochem 2000, 33, 197-202; Hashimoto, S., Asao, T., Takahashi, J., Yagihashi, Y., Nishimura, T., Saniabadi, A. R., Poland, D. C., van Dijk, W., Kuwano, H., Kochibe, N., Yazawa, S., Cancer 2004, 101, 2825-2836; Poland, D. C., Garcia Vallejo, J. J., Niessen, H. W., Nijmeyer, R., Calafat, J., Hack, C. E., Van het Hof, B., Van Dijk, W., J Leukoc Biol 2005, 78, 453-461; Budai, L., Ozohanics, O., Ludanyi, K., Drahos, L., Kremmer, T., Krenyacz, J., Vekey, K., Anal Bioanal Chem 2009, 393, 991-998]. La comparación entre los perfiles electroforéticos de isoformas de AGP existentes en fluidos biológicos de individuos que sufren de diferentes enfermedades y los perfiles de individuos sanos podría ser potencialmente utilizada como biomarcador de la enfermedad con fines diagnósticos, pronósticos y de seguimiento terapéutico.

Las diferencias en la composición glucídica y/o en la secuencia peptídica entre las formas de la glicoproteína pueden dar lugar a diferencias en su relación carga/tamaño, siendo por tanto la electroforesis capilar en zona libre (CZE) una técnica adecuada para el análisis de las isoformas de la glicoproteína intacta, es decir sin hidrolizar. El análisis de isoformas de la glicoproteína por CZE requiere el aislamiento previo de la proteína a partir de la muestra biológica. La purificación de AGP a partir de suero humano consiste por lo general en un proceso largo y tedioso basado en el uso de columnas de intercambio iónico o mediante cromatografía de afinidad [Kishino, S., Miyazaki, K., J Chromatogr B 1997, 699, 371-381]. Se ha descrito un método de purificación por cromatografía de inmunoafinidad de AGP a partir de suero y plasma humanos que hace posible el análisis de sus isoformas por CZE (Ongay, S., Neusuess, C., Vaas, S.; Diez-Masa, J. C., de Frutos, M., Electrophoresis 2010, 31, 1796-1804) . Este método permite realizar la preparación de la muestra para el posterior análisis por CZE y detección de las isoformas de la glicoproteína en un tiempo de 4 horas. Esta metodología se ha aplicado con éxito para la comparación de isoformas de AGP en las muestras de individuos sanos y de pacientes que sufren dos enfermedades vasculares, concretamente aneurisma aórtico abdominal (AAA) y ateroesclerosis carotidea (ACT) , mostrando un alto poder predictivo en los grupos sanos vs enfermos, sanos vs AAA, y sanos vs ACT [Puerta, A., Díez-Masa, J. C., Martín-Álvarez, P. J., Martín-Ventura, J. L., Barbas, C., Tuñón, J., Egido, J., de Frutos,

M. Analyst, 2011, 136, 816–822]. Esta última contribución muestra la viabilidad de las isoformas de AGP analizadas por CZE como biomarcador de aterotrombosis.

A pesar de estos logros, el tratamiento de la muestra sigue contribuyendo de forma significativa al tiempo total de análisis. En este sentido, la electroforesis capilar de inmunoafinidad (IACE) empleando anticuerpos inmovilizados es una técnica híbrida que combina la inmunocaptura y la separación por CE. En la IACE en columna, un ligando de afinidad, concretamente un anticuerpo, unido a un soporte sólido o inmovilizado directamente en la pared capilar se fija en el interior del capilar de electroforesis en la zona próxima a la entrada. A continuación se introduce la muestra, y los antígenos de ésta son capturados y posteriormente eluídos y separados empleando un medio disociador de la unión antígenoanticuerpo, seguido de la aplicación de un alto voltaje [Guzman, N. A., Phillips, T. M., Electrophoresis 2011, 32, 1565-1578]. Esta técnica de IACE es la combinación “on-line” de una etapa de cromatografía de inmunoafinidad con una etapa de separación electroforética. La IACE se está convirtiendo en una herramienta de gran alcance que tiene características únicas, que incluyen la automatización, cortos tiempos de preparación de muestra y la utilización de bajas cantidades de muestra y de reactivos. Por otra parte, un inconveniente del tratamiento de la muestra en el capilar de separación es que la matriz de la muestra se introduce directamente en los capilares, lo cual puede ocasionar la adsorción de los componentes de la matriz en la pared capilar. Por lo general, los capilares se recubren con una sustancia química para evitar que los componentes de la matriz se adsorban en la pared de los capilares y para suprimir el flujo electroosmótico (EOF) . Además, en la mayoría de los casos es necesario el uso de procedimientos de isotacoforesis (ITP) para aumentar la sensibilidad y la resolución del método. Hasta el momento, no se había conseguido utilizar con éxito esta técnica de IACE en la separación de isoformas de glicoproteínas.

Teniendo en cuenta la utilidad del perfil electroforético de las isoformas de AGP y otras glicoproteínas como biomarcadores de diferentes enfermedades, se hace necesario un método de análisis que permita de forma automática la preparación de la muestra biológica y la separación rápida y eficaz de las diferentes isoformas de estas proteínas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un nuevo método de electroforesis capilar de inmunoafinidad, para el análisis de isoformas de glicoproteínas en muestras de fluidos biológicos, donde la preparación de la muestra se realiza, de forma mayoritaria, dentro del capilar.

El nuevo método combina la inmunocaptura y preconcentración de la muestra dentro de una columna de electroforesis capilar, mediante el uso de una fase inmunoadsorbente, y la inducción de una etapa de concentración, que permiten purificar, concentrar y separar las isoformas de la proteína al aplicar alto voltaje con un mínimo de manipulación de la muestra. La fase inmunoadsorbente está formada por anticuerpos específicos frente a la glicoproteína de interés, unidos covalentemente a partículas magnéticas y se inmoviliza en el interior de la columna mediante un campo magnético.

El nuevo método permite la purificación, concentración, separación y determinación de las isoformas de la glicoproteína AGP, a partir de una muestra de fluido biológico, en un tiempo de unos 65 min, prácticamente la cuarta parte que los procesos previamente descritos. El proceso es reproducible y en la mayoría de pasos automatizable. El consumo de muestra y reactivos también representa una mejora respecto a los procedimientos previamente descritos.

El análisis del perfil electroforético de isoformas de AGP obtenido mediante la utilización de esta metodología permitiría estudiar su potencial como biomarcador de enfermedades tales como cáncer, inflamación o enfermedades vasculares y del hígado.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. La Fig. 1a muestra un esquema en perspectiva del dispositivo magnético formado por dos imanes (1) y un dispositivo de sujeción (3) que contiene un orificio (2) por el que puede pasar un capilar de electroforesis. La fig. 1b muestra un esquema frontal del mismo dispositivo.

FIGURA 2. La Fig. 2 es un electroforegrama de AGP de una muestra de suero analizada según el procedimiento on-line IACE donde se pueden distinguir las isoformas de la AGP. En la parte inferior derecha se muestra una ampliación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención describe un nuevo método de análisis, basado en electroforesis capilar, que permite la separación de al menos una isoforma de glicoproteína en una muestra de fluido biológico ya obtenida, mediante un proceso que comprende los siguientes pasos:... [Seguir leyendo]

1. Un método para la separación y determinación de al menos una isoforma de una glicoproteína en una muestra de fluido biológico por electroforesis capilar, dicho método caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

(a) inyección en un capilar de electroforesis de una fase inmunoadsorbente para la inmovilización de la fase inmunoadsorbente en el capilar de electroforesis;

(b) inyección de la muestra de fluido biológico que contiene la glicoproteína en dicho capilar de electroforesis para la retención de la glicoproteína en la fase inmunoadsorbente;

(c) inyección de una disolución que contiene un agente disruptor de la unión anticuerpo-glicoproteína en dicho capilar de electroforesis para la desorción de la glicoproteína de la fase inmunoadsorbente;

(d) inyección en dicho capilar de electroforesis de una disolución que permita inducir un efecto de enfoque de la glicoproteína al aplicar un campo eléctrico;

(e) aplicación de un campo eléctrico en dicho capilar de electroforesis para separar al menos una isoforma de la glicoproteína; y

(f) detección de dicha (s) isoforma (s) de la glicoproteína.

2. El método según la reivindicación 1 caracterizado porque la glicoproteína es la α-1-glicoproteina ácida.

3. El método según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la muestra de fluido biológico es suero o plasma.

4. El método según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la fase inmunoadsorbente está formada por anticuerpos específicos frente a la glicoproteína de interés, unidos covalentemente a partículas magnéticas.

5. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque los citados anticuerpos son anti-α-1-glicoproteína ácida.

6. El método según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en el paso (a) , la fase inmunoadsorbente se inmoviliza dentro del capilar de electroforesis mediante la aplicación de un campo magnético.

7. El método según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la inyección de la fase inmunoadsorbente del paso (a) se realiza a partir de una suspensión de 1 mg/mL de esta fase en un tampón fosfato salino durante un tiempo de 240 segundos y a una presión de 100 mbares.

8. El método según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el paso

(a) también comprende la activación de los anticuerpos mediante la inyección de un tampón ácido.

9. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque el citado tampón ácido utilizado consiste en una mezcla de tricina 10 mM, cloruro de sodio 20 mM, acetato de sodio 10 mM, urea 7 M y putrescina 3, 9 mM ajustado a pH 4, 5.

10. El método según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la inyección de la muestra de fluido biológico que contiene la glicoproteína en el paso (b) se realiza en un tiempo de 500 s a una presión de 100 mbar.

11. El método según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la muestra de fluido biológico que contiene la glicoproteína ha sido previamente acidificada y centrifugada antes de ser inyectada en el capilar de electroforesis.

12. El método según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se realiza un lavado entre los pasos (b) y (c) .

13. El método según las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el agente disruptor utilizado en el paso (c) es un tampón ácido formado por una mezcla de 10 mM tricina, 20 mM cloruro de sodio, 10 mM acetato de sodio, urea 7 M y 3, 9 mM putrescina, ajustado a pH 4, 5.

14. El método según la reivindicación 13 caracterizado porque el citado agente disruptor se inyecta desde el extremo de salida del capilar de electroforesis.

15. El método según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la disolución utilizada en el paso (d) tiene una conductividad inferior a la disolución utilizada en el paso (c) .

16. El método según la reivindicación 15 caracterizado porque la disolución utilizada en el paso (d) es una mezcla metanol/agua en una relación 1/3 v/v.

17. El método según las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el campo eléctrico aplicado en el paso (e) es de 333 V/cm.

18. El método según las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la determinación de las isoformas de la glicoproteína se realiza cuantificando el porcentaje de área corregida de cada isoforma respecto al área total.

19. Un aparato para la separación de glicoproteínas según el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende los siguientes elementos: a) un capilar de electroforesis, b) una fase inmunoadsorbente que contiene anticuerpos específicos frente a

la glicoproteína de interés, y c) un dispositivo magnético que permite inmovilizar la fase inmunoadsorbente en el interior del capilar de electroforesis.

20. El aparato según la reivindicación 19 caracterizado porque el capilar de electroforesis utilizado es un capilar de sílice fundida no recubierto.

21. El aparato según las reivindicaciones 19 y 20, caracterizado porque el citado capilar de electroforesis es de 90 cm de longitud y 75 micras de diámetro interno.

22. El aparato según las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque el citado dispositivo magnético descrito en (c) está formado por dos imanes y un dispositivo de sujeción que mantiene los imanes separados entre sí a una distancia comprendida entre 0, 1 y 100 mm y sujeta el capilar entre los dos

imanes.

23. El aparato según la reivindicación 22 caracterizado porque los dos imanes son imanes de disco de Nd-Fe-B, de 9 mm de diámetro y 5 mm de grosor.

24. Uso del perfil electroforético de al menos una isoforma de la glicoproteína obtenido utilizando el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, como biomarcador de enfermedades que causan cambios, a nivel fisiológico, en el perfil electroforético de dicha isoforma de la glicoproteína.

FIG. 1

Fig. 1a

Fig. 1b

FIG. 2