Un procedimiento para extraer y recuperar polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de una biomasa celular bacteriana,

obteniéndose dicha biomasa mediante fermentación, caracterizada por que comprende las etapas de:

i) Someter la biomasa celular a operaciones concomitantes de inyección de disolvente de PHA, agitaciónenérgica y calentamiento rápido en el interior de un reactor, con el fin de estimular la rotura de la pared de lascélulas de biomasa y la disolución del PHA contenido en el ultimo, y para formar una suspensión quecomprende disolvente de PHA enriquecido con PHA disuelto en una concentración de al menos 2 % en pesode la suspensión y los residuos insolubles de la biomasa celular, en el que el disolvente de PHA usado seselecciona de los grupos de disolventes consistentes en formiato de metilo, formiato de etilo, formiato depropilo, formiato de butilo, formiato de isoamilo, formiato de pentilo (amilo) y formiato de caproílo (o hexilo) ymezclas de estos disolventes; propionato de etilo, propionato de isopropilo, propionato de isoamilo, propionatode caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; butirato de metilo, butirato de propilo, butirato deisopropilo, butirato de isoamilo, butirato de pentilo (amilo), butirato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estosdisolventes; isobutirato de metilo, isobutirato de propilo, isobutirato de isopropilo, isobutirato de isoamilo,isobutirato de pentilo (amilo), isobutirato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; valerato depropilo, valerato de isopropilo, valerato de butilo, valerato de isobutilo, valerato de isoamilo (3-metil-1-butilo),valerato de pentilo (amilo) y valerato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; e isoamilato demetilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-metilo), isoamilato de etilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-etilo), isoamilato de propilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-etilo), isoamilato de isopropilo (isovalerato)(butanoato de 3-metil-1-isopropilo), isoamilato de butilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-butilo), isoamilatode isobutilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isobutilo), isoamilato de isoamilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isoamilo), isoamilato de pentilo (isovalerato) (amilo) (butanoato de 3-metil-1-pentilo o de amilo) eisoamilato de caproílo (isovalerato) (hexilo) y mezclas de estos disolventes;

ii) someter la suspensión formada en el reactor a una etapa de separación para recuperar el disolventeenriquecido con el PHA disuelto de los residuos insolubles de la biomasa celular restante;

iii) someter la solución de disolvente de PHA enriquecido con PHA a operaciones de agitación y lavado conagua y/o vapor a una temperatura que es suficiente y adecuada para estimular la eliminación, medianteevaporación, de casi todo el disolvente de PHA y la precipitación del PHA, con el fin de formar una suspensiónque comprende PHA precipitado en agua el disolvente restante;

iv) someter la suspensión del PHA precipitado a evaporación del disolvente restante hasta la depleción delmismo a través de la inyección de vapor en dicha suspensión de PHA, con el fin de obtener partículas de PHApurificado en suspensión acuosa; v) enfriar la suspensión en medio acuoso, del que se deplecionó el disolventede PHA, hasta aproximadamente 45 ºC o menos, y separar las partículas de PHA de dicha suspensión; y

vi) someter las partículas de PHA separado a una etapa de secado.

Procedimiento para el aislamiento de polihidroxialcanoatos (PHA) de células bacterianas mediante extracción en disolvente. 5

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la extracción y recuperación de polihidroxialcanoatos (PHA) de una biomasa celular bacteriana usando disolventes de PHA no halogenados que no son agresivos para el medio ambiente, en el que el procedimiento permite obtener polihidroxialcanoatos (PHA) de pureza elevada y de alto peso molecular.

Antecedentes de la invención

Es actualmente sabido en la industria mundial que existe una necesidad de producción de materiales biodegradables y biocompatibles usando materias primas renovables y fuentes de energía a través de procedimiento que no sean agresivos con el medio ambiente.

En la sociedad moderna actual, el uso de materiales plásticos a gran escala está llevando a una diversidad de problemas medioambientales serios cada vez mayores. En vista de estos problemas, el desarrollo de resinas plásticas biodegradables ha recibido atención mundial, principalmente las producidas por medio de una tecnología limpia, utilizando fuentes renovables. Las aplicaciones de estos biopolímeros biodegradables con mayores posibilidades de éxito en el mercado incluyen productos tales como materiales desechables, por ejemplo, embalajes, recipientes para cosméticos y agroquímicos tóxicos, artículos médicos y farmacéuticos, como se describe en la introducción de la solicitud de patente brasileña P104005622-1 (PCT/BR04/000237) del mismo solicitante. Una importante familia de los biopolímeros biodegradables es la de los polihidroxialcanoatos (PHA) , que son poliésteres sintetizados de forma natural por un gran número de seres vivos. Con más de 170 representantes descritos en la literatura, el interés comercial en los PHA está directamente relacionado no sólo con la biodegradabilidad, sino también con sus propiedades termo-mecánicas y con sus costes de producción. De esta forma, únicamente algunos PHA han encontrado aplicación industrial, siendo los más representativos el PHB (poli-3-hidroxibutirato) , el PHB-V (poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) ) , el P4HB (poli (4-hidroxibutirato) ) , el P3HB4HB (poli (3-hidroxibutirato-co-4hidroxibutirato) ) y algunos PHAmcl (polihidroxialcanoatos de cadena media) , siendo el representante típico de esta última familia el PHHx (polihidroxihexanoato) .

La estructura química de los PHA puede describirse como una cadena polimérica formada por repeticiones de la siguiente unidad:

en la que R es un grupo alquilo o alquenilo de longitud variable, y m y n son números enteros, m asumiendo R y m en los polímeros antes mencionados los siguientes valores:

PHB: R=CH3, m=1 PBH-V: R=CH3 o CH3-CH2, m=1

45 P4HB: R=H, m=2 P3HB-4HB: R=H o CH3, m=1 or2 PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1

El gran desarrollo de las ciencias naturales en las últimas dos décadas, particularmente en el campo de la biotecnología, ha permitido el uso de los más diversos organismos, naturales o modificados genéticamente, en la producción comercial de PHA. Especialmente relevante para la presente divulgación es el uso de determinadas cepas bacterianas, que son capaces de producir y acumular cantidades importantes de estos polímeros en su interior. Cultivadas en condiciones específicas, que permiten alcanzar una alta densidad celular, un alto contenido de polímero intracelular y resultan compatibles con el proceso industrial, estas cepas bacterianas pueden usar 55 diferentes materias primas renovables, tales como la caña de azúcar, las melazas o los extractos de celulosa hidrolizada. Aunque se han realizado intentos para aplicar las células bacterianas en la naturaleza (sin usar agentes solubilizantes de PHA) , como material moldeable, conforme se divulga en la patente de EE.UU. nº 3107172, las aplicaciones comerciales de los PHA en la mayoría de los casos precisan una pureza lo suficientemente alta como para conseguir las propiedades plásticas deseadas. Con el fin de obtener los niveles adecuados de pureza para el procesamiento del biopolímero, especialmente de los PHA, existen fases normalmente requeridas en las cuales es indispensable el uso de disolventes para la extracción y recuperación del PHA de la biomasa residual.

En la patente EPA-01455233 A2 se describen varias posibilidades para llevar a cabo la digestión de una suspensión acuosa de células que contienen PHA, usando enzimas y/o tensioactivos para solubilizar el material celular que no es PHA, considerando que las enzimas son muy caras y no se pueden recuperar en el proceso, al contrario de lo que ocurre cuando se usa el disolvente. También se precisa una alta dilución del material celular, lo que lleva a un alto volumen de residuos generados en el proceso.

Los procedimientos de extracción propuestos habitualmente consisten, básicamente, en exponer la biomasa celular seca o húmeda que contiene el biopolímero a un contacto intensivo con un disolvente que lo solubiliza, seguido de una etapa en la que se separa el residuo celular. A continuación, la solución que contiene el biopolímero recibe la adición de un agente insolubilizante, lo que induce su precipitado en el disolvente (véase, por ejemplo, la patente brasileña PI 9103116-8, presentada el 16 de julio de 1991 y publicada el 24 de febrero de 1993) .

En los procesos de extracción a través de disolventes orgánicos, los disolventes usados son hidrocarburos parcialmente halogenados, tales como el cloroformo (patente US-3275610) , el cloruro de metileno-etanol (documento US-3044942) , los cloroetanos y los cloropropanos con un punto de ebullición dentro del intervalo de 65 a 170 ºC, el 1, 2-dicloroetano y el 1, 2, 3-tricloropropano (patentes EP-0014490 B y EP-2446859) .

Otros compuestos halogenados, tales como diclorometano, dicloroetano y dicloropropano, se citan en las patentes de EE.UU. 4.562.245 (1985) , 4.310.684 (1982) , 4.705.604 (1987) y en la patente europea 036.699 (1981) y en la patente alemana 239.609 (1986) .

Los procedimientos de extracción y purificación de biopolímeros de la biomasa que usan disolventes halogenados, están hoy día totalmente prohibidos, debido a que son muy agresivos para el medio ambiente y para la salud humana. Por lo tanto, un disolvente que se puede usar como un potencial extractor del biopolímero de una biomasa celular debe primeramente cumplir la condición de no ser agresivo con el medio ambiente En este sentido, la patente brasileña PI 9302312-0 (presentada en 1993 y concedida el 30 de abril de 2002) presenta un procedimiento de extracción de biopolímero de la biomasa bacteriana que usa como disolventes alcoholes de cadena larga con 3 carbonos o los acetatos derivados de los mismos. Esta patente prefiere alcohol isoamílico (3-metil-1-butanol) , acetato de amilo (o éster amiloacético) y aceite condensado, una mezcla de alcoholes altos obtenida como subproducto de la fermentación alcohólica y que tiene como componente principal al alcohol isoamílico. Esta patente se caracteriza también por usar un único disolvente como extractor y purificador, sin precisar el uso de un agente insolubilizante o contra-disolvente y/o un no disolvente mínimo. La precipitación del soluto (biopolímero) de la solución de PHA se realiza mediante el enfriamiento de la solución.

La patente de EE.UU. 6.043.063 (presentada el 14 de abril de 1998 y concedida el 28 de marzo de 2000) , la patente de EE.UU. 6.087.471 (presentada el 14 de abril de 1998 y concedida el 11 de junio de 2000) y la solicitud de patente internacional WO-98/46783 (presentada el 15 de abril de 1997) mencionan una extensa lista de disolventes no halogenados, que podrían usarse potencialmente como disolventes para la extracción de biopolímero de la biomasa, pero muchos de ellos presentan características tales como una difícil manipulación industrial, toxicidad, además de un alto coste. En dicha extensa lista, que incluye también los disolventes citados en la patente brasileña PI 9302312 0, únicamente un pequeño número de disolventes presentan potencial para usarse comercialmente para la extracción de biopolímero de la biomasa vegetal o bacteriana, bien debido a problemas relacionados con la incompatibilidad con el biopolímero, o debidos a su toxicidad, explosividad y a su elevado coste.

Debido a que los biopolímeros son termosensibles, es decir cuando se someten a temperaturas por encima de un valor determinado se degradan de forma irreversible, pierden peso molecular, lo que puede afectar definitivamente a las propiedades que los caracterizan... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para extraer y recuperar polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de una biomasa celular bacteriana, obteniéndose dicha biomasa mediante fermentación, caracterizada por que comprende las etapas de:

i) Someter la biomasa celular a operaciones concomitantes de inyección de disolvente de PHA, agitación enérgica y calentamiento rápido en el interior de un reactor, con el fin de estimular la rotura de la pared de las células de biomasa y la disolución del PHA contenido en el ultimo, y para formar una suspensión que comprende disolvente de PHA enriquecido con PHA disuelto en una concentración de al menos 2 % en peso de la suspensión y los residuos insolubles de la biomasa celular, en el que el disolvente de PHA usado se selecciona de los grupos de disolventes consistentes en formiato de metilo, formiato de etilo, formiato de propilo, formiato de butilo, formiato de isoamilo, formiato de pentilo (amilo) y formiato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; propionato de etilo, propionato de isopropilo, propionato de isoamilo, propionato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; butirato de metilo, butirato de propilo, butirato de isopropilo, butirato de isoamilo, butirato de pentilo (amilo) , butirato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; isobutirato de metilo, isobutirato de propilo, isobutirato de isopropilo, isobutirato de isoamilo, isobutirato de pentilo (amilo) , isobutirato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; valerato de propilo, valerato de isopropilo, valerato de butilo, valerato de isobutilo, valerato de isoamilo (3-metil-1-butilo) , valerato de pentilo (amilo) y valerato de caproílo (o hexilo) y mezclas de estos disolventes; e isoamilato de metilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-metilo) , isoamilato de etilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1etilo) , isoamilato de propilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-etilo) , isoamilato de isopropilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isopropilo) , isoamilato de butilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-butilo) , isoamilato de isobutilo (isovalerato) (butanoato de 3-metil-1-isobutilo) , isoamilato de isoamilo (isovalerato) (butanoato de 3metil-1-isoamilo) , isoamilato de pentilo (isovalerato) (amilo) (butanoato de 3-metil-1-pentilo o de amilo) e isoamilato de caproílo (isovalerato) (hexilo) y mezclas de estos disolventes; ii) someter la suspensión formada en el reactor a una etapa de separación para recuperar el disolvente enriquecido con el PHA disuelto de los residuos insolubles de la biomasa celular restante; iii) someter la solución de disolvente de PHA enriquecido con PHA a operaciones de agitación y lavado con agua y/o vapor a una temperatura que es suficiente y adecuada para estimular la eliminación, mediante evaporación, de casi todo el disolvente de PHA y la precipitación del PHA, con el fin de formar una suspensión que comprende PHA precipitado en agua el disolvente restante; iv) someter la suspensión del PHA precipitado a evaporación del disolvente restante hasta la depleción del mismo a través de la inyección de vapor en dicha suspensión de PHA, con el fin de obtener partículas de PHA purificado en suspensión acuosa; v) enfriar la suspensión en medio acuoso, del que se deplecionó el disolvente de PHA, hasta aproximadamente 45 ºC o menos, y separar las partículas de PHA de dicha suspensión; y vi) someter las partículas de PHA separado a una etapa de secado.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el disolvente de PHA usado se selecciona del grupo de disolventes que consiste en propionato de isoamilo, butirato de propilo, valerato de isoamilo e isoamilato de isoamilo o mezclas de los mismos.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el disolvente de PHA es propionato de isoamilo.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el disolvente de PHA usado permite presentar una solubilidad de PHA en el mismo de al menos 5 % en peso.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el PHA usado se selecciona del grupo definido por poli-3-hidroxibutirato (PHB) , poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) , PHBV y mezclas de estos polímeros y copolímeros.

6. procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que el PHA se produce mediante fermentación bacteriana usando microorganismos que son capaces de biosintetizar PHA usando, como materia prima principal, azúcares extraídas de caña de azúcar, y porque la fuente principal de energía usada para generar la energía térmica y la energía eléctrica requeridas por el procedimiento es bagazo de caña de azúcar.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa de inyectar disolvente en la biomasa celular concentrada comprende operaciones de inyectar disolvente de PHA líquido y disolvente de PHA en forma de vapor, con el fin de estimular el calentamiento de la biomasa celular a una temperatura entre 90 ºC y la temperatura de ebullición del disolvente a una presión sustancialmente atmosférica.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la eliminación del disolvente de la solución de PHA se lleva a cabo en una cámara de evaporación pulverizando directamente la solución de PHA en un flujo de vapor, seguido de precipitación de PHA en la mezcla de disolvente y agua.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que el vapor usado para eliminar el disolvente de la solución de PHA mediante evaporación, inyectando directamente la solución en un flujo de vapor, es

un vapor supercalentado en relación con la presión de operación en la cámara de evaporación.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la eliminación del disolvente de la solución de PHA se lleva a cabo inyectando directamente la solución en un flujo de vapor y en la cámara de evaporación mantenida a una presión inferior a la presión atmosférica.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la eliminación del disolvente de la solución de PHA se lleva a cabo inyectando directamente la solución en un flujo de vapor y en la cámara de evaporación mantenida a una presión sustancialmente atmosférica.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la eliminación del disolvente de la solución de PHA comprende inyectar directamente la solución en agua y vapor y calentando en agitación en un reactor mantenido a una presión inferior a la presión atmosférica.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la eliminación del disolvente de la solución de PHA se lleva a cabo inyectando directamente la solución en agua y calentando en agitación en un reactor mantenido a una presión sustancialmente atmosférica.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la biomasa usada en el proceso de extracción es una forma de suspensión acuosa.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que el disolvente de PHA forma con agua, en una fase de vapor, una mezcla binaria.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por que la etapa de inyectar disolvente en la suspensión de la biomasa celular comprende operaciones de inyectar disolvente de PHA líquido y disolvente de PHA en forma de vapor, con el fin de estimular el calentamiento de la biomasa celular a una temperatura entre 90 ºC y la temperatura de ebullición del disolvente a una presión sustancialmente atmosférica y para formar: una fase líquida que comprende disolvente de PHA enriquecida con PHA y el agua estante de la biomasa celular; una fase sólida definida por los residuos insolubles de la biomasa celular residual; y una fase de vapor que contiene agua y vapores del disolvente de PHA.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado por que comprende la etapa adicional de extraer la fase de vapor que contiene sustancialmente exceso del agua introducida en el interior del reactor a través de la biomasa.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la biomasa celular procede de microorganismos naturales o genéticamente modificados.