Métodos y matrices para detección de analito objeto de estudio y determinación de concentración de analito objeto de estudio en disolución.

Un método para medir la concentración de un analito objeto de estudio en una muestra, que comprende:

(a) proporcionar una muestra y una matriz de componentes de captura, comprendiendo dicha muestra moléculas de analito objeto de estudio, comprendiendo dicha matriz al menos 1.000 sitios, teniendo cada sitio un volumen definido entre 10 attolitros y 50 picolitros;

(b) poner en contacto dicha matriz con dicha muestra de manera que los sitios que contienen analito objeto de estudio ligado a componentes de captura tal que la proporción de moléculas de analito objeto de estudio a sitios de dicha matriz sea menor que 1:5 que da como resultado sitios con moléculas de analito únicas y

(c) determinar el porcentaje de sitios de dicha matriz que contienen una molécula de analito objeto de estudio para proporcionar una medida de la concentración de analito objeto de estudio.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/004349.

Solicitante: TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE.

Inventor/es: WALT,DAVID R, RISSIN,DAVID M, GORRIS,HANS-HEINER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)

PDF original: ES-2530203_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Métodos y matrices para detección de analito objeto de estudio y determinación de concentración de analito objeto de estudio en disolución.

Derechos del gobierno El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invención conforme al Contrato Nº N0001401-1 adjudicado por la Oficina de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzados de Defensa (DARPA, por sus siglas en inglés) de Investigación Naval, del Departamento de Defensa.

Antecedentes Los métodos que implantan detección de alta sensibilidad y bajo nivel de analito junto con protocolos experimentales rápidos y reproducibles son la piedra angular de las mediciones analíticas modernas. En la actualidad, la mayoría de las técnicas conocidas para cuantificar niveles bajos de analito objeto de estudio en una matriz de muestra usa procedimientos de amplificación para aumentar el número de moléculas informadoras y proporcionar de ese modo una señal medible. Estos procedimientos conocidos incluyen inmunoanálisis ligados a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) para amplificar la señal en ensayos basados en anticuerpos, así como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para multiplicar cadenas de ADN objeto de estudio en ensayos basados en ADN. Una técnica de amplificación de objeto de estudio de proteínas más sensible pero indirecta, denominada inmuno-PCR (véase Sano, T.; Smith, C. L.; Cantor, C. R. Science 1.992, 258, 120-122) , hace uso de marcadores de oligonucleótidos, que se pueden amplificar con posterioridad usando PCR y detectar usando un ensayo de ADN (véase Nam, J. M.; Thaxton, C. S.; Mirkin, C. A. Science 2.003, 301, 1.884-1.886; Niemeyer, C. M.; Adler, M.; Pignataro, B."; Lenhert, S.; Gao, S.; Chi, L. F.; Fuchs, H.; Blohm, D. Nucleic Acids Research 1.999, 27, 4.553-4.561; y Zhou, H.; Fisher, R. J.; Papas, T. S. Nucleic Acids Research 1.993, 21, 6.038-6.039) . Mientras el método inmuno -PCR permite detección de proteínas de nivel ultra bajo, es un procedimiento de ensayo complejo y puede tener tendencia a generación de señales de falsos positivos (véase Niemeyer, C. M.; Adler, M.; Wacker, R. Trends in Biotechnology 2.005, 23, 208-216) .

Una desventaja de estos métodos conocidos es su dependencia de etapas separadas para multiplicar moléculas informadoras para proporcionar una señal medible, requiriendo de ese modo etapas de multiplicación adicionales y así tiempo, equipo y materiales adicionales.

Además, los métodos conocidos para cuantificar con precisión la concentración de un analito particular en disolución se basan todos en respuestas conjuntas en que muchas moléculas de analito dan lugar a la señal medida.

Por ejemplo, la patente internacional WO 99/58948 A describe un método de base óptica y un sistema para detección de analito usando inmovilización de la fase sólida, etiquetas de analito específicas adaptadas para generación de señal y procedimientos correspondientes para la utilización del mismo. El sistema está constituido por una plataforma/un soporte para inmovilizar una fase de la muestra con una muestra etiquetada (complejo de analito) ligada a la misma, una fuente de radiación, un aparato óptico para generar y dirigir radiación a dicha muestra y un medio para recogida y análisis de datos.

Rondelez et al. (véase bibliográficamente) describen un dispositivo de silicona con una gran serie de cavidades de tamaño de micrómetro que se puede usar para encerrar firmemente femtolitros de disolución durante largos periodos de tiempo. El dispositivo descrito en la presente memoria podía medir supuestamente la actividad de moléculas únicas de β-galactosidasa y peroxidasa de rábano.

Angenendt et al. (véase bibliográficamente) describen ensayos enzimáticos múltiples en volúmenes de subnanolitro en una única micromatriz usando tecnología de manchado múltiple e indicaron una sensibilidad de la medición hasta 35 moléculas de enzima. El ensayo se aplicó a la detección de un marcador prognóstico, catepsina.

La patente internacional WO 2007/044974 A2 describe métodos y dispositivos para cuantificación absoluta de ácidos nucleicos objeto de estudio de la reacción en cadena de la polimerasa. En particular, los métodos y los dispositivos proporcionan división de una muestra de ácidos nucleicos que se tiene que analizar en pequeños volúmenes aislados, conduciendo el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en dichos volúmenes, detectando después y analizando los productos de amplificación PCR antes de realizar cuantificación absoluta.

Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de un método mejorado y sistema de detección de analito objeto de estudio.

Breve Sumario de la invención La presente invención, como se define por las reivindicaciones, es un método para medir la concentración de un analito objeto de estudio en una muestra. El método comprende:

(a) proporcionar una muestra y una matriz de componentes de captura, comprendiendo dicha muestra moléculas de

analito objeto de estudio, comprendiendo dicha matriz al menos 1.000 sitios, teniendo cada sitio un volumen definido entre 10 attolitros y 50 picolitros;

(b) poner en contacto dicha matriz con dicha muestra de manera que los sitios que contienen analito objeto de estudio ligado a componentes de captura tal que la proporción de moléculas de analito objeto de estudio a sitios de dicha matriz sea menor que 1:5 que da como resultado sitios con moléculas de analito únicas y

(c) determinar el porcentaje de sitios de dicha matriz que contienen una molécula de analito objeto de estudio para proporcionar una medida de la concentración de analito objeto de estudio.

La presente descripción explica en líneas generales métodos, sistemas y dispositivos ejemplares que se pueden usar para realizar el método de la invención.

Según una realización, la presente descripción se refiere a un método para detectar un analito objeto de estudio en una muestra. El método incluye proporcionar una matriz que comprende una pluralidad de sitios, comprendiendo cada sitio un componente de captura y poner en contacto la matriz con la muestra de manera que cada sitio en un subconjunto de la pluralidad de sitios contenga un analito objeto de estudio único. Cada analito objeto de estudio comprende un componente enzimático. El método incluye además poner en contacto la matriz con un sustrato enzimático y detectar un cambio en una propiedad óptica en cada uno de los sitios como una indicación de la presencia del analito objeto de estudio.

La presente descripción, en otra realización, se refiere a un método para detectar analitos objeto de estudio en una muestra. El método incluye proporcionar una matriz que comprende una pluralidad de sitios y poner en contacto la matriz con la muestra de manera que cada sitio en un primer subconjunto de la pluralidad de sitios contenga un único primer analito objeto de estudio y cada sitio en un segundo subconjunto de la pluralidad de sitios contenga un único segundo analito objeto de estudio. En esta realización, cada sitio comprende un componente de captura y cada uno de los analitos objeto de estudio, primero y segundo, comprende un componente enzimático. El método incluye además poner en contacto la matriz con un primer sustrato enzimático y detectar cualquier cambio en una propiedad óptica como resultado del primer sustrato enzimático en cada uno de los sitios como una indicación de la presencia de uno de los analitos objeto de estudio, primero o segundo. Además, el método incluye lavar la matriz y poner en contacto la matriz con un segundo sustrato enzimático. Además, el método incluye detectar cualquier cambio en una propiedad óptica como resultado del segundo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para medir la concentración de un analito objeto de estudio en una muestra, que comprende:

(a) proporcionar una muestra y una matriz de componentes de captura, comprendiendo dicha muestra moléculas de analito objeto de estudio, comprendiendo dicha matriz al menos 1.000 sitios, teniendo cada sitio un volumen definido entre 10 attolitros y 50 picolitros;

(b) poner en contacto dicha matriz con dicha muestra de manera que los sitios que contienen analito objeto de estudio ligado a componentes de captura tal que la proporción de moléculas de analito objeto de estudio a sitios de dicha matriz sea menor que 1:5 que da como resultado sitios con moléculas de analito únicas y

(c) determinar el porcentaje de sitios de dicha matriz que contienen una molécula de analito objeto de estudio para proporcionar una medida de la concentración de analito objeto de estudio.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dichas moléculas de analito objeto de estudio comprenden biomoléculas opcionalmente etiquetadas.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dichas biomoléculas se seleccionan del grupo que consiste en: proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, hormonas, citocinas, antígenos celulares y receptores.

4. El método según la reivindicación 3, en el que dichas biomoléculas son receptores seleccionados del grupo que consiste en receptores neuronales, receptores hormonales y receptores de nutrientes.

5. El método según la reivindicación 1, en el que dicho analito objeto de estudio se selecciona del grupo que consiste en: contaminantes medioambientales, pesticidas, insecticidas, toxinas y fármacos.

6. El método según la reivindicación 1, en el que dicha relación es (i) entre 1:5 y 1:500 o (ii) 1:10.

7. El método según la reivindicación 1, que comprende además, después de la etapa de puesta en contacto, sellar la matriz de manera que el contenido de cada sitio no pueda escapar de dicho sitio.

8. El método según la reivindicación 1, en el que dicho volumen definido de cada sitio oscila de 30 femtolitros a 60 femtolitros.

9. El método según la reivindicación 1, en el que dicha matriz comprende: (i) entre 20.000 y 10.000.000 sitios o (ii) entre 20.000 y 30.000 sitios o (iii) entre 100.000 y 10.000.000 sitios o (iv) entre 10.000 y 50.000 sitios.

10. El método según la reivindicación 1, en el que cada sitio de dicha matriz comprende un componente de captura.

11. El método según la reivindicación 10, en el que dichas moléculas de analito objeto de estudio se seleccionan del grupo que consiste en: enzimas, ADN o anticuerpos.

12. Un método según la reivindicación 1, en el que la matriz comprende una pluralidad de micropozos formados en un extremo de un haz de fibra óptica.

13. El método según la reivindicación 1, en el que dicha determinación comprende detectar un cambio en una propiedad óptica en dichos sitios como una indicación de la presencia de dicha molécula de analito objeto de estudio.