Un método de predecir el riesgo de desarrollar osteoartritis, que comprende:

determinar la concentración nuclear de una proteína o complejo represor de PITX1 seleccionada del grupoconsistente en prohibitina (PHB-1), prohibitona (PHB-2), correpresor de interacción del represor transcripcional 6 dellinfoma de linfocitos B (BCoR), complejo que contiene PHB-1, complejo que contiene PHB-2 y complejo quecontiene BCoR en una muestra celular del sujeto seleccionada del grupo consistente en una muestra de condrocitosarticulares, una muestra de condrocitos de la placa de crecimiento, una muestra de osteoblastos, una muestra demioblastos del esqueleto y una muestra de sinoviocitos, y

determinar si la concentración nuclear de la proteína o complejo represor es mayor en la muestra celular del sujetoen comparación con la de una muestra celular control;

en el que la concentración nuclear de una proteína o complejo represor en la muestra celular del sujeto es indicativade que el sujeto está en riesgo de desarrollar osteoartritis.

Métodos de diagnosticar osteoartritis

5 Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/854.077 presentada el 25 de octubre de 2006.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de pronóstico de la osteoartritis y métodos de seleccionar compuestos.

Antecedentes de la invención

La etiología de la (OA) , la forma más frecuente de artritis, sigue no estando clara a pesar de la multiplicidad de factores que se han considerando en la OA primaria (1, 2) . En la actualidad, cada vez es más evidente que la mayoría de los loci de susceptibilidad genética a la OA se puede atribuir únicamente a genes estructurales o a genes que regulan la masa ósea (3-5) . Estos estudios también han destacado la gran heterogeneidad y las diferencias en el grado de heredabilidad entre la OA entre diferentes puntos de articulación (por ejemplo, mano frente a rodilla) y el sexo. Esto también se refleja en la multiplicidad de loci identificados en estudios relacionados con la OA y sus discrepancias. Además, la importancia funcional de estos loci de susceptibilidad todavía no se ha confirmado e ilustra nuestros incompletos conocimientos de la biología de la OA.

PITX1 (antes denominada Ptx1) es un factor de transcripción de homeodominio detectado inicialmente con el desarrollo de la hipófisis. La familia de PITX contiene tres miembros relacionados. PITX1, PITX2 y PITX3, que son miembros de la clase apareada de proteínas de homeodominio. Los tres factores Pitx tienen propiedades de transcripción similares (6-8) . El gen PITX1 se expresa a niveles elevados en los huesos largos de las patas traseras de ratón durante el desarrollo (5) y la acumulación de niveles elevados de proteínas PITX1 se detectó mediante inmunohistoquímica en secciones de hueso largo de las patas traseras principalmente en la región periarticular, a lo largo del pericondrio (incluidas las articulaciones de la cadera y la rodilla) y también en los núcleos de condrocitos proliferativos (8) . La expresión de PITX1 también se detectó en estructuras craneofaciales, tales como la mandíbula y las articulaciones temporo-mandibulares. Los ratones que son homocigotos para la deleción de PITX1 nacen con la proporción mendeliana prevista, pero mueren poco después del nacimiento y el análisis fenotípico de los ratones

mutantes recién nacidos muestra sorprendentes anomalías craneofaciales y en las extremidades traseras (9) . Es interesante el hecho de que los ratones heterocigotos que solamente alojan un alelo mutado eran fenotípicamente normales en el momento del nacimiento, pero una mayoría de los ratones heterocigotos PITX1+/- en envejecimiento exhibió cambios degenerativos graduales de las articulaciones de la rodilla, mostrando lesiones del tipo OA a los siete meses de edad. La comparación de los análisis histológicos realizados en fémures de ratones silvestres (figura 1a) y PITX1 +/- (figura 1b) de siete meses de edad confirmó un engrosamiento anormal del hueso subcondral, trabecular y cortical, una característica frecuente en la OA. A un aumento mayor, las secciones histológicas teñidas con el método de Goldner reveló una fibrilación y una marcada calcificación que solo afecta al cartílago articular de ratones heterocigotos PITX1 (figura1d) . Estas anomalías eran restos de los cambios clínicos observados habitualmente en los pacientes de OA.

45 Las prohibitinas, prohibitina (también conocida como PHB-1 o BAP32) y prohibitona (también conocida como PHB-2, proteína asociada con los receptores de linfocitos B o BAP37, REA para el represor de los receptores de estrógenos) son proteínas altamente conservadas en las células eucariotas que están presentes en múltiples compartimentos celulares (30-32) . La PHB-1 se localiza en la mitocondria donde podría tener un papel en el mantenimiento de la función mitocondrial así como en el núcleo donde facilita la senescencia celular reclutando corepresores específicos para inhibir los genes objetivo E2F (19-21) . El papel de la PHB-1 en la regulación del ciclo celular también se demuestra mediante su interacción física con las familias de proteínas del supresor del tumor retinoblastoma (22, 23) y mediante una interacción directa con la región del recuadro marcada altamente conservada de E2F (24) , que impide la interacción de E2F con su secuencia afín. No obstante, la función de la PHB-1 en el

55 núcleo sigue siendo controvertida, aunque su localización nuclear se ha encontrado en diversas líneas celulares (24) .

Para el conocimiento del solicitante, no hay ninguna prueba molecular para evaluar el riesgo de progresión y gravedad de la OA.

Sumario de la invención

De acuerdo con un especto de la presente invención se proporciona un método de seleccionar un compuesto en el que dicho método comprende las etapas de (a) poner en contacto un compuesto de prueba con al menos una célula

65 que tiene una mutación dentro del sitio similar a E2F del promotor PITX1 y (b) determinar los niveles de transcripción y/o de expresión de PITX1; en el que el compuesto de prueba se selecciona si el nivel de transcripción y/o de expresión de PITX1 se incrementa en presencia del compuesto de prueba en comparación con aquellos en ausencia del mismo. En una realización específica, la mutación es una mutación correspondiente a -3727 C-T dentro del sitio de tipo E2F del promotor PITX1. En otra realización específica, el compuesto seleccionado es potencialmente útil en el tratamiento de la osteoartritis primaria en una articulación en la que normalmente se expresa PITX1. En otra

realización específica, la articulación en la que normalmente se expresa PITX1 se selecciona del grupo consistente en la articulación de la rodilla, la articulación de la cadera y la articulación temporo-mandibular. En otra realización, la articulación en la que normalmente se expresa PITX1 es la articulación de la rodilla. En otra realización, la articulación en la que normalmente se expresa PITX1 es la articulación de la cadera. En otra realización, la articulación en la que normalmente se expresa PITX1 es la articulación temporo-mandibular.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método que comprende: (a) proporcionar una muestra de ADN de un sujeto y (b) comparar la unión de una proteína represora de PITX1 seleccionada del grupo consistente en prohibitina (PHB-1) , prohibitona (PHB-2) y correpresión que interacciona con el represor transcripcional 6 del linfoma de linfocitos B (BCoR) , a un sitio de tipo E2F del promotor PITX1 en la muestra de ADN

del sujeto, con la observada en una muestra de ADN control, en la que un incremento de la unión de la proteína represora de PITX1 al sitio de tipo E2F del promotor de PITX1 en la muestra de ADN del sujeto en comparación con la de la muestra de ADN control, es indicativo de que el sujeto tiene osteoartritis o está en riesgo de desarrollar osteoartritis. En una realización específica, dicha proteína represora es PHB-1. En otra realización específica, dicha proteína represora es PHB-2. En otra realización específica, dicha proteína represora es BCoR. En otra realización específica, dicho sujeto no se diagnosticó clínicamente con osteoartritis.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado de no más de 300 nucleótidos que comprende (a) una secuencia de al menos 20 nucleótidos contiguos de AGTTCCATACTCCCATCTGTGCCTCACTGGCGGCAGTCCTGCTCAAATACATC CTGGCTCT (SEC ID Nº 1)

incluido un nucleótido en la posición 31, en la que C está sustituida por T; o (b) la complementaria de la secuencia en (a) . En una realización específica, la secuencia en (a) es de al menos 30 nucleótidos contiguos de AGTTCCATACTCCCATCTGTGCCTCACTGGCGGCAGTCCTGCTCAAATACATC CTGGCTCT (SEC ID Nº 1) .

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una matriz de moléculas de ácido nucleico unidas a un soporte sólido, en la que la matriz comprende un oligonucleótido hibridable con la molécula de ácido nucleico de la presente invención en condiciones en las que el oligonucleótido no hibridará sustancialmente con una molécula de ácido nucleico consistente en AGTTCCATACTCCCATCTGTGCCTCACTGGCGGCAGTCCTGCTCAAATACATC CTGGCTCT (SEC ID Nº 1) o su complementaria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona... [Seguir leyendo]

1. Un método de predecir el riesgo de desarrollar osteoartritis, que comprende:

determinar la concentración nuclear de una proteína o complejo represor de PITX1 seleccionada del grupo consistente en prohibitina (PHB-1) , prohibitona (PHB-2) , correpresor de interacción del represor transcripcional 6 del linfoma de linfocitos B (BCoR) , complejo que contiene PHB-1, complejo que contiene PHB-2 y complejo que contiene BCoR en una muestra celular del sujeto seleccionada del grupo consistente en una muestra de condrocitos articulares, una muestra de condrocitos de la placa de crecimiento, una muestra de osteoblastos, una muestra de mioblastos del esqueleto y una muestra de sinoviocitos, y

determinar si la concentración nuclear de la proteína o complejo represor es mayor en la muestra celular del sujeto en comparación con la de una muestra celular control;

en el que la concentración nuclear de una proteína o complejo represor en la muestra celular del sujeto es indicativa de que el sujeto está en riesgo de desarrollar osteoartritis.

2. Un método de predecir el riesgo de desarrollar osteoartritis, que comprende:

(a) identificar un sujeto que se sospecha que sufre osteoartritis (OA) ; y

(b) detectar la concentración en sangre, la concentración tisular o la concentración en el fluido sinovial de una proteína o complejo represor de PITX1 seleccionada del grupo consistente en prohibitina (PHB-1) , prohibitona (PHB2) , correpresor de interacción del represor transcripcional 6 del linfoma de linfocitos B (BCoR) , complejo que

contiene PHB-1, complejo que contiene PHB-2 y complejo que contiene BCoR en una muestra de sangre, una biopsia tisular o una muestra de fluido sinovial del sujeto.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la osteoartritis se selecciona del grupo consistente en artritis de la articulación de la rodilla, artritis de la articulación de la cadera y artritis de las articulaciones temporo-mandibulares.

4. El método de seleccionar un compuesto, en el que dicho método comprende:

(a) poner en contacto un compuesto de prueba con una muestra celular seleccionada del grupo consistente en una

muestra de condrocitos articulares, una muestra de condrocitos de la placa de crecimiento, una muestra de osteoblastos, una muestra de mioblastos esqueléticos y una muestra de sinoviocitos, y

(b) determinar la localización nuclear de la proteína o complejo represor de PITX1 o evaluar la sumoilación de una proteína o complejo represor de PITX1 o medir la unión de una proteína o complejo represor de PITX1 sobre el sitio de tipo E2F de PITX1 en la muestra celular, en la que dicha proteína o complejo represor de PITX1 se selecciona del grupo consistente en prohibitina (PHB-1) , prohibitona (PHB-2) , correpresor de interacción del represor transcripcional 6 del linfoma de linfocitos B (BCoR) , complejo que contiene PHB-1, complejo que contiene PHB-2 y complejo que contiene BCoR;

45 en el que el compuesto de prueba se selecciona si 1) la localización nuclear de la proteína o complejo represor de PITX1 en la muestra celular está disminuida en presencia del compuesto de prueba en comparación con en ausencia del mismo; 2) la sumoilación de la proteína o complejo represor de PITX1 en la muestra celular está disminuida en presencia del compuesto de prueba en comparación con en ausencia del mismo; o 3) la unión de la proteína o complejo represor de PITX1 en el sitio de tipo E2F de PITX1 en la muestra celular está disminuida en presencia del compuesto de prueba en comparación con en ausencia del mismo.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el compuesto de prueba seleccionado es potencialmente útil en impedir acumulación o retención de la proteína o el complejo represor de PITX1 en núcleos celulares o en estimular la exportación nuclear de la proteína o complejo represor de PITX1.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la proteína o complejo represor de PITX1 comprende prohibitina (PHB-1) y preferentemente en el que la proteína represora es PHB-1.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la proteína o complejo represor de PITX1 comprende prohibitona (PHB-2) y preferentemente en el que la proteína represora es PHB-2.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la proteína o complejo represor de PITX1 comprende el correpresor de interacción con el represor transcripcional 6 del linfoma de células B (BCoR) y preferentemente en el que la proteína represora es BCoR.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-8, en el que dicha muestra celular es de un sujeto que

padece osteoartritis.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-9, en el que dicha muestra celular es una muestra de

condrocitos articulares, preferentemente de un sujeto que tiene osteoartritis en una articulación de la rodilla, una 5 articulación de la cadera o una articulación temporo-mandibular.

11. Un método in vitro para predecir el riesgo de desarrollar osteoartritis que comprende detectar en un sujeto la presencia de al menos una modificación postraduccional directa o indirectamente causante de la acumulación o retención nuclear de prohibitina (PHB-1) , de prohibitona (PHB-2) o del correpresor de interacción con el represor

transcripcional 6 de linfocitos B (BCoR) en células en las que PHB-1, PHB-2, BCoR o PITX1 se expresan de forma normal, en el que la presencia de la al menos una modificación postraduccional es una indicación de que el sujeto tiene osteoartritis o está en riesgo de desarrollar osteoartritis,

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicho método comprende detectar en un sujeto la presencia de al

menos una modificación postraduccional que causa directa o indirectamente la acumulación o retención nuclear de la prohibitina (PHB-1) .

13. El método de la reivindicación 11 o 12, en el que dicha modificación postraduccional es la sumoilación.