Método de evaluación del riesgo de cáncer oral en seres humanos.

Un método in vitro de diagnóstico de la predisposición al cáncer oral en un sujeto humano o de diagnóstico delcáncer oral en un sujeto humano,

comprendiendo el método recoger y estabilizar una muestra de saliva bruta dedicho sujeto humano, y llevar a cabo al menos la siguiente etapa:

* analizar la fracción volátil que corresponde a la parte evaporable extraída de dicha muestra de saliva estabilizada,detectando en dicha fracción volátil al menos un compuesto orgánico bioquímico;

en donde la detección de al menos un compuesto orgánico bioquímico es indicativa de un riesgo de predisposición adesarrollar cáncer oral.

Método de evaluación del riesgo de cáncer oral en seres humanos La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. presentada el 4 de agosto, 2008, con el número de serie 61/086.019.

La presente invención se refiere a un método para proporcionar una evaluación del riesgo y diagnóstico del cáncer oral humano examinando en una muestra de saliva de un sujeto humano, la presencia de compuestos orgánicos bioquímicos volátiles particulares, una combinación de los cuales es indicativa de un riesgo mayor de cáncer oral.

Antecedentes de la invención Los cánceres de la cavidad oral representaron 274.000 casos en 2002, con casi dos tercios de los mismos en hombres. La región del mundo con la mayor incidencia es Melanesia (31, 5 por 10.000 en hombres y 20, 2 por

100.000 en mujeres) . Las tasas en hombres son altas en Europa occidental (11, 3 por 100.000) , el sur de Europa (9, 2por 100.000) , sur de Asia (12, 7 por 100.000) , sur de África (11, 1 por 100.000) , y Australia/Nueva Zelanda (10, 2 por 100.000) . En mujeres, la incidencia del cáncer oral es relativamente alta en el sur de Asia (8, 3 por 100.000) . Estos patrones reflejan la prevalencia de factores de riesgo específicos, tales como el tabaco/alcohol, falta de salud dental y oral, y el mascar betel en Asia central y sur y Melanesia. Además, para el cáncer de la cavidad oral las tasas globales de supervivencia de 5 años no han mejorado en las pasadas décadas, permaneciendo bajas en aproximadamente 30-50% (Epstein, J.B. et al. 2002 J. Can. Dent. Assoc. 68: 617-621; Mao, L. et al. 2004 Cancer Cell 5: 311-316) .

Además, la mayoría de los cánceres orales son inicialmente asintomáticos y no se diagnostican o se tratan hasta que han alcanzado una etapa avanzada. Hasta ahora se ha preguntado a los pacientes sobre los riesgos asociados con el cáncer oral (fumador, alcohol) seguido de la inspección clínica de la cavidad oral. Sin embargo, como se ha indicado antes, etapas tempranas tales como estados preneoplásicos y estados de recurrencia de tumor temprana no muestran daño tisular que sea visible para dentistas o médicos.

Por lo tanto, es necesario un método para evaluar el factor de riesgo, para el diagnóstico temprano, y mejorar el pronóstico. En relación con esto, un problema es proporcionar un método que se pueda llevar a cabo de forma rutinaria y en la práctica habitual o en laboratorios.

La presente invención describe un método de diagnóstico fiable y sensible aplicado a la saliva de sujetos humanos.

La saliva es un fluido transparente, ligeramente ácido, que contiene una serie de constituyentes inorgánicos y orgánicos importantes para la salud oral. La saliva entera es una mezcla de secreciones de las glándulas salivales mayores y menores y fluido gingival crevicular, que contiene células hospedantes desprendidas, bacterias y restos de alimentos. Por lo tanto, la saliva no es un “ultrafiltrado” pasivo del suero, sino que contiene una composición característica de enzimas, hormonas, anticuerpos y otras moléculas (Rehak, N.N. et al. 2000 Clin. Chem. Lab. Med. 38:335-343; Wong DT, American Scientist, vol 96, 2008) . Por ejemplo, la saliva contiene un gran número de proteínas que ayudan a la protección de los tejidos de la cavidad oral, incluyendo mucinas, amilasas, aglutininas, lisozimas, peroxidasas, lactoferrina e IgA secretoria. La saliva completa contiene células epiteliales normales y leucocitos que se pueden peletizar, y a partir de los cuales se puede recuperar fácilmente el ADN genómico y ARNm, usado potencialmente para encontrar marcadores genómicos de diferentes enfermedades. Realmente, se encontró que la mayoría del ADN o ARN extraído de la saliva bruta era de origen vírico o bacteriano (Stamey, F.R. et al. 2003 J. Virol. Methods 108:189-193; Mercer, D.K. et al. 2001 FEMS Microbiol. Lett. 200:163-167) y de origen extra o intracelular humano. Además, muchos grupos han centrado su estudio y ensayos de diagnóstico en el líquido sobrenadante y por lo tanto la fase exenta de células de la saliva completa, que contiene muchos analitos tales como ARNm libre (Zimmermann BG et al., Oral Oncology 2008, 44, 425-429) .

En los últimos 10 años, se ha aplicado satisfactoriamente el uso de la saliva en el diagnóstico (Streckfus, CF. & Bigler, L.R. 2002 Oral Dis. 8:69-76) . Se han identificado biomarcadores de diagnóstico en la saliva para el control de caries, periodontitis, enfermedades de las glándulas salivales y trastornos sistémicos, p. ej., hepatitis y VIH (Lawrence H.P. et al, 2002 J. Can. Dent. Assoc. 68: 170-174) . También se ha publicado que las bacterias orales son elevadas en lesiones de cáncer oral y esofágico (Mager D.L. et al. J. Transl. Med. 2005; 3: 27, Hooper J.S et al., Journal of Clinical Microbiology, May 2006, P 1719-1725) . La razón de estos desplazamientos en la colonización bacteriana de lesiones de cáncer no esta clara. Los estudios mecanísticos de la unión de bacterias proporcionan alguna comprensión y la investigación ha mostrado repetidamente que las bacterias orales demuestran tropismos específicos hacia diferentes superficies biológicas en la cavidad oral tales como dientes, mucosa y otras bacterias. Hay menos tiempo en la cavidad oral para que se desarrolle una biopelícula compleja sobre las superficies de tejido blando; por lo tanto, se pone la compensación en potentes mecanismos de adhesión. Las diferencias en los tropismos bacterianos para sitios orales específicos sugieren que diferentes superficies intraorales y especies bacterianas tienen diferentes receptores y moléculas de adhesión que dictan la colonización de diferentes superficies orales. Algunos glicoconjugados sirven como receptores para bacterias específicas y publicaciones recientes apoyan la idea de que los desplazamientos en la colonización de las diferentes células de cáncer están asociados con cambios observados en los receptores de superficie celular. Hence, Mager D.L. et al., mostraron que la microbiota salival en sujetos con una lesión de carcinoma celular escamoso oral (OSCC) difiere de la encontrada en los controles exentos de OSCC. Se determinaron los recuentos bacterianos para cada especie, se hizo la media de los sujetos en los 2 grupos de sujetos, y se determinó la significancia de las diferencias entre grupos usando la prueba de Mann-Whitney y se ajustó para comparaciones múltiples; es interesante que parece que las cepas 5 bacterianas Capnocytophaga gingivalis, Prevotella melaninogenica, Streptococcus mitis y Micrococcus luteus estaban particularmente presentes en pacientes que tenían OSCC y por lo tanto se sugirió que servían como marcadores de diagnóstico para el cáncer oral. Sin embargo, como se demuestra en (ref.) estas cepas bacterianas particulares estaban poco asociadas con el cáncer oral (una sensibilidad máxima de 80%) (Mager D.L. et al) . También se ha mostrado en Li et al. (Journal of Applied Microbiology, 2004, 97, 1311-1318) que la presencia en la saliva de números significativamente altos de bacterias vivas específicas (en este estudio se han identificado 40 cepas diferentes y se han descrito más de 200 bacterias vivas específicas en la cavidad oral) , se podría asociar con la formación de biopelícula, colonización de la cavidad oral y falta de higiene oral, que a menudo están asociados con el desarrollo de cáncer oral en los países en desarrollo. Sin embargo, a partir de Li et al. no se puede predecir que las cepas particulares Capnocytophaga gingivalis, Prevotella melaninogenica, Streptococcus mitis y

Micrococcus luteus puedan servir como marcadores de diagnóstico fiables para el cáncer oral humano. Esta es la razón por la que, hasta la fecha, no se ha propuesto nunca un ensayo de diagnóstico basado en bacterias fiable y muy sensible, para diagnosticar el cáncer oral en la saliva.

Es interesante observar que la mayoría de las especies aisladas eran sacarolíticas y tolerantes al ácido y se sabe que producen ácidos orgánicos de cadena corta a partir de hidratos de carbono y por consiguiente reducen el pH de su entorno local. Raghunad N. et al. (J. Radiol. 2003; 76. S11-S22) describieron que el microentorno de tumores sólidos típicamente es hipóxico, con un pH extracelular ácido, por lo que no es sorprendente que puede haber un grado de selectividad en favor de la tolerancia al ácido. Otro factor podría ser la producción de daño oxidativo del ADN generado por bacterias orales. Takeuchi T. et al. (2000, FEMS Microbiol Lett. Nov 1; 192 (1) :133-8) , investigaron el mecanismo de la inducción de daño oxidativo al ADN por exposición al O2 en Prevotella melaninogenica, un anaerobio estricto encontrado en la cavidad oral y algunas enfermedades dentales. Los resultados indican que en... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro de diagnóstico de la predisposición al cáncer oral en un sujeto humano o de diagnóstico del cáncer oral en un sujeto humano, comprendiendo el método recoger y estabilizar una muestra de saliva bruta de dicho sujeto humano, y llevar a cabo al menos la siguiente etapa:

* analizar la fracción volátil que corresponde a la parte evaporable extraída de dicha muestra de saliva estabilizada, detectando en dicha fracción volátil al menos un compuesto orgánico bioquímico;

en donde la detección de al menos un compuesto orgánico bioquímico es indicativa de un riesgo de predisposición a desarrollar cáncer oral.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha fracción volátil se extrae de la muestra de saliva bruta 10 calentando dicha muestra de saliva durante al menos 10 min a una temperatura comprendida entre 30ºC y 50ºC.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho al menos un compuesto orgánico bioquímico se selecciona del grupo que consiste en: 2, 3-pentanodiona (número CA.

60. 14-6) , 3-metiltiofeno (número CA.

61. 44-4) , acetona (número CA.

6. 64-1) , hexanonitrilo (número CA.

62. 73-9) , benzaldehído (número CA.

10. 52-7) , 3-metil-2pentanona (número CA.

56. 61-7) , 2, 3-butanodiona (número CA.

43. 03-8) , 2-propanol (número CA.

6. 63-0) , 15 acetato de etilo (número CA.

14. 78-6) , 1-propanol (número CA.

7. 23-8) , hexanal (número CA.

6. 25-1) , 5-metil3-hexen-2-ona (número CAS 5166-53-0) , m-xileno (número CA.

10. 38-3) , p-xileno (número CA.

10. 42-3) , 2metil-2-butenal (E) (número CA.

49. 03-0) , fenol (número CA.

10. 95-2) , butanal (número CA.

12. 72-8) , metilbutanona (número CAS.

56. 80-4) , 2-metil-2-buteno (número CA.

51. 35-9) , 2-metil-1-propeno (número CA.

11. 11-7) y (cis) -1, 2-dimetilciclopropano (número CAS.

93. 18-7) ; y preferiblemente la detección de al menos un 20 compuesto orgánico bioquímico elegido de 2, 3-pentanodiona (número CA.

60. 14-6) , 3-metiltiofeno (número CA.

61. 44-4) , acetona (número CA.

6. 64-1) , hexanonitrilo (número CA.

62. 73-9) , benzaldehído (número CAS 10052-7) , 3-metil-2-pentanona (número CA.

56. 61-7) , 2, 3-butanodiona (número CA.

43. 03-8) , 2-propanol (número CA.

6. 63-0) , acetato de etilo (número CA.

14. 78-6) , 1-propanol (número CA.

7. 23-8) , hexanal (número CA.

6. 25-1) , 5-metil-3-hexen-2-ona (número CAS 5166-53-0) , m-xileno (número CA.

10. 38-3) , p-xileno (número CAS

106-42-3) , 2-metil-2-butenal (E) (número CA.

49. 03-0) en la fracción volátil de la saliva de un sujeto humano, indica que dicho sujeto humano tiene un riesgo alto de desarrollar un cáncer oral.

4. El método según la reivindicación 3, en donde la detección de los compuestos orgánicos bioquímicos del grupo que comprende: hexanonitrilo, 2, 3-pentanodiona, 3-metiltiofeno y acetona en la fracción volátil de la saliva de un sujeto humano, indica que dicho sujeto humano está desarrollando un cáncer oral.

5. El método según la reivindicación 3, en donde la detección de al menos un compuesto orgánico bioquímico elegido del grupo que comprende: 2-metil-2-buteno (número CA.

51. 35-9) , 2-metil-1-propeno (número CAS 11511-7) y (cis) -1, 2-dimetilciclopropano (número CA.

93. 18-7) en la fracción volátil de saliva de un sujeto humano, indica que dicho sujeto humano no está desarrollando un cáncer oral.

6. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende la etapa de:

* analizar una fracción de fluido de dicha muestra de saliva estabilizada, detectando secuencias de ADN o ARN específicas de origen humano, bacteriano o vírico en dicha fracción de fluido.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dichas secuencias de ADN o ARN específicas se eligen de:

i) secuencias humanas seleccionadas de ARNm de SSAT (SEQ ID Nº 62) , ARNm de H3F3A (SEQ ID Nº 63) y ARNm de IL8 (SEQ ID Nº 64) ; y/o ii) secuencias de bacterias seleccionadas de Capnocytophaga gingivalis (ATCC 33624) , Prevotella melaninogenica (ATCC 25845) , Streptococcus mitis (ATCC 15914) y Micrococcus luteus (ATCC 53598D) ; y/o iii) secuencias de virus seleccionadas del papilomavirus humano, preferiblemente dicho papilomavirus humano es el papilomavirus humano 16 (ATCC 45113) o el papilomavirus humano 18 (ATCC 45152) ;

y preferiblemente en donde la detección de al menos dos secuencias de ARNm como se han definido 45 específicamente en i) , y al menos una secuencia bacteriana como se ha definido específicamente en ii) en la saliva de un sujeto humano, indica que dicho sujeto humano tiene un riesgo alto de desarrollar un cáncer oral.

8. El método según la reivindicación 7, en donde la detección del ARNm humano de H3F3A (SEQ ID Nº 63) , del ARNm humano de SSAT (SEQ ID Nº 62) y del genoma bacteriano de Streptococcus mitis (ATCC 15914) en la saliva de un sujeto humano indica que dicho sujeto tiene un riesgo alto de desarrollar un cáncer oral.

9. El método según la reivindicación 7, en donde:

i) la saliva bruta se estabiliza usando una disolución que comprende una sal tal como tiocianato de guanidinio, y/o sulfato amónico y/o azida sódica, y opcionalmente inhibidores de exo y/o endonucleasa; y/o ii) se detectan secuencias de ADN o ARN específicas incubando dicho ADN genómico y ARN total con una enzima termoestable con actividad de transcriptasa inversa dependiente de ARN y actividad de polimerasa dependiente de ADN, preferiblemente la combinación de RT-PCR y PCR se lleva a cabo en una reacción en un solo tubo.

10. El método según la reivindicación 7, en donde la detección de la secuencia de ARNm de H3F3A (SEQ ID Nº 63) , de ARNm de SSAT (SEQ ID Nº 62) , y la detección de los compuestos orgánicos bioquímicos hexanonitrilo, 2, 3-pentanodiona, 3-metiltiofeno y acetona en la saliva de un sujeto humano, indica que dicho sujeto humano está desarrollando un cáncer oral.

11. El método según la reivindicación 1, en donde:

i) la fracción volátil de la saliva se extrae de la muestra de saliva bruta calentando dicha muestra de saliva durante al menos 10 min a 40ºC, usando una microextracción en fase sólida (SPME) con una fibra de CAR/PDMS; y/o ii) los compuestos orgánicos bioquímicos en dicha fracción volátil se detectan usando una cromatografía en fase gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas.

12. El método según la reivindicación 7, que comprende amplificar y detectar al menos una secuencia de ADN

o ARN elegida del grupo que comprende: SEQ ID Nº 62 a 70.

13. El método según la reivindicación 7, que comprende las etapas de:

a) recoger una muestra de saliva bruta de dicho sujeto humano en un dispositivo estéril,

b) estabilizar dicha muestra añadiendo una disolución que comprende una sal de guanidinio, tal como tiocianato de guanidinio y/o sulfato amónico y/o azida sódica, y opcionalmente inhibidores de exo y/o endonucleasas,

c) extraer el ácido nucleico total de origen bacteriano, vírico y humano de la muestra de saliva estabilizada previamente obtenida,

d) precipitar y purificar los ácidos nucleicos totales,

e) incubar el ácido nucleico total purificado con una enzima termoestable con actividad de transcriptasa inversa dependiente de ARN y actividad de polimerasa dependiente de ADN, y cebadores polinucleótidos en condiciones que permitan a la actividad de transcriptasa inversa de dicha enzima termoestable sintetizar ADNc a partir del ácido ribonucleico y amplificación del ADN genómico y ADNc a un nivel detectable por la reacción en cadena de la polimerasa,

f) detectar en un ensayo las secuencias de ADN amplificadas por hibridación con una o más sondas de polinucleótidos específicas para:

i) secuencias humanas seleccionadas de ARNm de SSAT (SEQ ID Nº 62) , ARNm de H3F3A (SEQ ID Nº 63) y ARNm de IL8 (SEQ ID Nº 64) ; o ii) secuencias de bacterias seleccionadas de Capnocytophaga gingivalis (ATCC 33624, SEQ ID Nº 65) , Prevotella melaninogenica (ATCC 25845, SEQ ID Nº 66) , Streptococcus mitis (ATCC 15914, SEQ ID Nº 67) y Micrococcus luteus (ATCC 53598D, SEQ ID Nº 68) , o iii) secuencias de virus seleccionadas de papilomavirus humano 16 (ATCC 45113, SEQ ID Nº 69) y el papilomavirus humano 18 (ATCC 45152, SEQ ID Nº 70) ;

y en donde dichos cebadores y dichas sondas usadas para amplificar y detectar al menos una secuencia de i) , ii) o iii) , se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en SEQ ID Nº 1 a SEQ ID Nº 60.

14. El método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a) recoger una muestra de saliva bruta de dicho sujeto humano en un dispositivo estéril,

b) estabilizar dicha muestra por adición de una disolución que comprende una sal de guanidinio, tal como tiocianato de guanidinio, sulfato amónico y/o azida sódica,

c) extraer la fracción volátil de dicha muestra estabilizada calentándola durante al menos 10 min a 40ºC y usando, por ejemplo, la microextracción en fase sólida (SPME) para separar la fracción volátil,

d) detectar al menos un compuesto orgánico bioquímico usando, por ejemplo, un cromatógrafo en fase gaseosa acoplado a un espectrómetro de masas, en donde dicho al menos un compuesto orgánico bioquímico se selecciona preferiblemente de: 2, 3-pentanodiona (número CA.

60. 14-6) , 3-metiltiofeno (número CA.

61. 44-4) , acetona (número CA.

6. 64-1) , hexanonitrilo (número CA.

62. 73-9) , benzaldehído (número CA.

10. 52-7) , 3-metil-2pentanona (número CA.

56. 61-7) , 2, 3-butanodiona (número CA.

43. 03-8) , 2-propanol (número CA.

6. 63-0) , acetato de etilo (número CA.

14. 78-6) , 1-propanol (número CA.

7. 23-8) , hexanal (número CA.

6. 25-1) , 5-metil3-hexen-2-ona (número CAS 5166-53-0) , m-xileno (número CA.

10. 38-3) , p-xileno (número CA.

10. 42-3) , 2metil-2-butenal (E) (número CA.

49. 03-0) , fenol (número CA.

10. 95-2) , butanal (número CA.

12. 72-8) , metilbutanona (número CAS.

56. 80-4) , 2-metil-2-buteno (número CA.

51. 35-9) , 2-metil-1-propeno (número CA.

11. 11-7) y (cis) -1, 2 dimetilciclopropano (número CAS.

93. 18-7) .

15. Uso para poner en práctica el método según la reivindicación 14, de un kit que comprende:

a) Un dispositivo estéril para recoger una muestra de saliva, que opcionalmente contiene un reactivo de recolección b) Un reactivo conservante, c) Al menos un sensor electrónico,

d) Opcionalmente, un marcador molecular de control.

Figura 1