Métodos y dispositivos mejorados para análisis celular.

Método para procesar una muestra de tejido vivo de células agregadas a partir de un sujeto o células cancerosas a partir de un tumor sólido

, que comprende:

a) desagregar y dispersar una disolución acuosa que contiene células agregadas vivas obtenidas a partir de un sujeto o células cancerosas a partir de un tumor sólido en al menos una alícuota de prueba en una primera cámara aislada, en la que las células se dispersan usando una cantidad predeterminada de tensión de cizalladura mecánica, de desde 100 hasta 800 dinas/cm2;

b) opcionalmente purificar la alícuota para aumentar el porcentaje de células diana en relación con otros tipos de células contaminantes retirando las células contaminantes;

c) distribuir las células vivas en una o más segundas cámaras aisladas para su análisis en ausencia de cultivo celular; y

caracterizado por que el método comprende además la etapa de

d) analizar las células distribuidas exponiendo las células a al menos un reactivo de prueba para producir un efecto cuantitativo o cualitativo medible sobre uno o más de una biomolécula diana o un biomarcador diana ex vivo, en donde el efecto se identifica mediante una medición de un efecto agonista o antagonista sobre una ruta celular;

en el que las células se procesan en un estado vivo con estrés o activación celular mínimo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/012148.

Solicitante: BIOMARKER STRATEGIES, LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 855 N. WOLFE ST., SUITE 603 BALTIMORE, MARYLAND 21205 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: CLARK,DOUGLAS P, SCHAYOWITZ,ADAM, MURPHY,KATHLEEN M, DIAMOND,SCOTT L.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/574 (para el cáncer)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Muestreo; Preparación de muestras para la investigación... > G01N1/28 (Preparación de muestras para el análisis (montaje de muestras sobre las placas del microscopio G02B 21/34; medios de soporte para los objetos o para los materiales a examinar en un microscopio electrónico H01J 37/20))

PDF original: ES-2535631_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Métodos y dispositivos mejorados para análisis celular Campo de la invención

Las realizaciones de la presente invención se refieren a métodos mejorados para analizar una célula, células agregadas o un tumor sólido. Tales métodos son, por ejemplo, útiles en el campo de la patología y pueden proporcionar resultados analíticos y de procesamiento de células mejorados. El alcance de protección se define mediante las reivindicaciones.

Antecedentes

Durante mucho tiempo se han procesado muestras patológicas tradicionales usando métodos que implican la destrucción de las células o tiempos de procesamiento de muestras prolongados. Tales métodos se realizan generalmente en un laboratorio muy lejos del punto de atención. Estos métodos tradicionales no permiten el examen de células vivas, incluyendo biomarcadores dinámicos, relacionados con células vivas, y no permiten un rápido procesamiento de muestras o la generación de resultados analíticos en el punto de atención. Esta falta de información completa y obtenida rápidamente puede impedir que los médicos identifiquen el régimen de tratamiento apropiado o como mínimo ralentizan el proceso, lo que afecta de manera adversa a la calidad de vida del paciente. En la figura 9, se muestra una comparación del procedimiento tradicional con algunas realizaciones mejoradas.

Por ejemplo, los oncólogos tienen varias opciones de tratamiento a su disposición, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos que se caracterizan como tratamiento de referencia, y varios fármacos que no llevan una declaración en la etiqueta para un cáncer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cáncer. La mayor probabilidad de un buen desenlace del tratamiento requiere que se les asigne a los pacientes un tratamiento contra el cáncer disponible óptimo, y que esta asignación se realice tan rápidamente como sea posible tras el diagnóstico.

Aunque algunos cánceres pueden identificarse fácilmente usando marcadores genómicos, no están disponibles marcadores genómicos fiables para todos los cánceres, que pueden caracterizarse mejor como presenten una expresión anómala de uno o (normalmente) muchos genes normales. Las pruebas de diagnóstico disponibles actualmente para diagnosticar tipos de cáncer particulares y evaluar la probable eficacia de diferentes estrategias de tratamiento basándose en la expresión génica pueden tener una o más desventajas, por ejemplo: (1) las pruebas pueden estar diseñadas para someter a prueba sangre y no se adaptan fácilmente para someter a prueba tumores sólidos; (2) los métodos de preparación de muestras para muestras de tumores sólidos, incluyendo desagregación de células, pueden no ser adecuados para manipular células vivas o realizar mediciones posteriores de la expresión de marcadores; (3) muestras pequeñas, por ejemplo, obtenidas usando biopsias con agujas finas, pueden no proporcionar suficiente tejido para realizar un análisis completo; (4) las pruebas pueden requerir cultivar in vitro las células, periodos de incubación prolongados y/o retrasos significativos entre el momento en el que se obtienen las células de prueba del paciente y el momento en el que se someten a prueba las células, dando como resultado la posibilidad de una variación amplia e influencias externas sobre la expresión de marcadores; (5) las pruebas pueden no ser adecuadas para medir la expresión de una multiplicidad de genes, fosfoproteínas u otros marcadores en paralelo, lo que puede ser crítico para reconocer y caracterizar la expresión como anómala; (6) las pruebas pueden no ser cuantitativas, basándose principalmente en inmunohistoquímica para determinar la presencia o ausencia de una proteína en contraposición a niveles relativos de expresión de genes; (7) los reactivos y las condiciones de manipulación de las células no están controlados estrictamente, conduciendo a un alto grado de variabilidad de una prueba a otra y de un laboratorio a otro; (8) las pruebas pueden no ser adecuadas para analizar los niveles de ARN, debido a la inestabilidad del ARN y la dificultad práctica de obtención de muestras suficientemente recientes de los pacientes; y (9) las pruebas pueden implicar fijar las células antes de que pueda realizarse cualquier análisis de expresión génica, por ejemplo, en presencia o ausencia de reactivos seleccionados.

Recientemente, varios grupos han publicado estudios referentes a la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante análisis de expresión génica de microalineamientos (véase, por ejemplo Golub et al., Science 286:531-537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:1379-13795 (21); Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (Supl. 1): S316-S322 (21); Ramaswamy etal., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (21)). También se han notificado determinadas clasificaciones de cánceres de mama humanos basadas en patrones de expresión génica (Martin et al., Cáncer Res. 6:2232-2238 (2); West et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:11462-11467 (21); Sorlie et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:1869-1874 (21); Yan et al., Cáncer Res. 61:8375-838 (21)). Sin embargo, estos estudios se centran principalmente en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevos conocimientos sobre las relaciones de los genes expresados diferencialmente. Estos estudios no vinculan los hallazgos con estrategias de tratamiento con el fin de mejorar el desenlace clínico de la terapia contra el cáncer, y no abordan el problema de mejorar y normalizar las técnicas existentes de análisis y manipulación de células. El documento WO 27/7544 da a conocer microagregados para evaluar los efectos de diversos tratamientos.

Aunque la biología molecular y la bioquímica modernas han revelado más de 1 genes cuyas actividades influyen

en el comportamiento de células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a determinados fármacos terapéuticos, con unas pocas excepciones, el estado de estos genes no se ha aprovechado con el fin de tomar decisiones clínicas de manera rutinaria sobre los tratamientos farmacológicos. Una notable excepción es el uso de la expresión de la proteína receptora de estrógenos (ER) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes para el tratamiento con fármacos antiestrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.). Sin embargo, para la mayoría de los cánceres, las patologías en la expresión génica pueden ser más sutiles y pueden implicar patrones de expresión de múltiples genes o la expresión de genes en respuesta a estímulos particulares.

El desafío del tratamiento contra el cáncer sigue siendo seleccionar como diana regímenes de tratamiento específicos para distinguir de manera patógena tipos de tumores, y para identificar el tratamiento óptimo tan pronto como sea posible con el fin de optimizar el desenlace. Por tanto, existe la necesidad de pruebas que proporcionen simultáneamente información de pronóstico y/o predictiva sobre las respuestas del paciente a la variedad de opciones de tratamiento.

Existe la necesidad de un método para preparar biopsias de tumores sólidos o células agregadas de otra forma que aborde las desventajas e integre, en un único aparato pequeño y compacto, la función de manipular y preparar muestras de tejido usando etapas controladas, sistemáticas y eficaces; mantener la viabilidad de la muestra de tejido, para permitir la estimulación y/o conservación de las respuestas de diferentes biomarcadores a partir de la misma... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

Método para procesar una muestra de tejido vivo de células agregadas a partir de un sujeto o células cancerosas a partir de un tumor sólido, que comprende:

a) desagregar y dispersar una disolución acuosa que contiene células agregadas vivas obtenidas a partir de un sujeto o células cancerosas a partir de un tumor sólido en al menos una alícuota de prueba en una primera cámara aislada, en la que las células se dispersan usando una cantidad predeterminada de tensión de cizalladura mecánica, de desde 1 hasta 8 dinas/cm2;

b) opcionalmente purificar la alícuota para aumentar el porcentaje de células diana en relación con otros tipos de células contaminantes retirando las células contaminantes;

c) distribuir las células vivas en una o más segundas cámaras aisladas para su análisis en ausencia de cultivo celular; y

caracterizado por que el método comprende además la etapa de

d) analizar las células distribuidas exponiendo las células a al menos un reactivo de prueba para producir un efecto cuantitativo o cualitativo medible sobre uno o más de una biomolécula diana o un biomarcador diana ex vivo, en donde el efecto se identifica mediante una medición de un efecto agonista o antagonista sobre una ruta celular;

en el que las células se procesan en un estado vivo con estrés o activación celular mínimo.

Método según la reivindicación 1, en el que el número total de células procesadas es de desde 1 hasta 1x1®.

Método según una de las reivindicaciones 1-2, en el que la muestra se obtiene usando una técnica de aspiración con aguja fina.

Método según una de las reivindicaciones 1-3, en el que la estabilización de las células vivas distribuidas se completa en el plazo de cuatro horas desde la obtención de la muestra a partir del sujeto.

Método según una de las reivindicaciones 1-4, en el que el efecto cuantitativo o cualitativo es: la activación o inhibición de una ruta celular seleccionada del grupo que consiste en una ruta metabólica, una ruta de replicación, una ruta de señalización celular, una ruta de señalización oncogénica, una ruta apoptótica y una ruta proangiogénica; una medición de un efecto agonista o antagonista sobre un receptor acoplado a proteínas G o un receptor tirosina cinasa, tal como un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR); o el nivel de expresión de un gen seleccionado del grupo que consiste en una familia de genes de expresión precoz o temprana retardada.

Método según una de las reivindicaciones 1-5, en el que el biomarcador ex vivo se selecciona del grupo que consiste en iones, enzimas, lípidos y proteínas modificadas postraducclonalmente.

Método según una de las reivindicaciones 1-6, en el que el reactivo de prueba se selecciona del grupo que consiste en un agente farmacéutico, un agente para estimular una célula, un polipéptido, un polinucleótido, un anticuerpo, un fragmento Fab, un fragmento Fe, ARN, ARNip y una fosfoproteína; seguido por medir un efecto cuantitativo o cualitativo sobre una biomolécula diana o un biomarcador diana ex vivo de la célula dispersada o distribuida.

Método según una de las reivindicaciones 1-6, en el que el reactivo de prueba comprende un agente detectable seleccionado del grupo que consiste en: una enzima, un material fluorescente, material luminiscente, material bioluminiscente, material radiactivo, metal emisor de positrones usando una tomografía por emisión de positrones y un ion de metal paramagnético no radiactivo.

Método según la reivindicación 7 u 8, en el que el reactivo de prueba está precargado en al menos una de las cámaras aisladas antes de que las células cancerosas vivas purificadas se distribuyan en la una o más cámaras aisladas.

Método según la reivindicación 1, en el que la purificación comprende inmunodepleción.

Método según una de las reivindicaciones 1 -1, en el que la etapa de distribución se realiza manualmente o usando un sistema automatizado.

Método según una de las reivindicaciones 1-11, en el que la etapa de desagregación comprende hacer pasar un fluido que comprende células cancerosas de un tumor sólido a través de una punta de pipeta o aguja de un tamaño predeterminado con una fuerza predeterminada de desde 1 hasta 8 dinas/cm2.

13. Método según la reivindicación 1, en el que las células distribuidas tienen más del 75% de viabilidad en comparación con el número de células viables en el fluido antes de la distribución.