Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes.

Método de predicción del resultado de supervivencia basándose en una o más muestras de linfoma difuso de células B grandes

(DLBCL), método que comprende:

a) aislar productos de expresión génica de una o más muestras de biopsia de DLBCL de un sujeto tratado con un régimen terapéutico que incluye quimioterapia y rituximab (R-CHOP);

b) obtener un perfil de expresión génica a partir de los productos de expresión génica, en el que el perfil de expresión comprende un nivel de expresión para cada uno de al menos 31 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB) y al menos 226 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-1;

c) determinar un valor de firma de GCB y un valor de firma estromal-1 a partir del perfil de expresión génica, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 31 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de GCB y el valor de firma de estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 226 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-1;

d) calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia ≥ A - [(x)*(el valor de firma de GCB)] - [(y)*(el valor de firma de estromal-1)], en la que A es un término de desviación, (x) es un factor de escala de entre 0,200 y 0,625, e (y) es un factor de escala de entre 0,800 y 1,250, y

e) determinar el resultado de supervivencia para el sujeto basándose en la puntuación de factor de predicción de supervivencia calculada en la etapa d) para cualquier valor igual fijo de A y para cualquier valor igual fijo de (x) e (y), en el que una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia más favorable y una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia menos favorable para el sujeto.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/046421.

Solicitante: The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: Office Of Technology Transfer National Insitutes of Health 6011 Executive Boulevard Suite 325, MSC 7660 Bethesda, MD 20892-7660 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MULLER-HERMELINK, HANS KONRAD, WRIGHT, GEORGE, OTT,GERMAN, ROSENWALD,ANDREAS, LOPEZ GUILLERMO,ARMANDO, STAUDT,LOUIS M, RIMSZA,LISA, LISTER,ANDREW T, WEISENBURGER,DENNIS, DELABIE,JAN, SMELAND,ERLEND B, HOLTE,HARALD, KVALOY,STEIN, BRAZIEL,RITA M, FISHER,RICHARD I, JARES,PEDRO, GUERRI,ELÍAS CAMPO, JAFFE,ELAINE S, LENZ,GEORG, WYNDHAM,H.WILSON, DAVE,SANDEEP S, GASCOYNE,RANDY D, CONNORS,JOSEPH M, WING,C CHAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/574 (para el cáncer)
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Ilustración 1 de Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes.
Ilustración 2 de Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes.
Ilustración 3 de Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes.
Ilustración 4 de Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes.
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Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes.

Texto extraído del PDF original:

2 552 937

96 Fecha de presentación y número de la solicitud europea:

05.06.2009

E 09759517 (7)

97 Fecha y número de publicación de la concesión europea:

12.08.2015

EP 2294420

72 Inventor/es:

JAFFE, ELAINE S.; LENZ, GEORG; WYNDHAM, H.WILSON.; WRIGHT, GEORGE; DAVE, SANDEEP S.; GASCOYNE, RANDY D.; CONNORS, JOSEPH M.; MÜLLER-HERMELINK, HANS-KONRAD; ROSENWALD, ANDREAS; OTT, GERMAN y WING, C CHAN

74 Agente/Representante:

MILTENYI, Peter

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del

ES 2 552 937 T3

Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

DESCRIPCIÓN

Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes

Antecedentes de la invención

El tratamiento de referencia actual para tratar el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) incluye regímenes quimioterápicos basados en antraciclina tales como CHOP en combinación con la administración del anticuerpo monoclonal anti-CD20, rituximab. Este régimen de combinación (R-CHOP) puede curar aproximadamente al 60% de los pacientes y ha mejorado la supervivencia global de los pacientes con DLBCL en un 10-15% (Coiffier et al., N. Engl. J. Med., 346: 235-42 (2002)). No obstante, se desconoce la base molecular de la respuesta o resistencia a esta terapia.

El DLBCL es una enfermedad molecularmente heterogénea (Staudt et al., Adv. Immunol., 87: 163-208 (2005)), y diferentes subtipos moleculares de DLBCL pueden tener pronósticos muy diferentes tras el tratamiento. Por ejemplo, la obtención de perfiles de expresión génica ha identificado dos subtipos moleculares de DLBCL que son biológica y clínicamente distintos (Rosenwald et al., N. Engl. J. Med., 346: 1937-47 (2002); Alizadeh et al., Nature, 403: 503-11 (2000)). El subtipo de DLBCL de tipo de células B de centro germinal (GCB) surge probablemente a partir de células B de centro germinal normales, mientras que el subtipo de DLBCL de tipo de células B activadas (ABC) puede surgir a partir de una célula B de centro posgerminal que se bloquea durante la diferenciación plasmacítica. Muchos mecanismos oncogénicos distinguen estos subtipos: Los DLBCL GCB tienen translocaciones recurrentes t(14,18), mientras que los DLBCL ABC tienen trisomía 3 recurrente y deleción del locus INK4a/ARF así como activación constitutiva de la ruta de señalización anti-apoptótica de NFkB (Rosenwald et al., N. Engl. J. Med., 346: 1937-47 (2002); Bea et al., Blood, 106: 3183-90 (2005); Tagawa et al., Blood, 106: 1770-77 (2005); Davis et al., J. Exp. Med., 194:1861-74 (2001); Ngo et al., Nature, 441: 106-10 (2006); Lenz et al., Science, 319: 1676-79 (2008)). Cuando se trata con quimioterapia de tipo CHOP, las tasas de supervivencia global de los pacientes con DLBCL GCB y DLBCL ABC fueron del 60% y el 30%, respectivamente (Wright et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 100: 9991-96 (2003)). Por tanto, el pronóstico para los diferentes DLBCL puede variar ampliamente.

Un enfoque analítico separado identificó cuatro firmas de expresión génica que reflejan distintos atributos tumorales de DLBCL y que se asociaron con distintos perfiles de supervivencia en pacientes con DLBCL tratados con CHOP (Rosenwald et al., N. Engl. J. Med., 346: 1937-47 (2002)). Una firma de “células B de centro germinal” (GCB) se asoció con un pronóstico favorable y estaba relacionada con la distinción entre DLBCL GCB y ABC. La firma de “proliferación” se asoció con un pronóstico adverso e incluyó MYC y sus genes diana. La firma de “MHC de clase II” estaba silenciada en las células malignas en un subconjunto de casos de DLBCL, un acontecimiento que se asoció con supervivencia inferior (Rosenwald et al., N. Engl. J. Med., 346: 1937-47 (2002); Rimsza et al., Blood, 103: 4251- 58 (2004)). Una cuarta firma de pronóstico, denominada firma de “ganglio linfático” se asoció con pronóstico favorable e incluyó componentes de la matriz extracelular, lo que sugiere que refleja la naturaleza de las células no malignas infiltrantes de tumor. Estas firmas predijeron la supervivencia de una forma estadísticamente independiente, lo que indica que múltiples variables biológicas dictan la respuesta a la quimioterapia con CHOP en DLBCL.

Los informes han sugerido que el beneficio de la inmunoterapia con rituximab podría estar limitado a determinados subtipos moleculares de DLBCL. La alta expresión de BCL-2 o la baja expresión de BCL-6 se asoció con supervivencia inferior con terapia con CHOP. Sin embargo, esta distinción desapareció con la terapia con R-CHOP (Mounier et al., Blood, 101: 4279-84 (2003); Winter et al., Blood, 107: 4207-13 (2006)). También se ha usado inmunohistoquímica para distinguir los DLBCL con un centro germinal frente a fenotipo de centro posgerminal. Aunque tales fenotipos inmunohistoquímicos fueron significativos desde el punto de vista del pronóstico en casos tratados con CHOP, no fueron de valor pronóstico para casos tratados con R-CHOP (Nyman et al., Blood, 109: 4930-35 (2007)).

El documento WO2005/024043 da a conocer un método para predecir la supervivencia en un sujeto con linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), que comprende las etapas de: a). obtener una biopsia de dicho sujeto, y aislar ARN de las muestras; b). obtener datos de expresión génica para un conjunto de genes en dicha muestra de biopsia. El nivel de expresión génica de los genes de un centro germinal de genes de células B comprende una firma de expresión génica de GCB, el nivel de expresión génica de genes de un ganglio linfático comprende una firma de expresión génica de ganglio linfático, el nivel de expresión génica de genes de proliferación comprende una firma de expresión génica de proliferación y el nivel de expresión génica de genes de actividad de MHC de clase II comprende una firma de expresión génica de MHC de clase II; c). obtener el promedio del nivel de expresión génica de los genes de dichas firmas para obtener dichos valores de firma de expresión génica respectivos; y d). calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia usando una ecuación, en el que una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia está asociada con peor supervivencia.

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E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   El documento WO2005/024043 no menciona casos tratados con R-CHOP.

Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos métodos para distinguir entre subtipos de DLBCL que sean significativos desde el punto de vista del pronóstico para pacientes tratados con R-CHOP.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona métodos y matrices relacionadas con un factor de predicción de supervivencia basado en la expresión génica para pacientes con DLBCL, incluyendo pacientes tratados con el tratamiento de referencia actual, que incluye quimioterapia y la administración de rituximab.

La invención proporciona un método de predicción del resultado de supervivencia basándose en una o más muestras de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). El método incluye aislar productos de expresión génica de una o más muestras de biopsia de DLBCL de un sujeto tratado con un régimen terapéutico que incluye quimioterapia y rituximab (R-CHOP). El método comprende además obtener un perfil de expresión génica a partir de los productos de expresión génica, en el que el perfil de expresión comprende un nivel de expresión para cada uno de al menos 31 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB) y al menos 226 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal-1. El método también incluye determinar un valor de firma de GCB y un valor de firma de estromal-1 a partir del perfil de expresión génica, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 31 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de GCB y el valor de firma de estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 226 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal-1. Se calcula una puntuación de factor de predicción de supervivencia que es igual a A - [(x)*(el valor de firma de GCB)] - [(y)*(el valor de firma de estromal-1)], en el que A es un término de desviación, (x) es un factor de escala de entre 0,200 y 0,625, e (y) es un factor de escala de entre 0,800 y 1,250. El método incluye además determinar el resultado de supervivencia para el sujeto basándose en la puntuación de factor de predicción de supervivencia calculada para cualquier valor igual fijo de A y para cualquier valor igual fijo de (x) e (y), en el que una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia más favorable y una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia menos favorable para el sujeto.

La invención también proporciona un método de predicción del resultado de supervivencia basándose en una o más muestras de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). El método comprende aislar productos de expresión génica de una o más muestras de biopsia de DLBCL de un sujeto tratado con un régimen terapéutico que incluye quimioterapia y rituximab (R-CHOP). El método incluye además obtener un perfil de expresión génica a partir de los productos de expresión génica, en el que el perfil de expresión génica comprende un nivel de expresión para cada uno de al menos 31 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB), al menos 226 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal- 1 y al menos 58 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal-2. El método también comprende determinar un valor de firma de GCB, un valor de firma de estromal-1 y un valor de firma de estromal-2 a partir del perfil de expresión génica, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 31 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de GCB y el valor de firma de estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 226 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal-1 y el valor de firma de estromal-2 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 58 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal-2. Se calcula una puntuación de factor de predicción de supervivencia usando la ecuación: puntuación de factor de predicción de supervivencia = A - [(x)*(el valor de firma de GCB)] - [(y)*(el valor de firma de estromal-1)] + [(z)*(el valor de firma de estromal-2)], en la que A es un término de desviación y (x) es un factor de escala de entre 0,200 y 0,625, (y) es un factor de escala de entre 0,800 y 1,250 y (z) es un factor de escala de entre 0,450 y 0,900.

El método comprende además calcular la probabilidad de un resultado de supervivencia para el sujeto más allá de una cantidad de tiempo t tras el tratamiento para DLBCL, en el que la probabilidad del resultado de supervivencia del sujeto P(SO) se calcula usando la ecuación: P(SO) = SO0(t)(exp((s)*puntuación de factor de predicción de supervivencia)), en la que SO0(t) es la probabilidad del resultado de supervivencia, que corresponde al valor de tiempo más largo menor que t en una curva de resultado de supervivencia, y en la que (s) es un factor de escala de entre 0,970 y 0,980.

La invención proporciona además una matriz seleccionado como diana que comprende al menos una sonda o conjunto de sondas para cada gen en (a) una firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB) que comprende al menos 31 de los genes de firma de GCB enumerados en la tabla 1, (b) una firma de expresión génica de estromal-1 que comprende al menos 226 de los genes de firma de estromal-1 enumerados en la tabla 1 y (c) una firma de expresión génica de estromal-2 que comprende al menos 58 de los genes de firma de estromal-2 enumerados en la tabla 1, en la que la matriz comprende sondas para menos de 10.000 genes.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia libre de progresión frente al tiempo (en años) de pacientes con DLBCL GCB y DLBCL ABC. La gráfica indica que los pacientes con GCB tienen una probabilidad más favorable, es decir, superior de tasa de supervivencia libre de 3

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   progresión que los pacientes con ABC durante al menos cinco años tras la terapia con R-CHOP.

La figura 1B es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) de pacientes con DLBCL GCB y DLBCL ABC. La gráfica indica que los pacientes con GCB tienen una probabilidad más favorable, es decir, superior de supervivencia global que los pacientes con ABC durante al menos cinco años tras la terapia con R-CHOP.

La figura 1C es una serie de cuatro gráficas de estimación de Kaplan-Meier que representan las probabilidades de supervivencia global frente al tiempo (en años) en pacientes con DLBCL. Cada una de las cuatro gráficas correlaciona la probabilidad de supervivencia global con la firma de expresión génica de ganglio linfático/estromal-1, células B de centro germinal, proliferación o MHC de clase II, respectivamente. Además, en cada gráfica, se usó la expresión promedio de los genes de firma en cada muestra de biopsia para clasificar los casos y dividir la cohorte en grupos de cuartil tal como se indica.

La figura 2A es un par de gráficas de estimación de Kaplan-Meier que representan la probabilidad de supervivencia libre de progresión y la probabilidad de supervivencia global, tal como se indica, frente al tiempo (en años) entre pacientes con DLBCL tratados con R-CHOP. Las muestras de pacientes se clasificaron según un modelo de dos variables creado usando las firmas de células B de centro germinal (GCB) y estromal-1 y se dividieron entre los grupos de cuartil.

La figura 2B es un par de gráficas de Kaplan-Meier que representan la probabilidad de supervivencia libre de progresión y la probabilidad de supervivencia global, tal como se indica, frente al tiempo (en años) entre pacientes con DLBCL tratados con R-CHOP. Las muestras de pacientes se clasificaron según una puntuación de factor de predicción de supervivencia derivada de un modelo que incorpora las firmas de células B de centro germinal, estromal-1 y estromal-2 y se dividieron entre los grupos de cuartil.

La figura 2C es una serie de tres gráficas de estimación de Kaplan-Meier que representan la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) entre pacientes con DLBCL tratados con R-CHOP en los grupos de riesgo de IPI bajo, intermedio o alto indicados. Se estratificaron las muestras de pacientes según la misma puntuación de factor de predicción de supervivencia usada en la figura 2B, excepto porque se fusionaron los cuartiles primero y segundo, y se fusionaron los cuartiles tercero y cuarto.

La figura 3 representa los niveles de expresión de los genes de firma de células GCB, estromal-1 y estromal-2 indicados en muestras de biopsia de DLBCL ABC, GCB y sin clasificar. Se representan los niveles de expresión génica relativa según la escala mostrada. En la parte inferior se muestran los promedios de firma para cada paciente. También se muestra la puntuación estromal, que es el componente del modelo de supervivencia al que contribuye la diferencia entre los promedios de firma de estromal-2 y estromal-1. Se muestra la puntuación de factor de predicción de supervivencia para cada paciente y se usó para ordenar las clases, tras agrupar en las categorías de DLBCL ABC, DLBCL GCB y sin clasificar.

La figura 4A representa la expresión génica relativa de firmas de estromal-1, estromal-2 y células B de centro germinal en subpoblaciones malignas CD19+ y no malignas CD19- de células aisladas de tres muestras de biopsia de pacientes con DLBCL. Los genes de firma estromal-1 y estromal-2 se expresaban más en las células no malignas, mientras que los genes de firma de células B de centro germinal se expresaban más en las células malignas. Se representan las razones de log2 de niveles de expresión génica en la subpoblación CD19- con respecto a los de las subpoblaciones CD19+ según la escala mostrada.

La figura 4B representa los resultados del análisis de enriquecimiento génico que compara la firma génica de estromal-1 con las firmas de mesénquima-1 y mesénquima-2 (de células de origen mesenquimal normales), con una firma de monocitos expresada más en monocitos de sangre normales que en células B, T y NK de la sangre, y en una firma de células pan-T expresadas más en células T de la sangre que en células B, células NK y monocitos de la sangre. Aunque se observó una relación entre la firma de estromal-1 y las firmas de mesénquima-1, mesénquima- 2 de monocitos, no se observó ninguna relación entre la firma de estromal-1 y una firma de células pan-T expresada más en células T de la sangre que en células B, células NK y monocitos de la sangre. Los niveles de expresión génica relativa se expresan según la escala mostrada.

La figura 5A es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) en casos de DLBCL segregados según los niveles de expresión de proteína SPARC, tal como se indica.

La figura 5B es un par de imágenes que muestran la identificación de vasos sanguíneos tumorales mediante análisis de inmunohistoquímica de células endoteliales CD34+ en biopsias de DLBCL representativas que tienen densidad de vasos sanguíneos baja o alta (objetos CD34+/µM2), tal como se indica.

La figura 5C es una gráfica que representa la correlación entre la densidad de vasos sanguíneos tumorales y la puntuación estromal en biopsias de DLBCL analizadas.

La figura 6A es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia global 4

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   frente al tiempo (en años) para pacientes con DLBCL tratados con “LLMPP CHOP” tras la terapia. La gráfica indica que en esta cohorte los pacientes con DLBCL GCB muestran una supervivencia global significativamente superior en comparación con pacientes con DLBCL ABC tras la terapia con CHOP.

La figura 6B es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) para pacientes con DLBCL tratados con “MMMLNP CHOP” tras la terapia. En esta cohorte, los pacientes con DLBCL GCB muestran una supervivencia global significativamente superior en comparación con pacientes con DLBCL ABC tras la terapia con CHOP.

La figura 7 es un conjunto de cuatro gráficas de estimación de Kaplan-Meier que representan la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) en una cohorte de “MMMLNP CHOP”. Cada uno de las cuatro gráficas correlaciona la probabilidad de supervivencia global con la firma de expresión génica de ganglio linfático/estromal-1, células B de centro germinal, proliferación o MHC de clase II, respectivamente. Además, en cada gráfica, se usó la expresión promedio de los genes de firma en cada muestra de biopsia para clasificar los casos y dividir la cohorte en grupos de cuartil tal como se indica.

La figura 8A es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) en una cohorte de “LLMPP CHOP”, que se dividió según los niveles de expresión de firma de MHC de clase II. Los pacientes con expresión baja de firma de MHC de clase II tienen una supervivencia global significativamente inferior en comparación con pacientes con expresión normal de MHC de clase II.

La figura 8B es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) en una cohorte de “MMMLNP CHOP”, que se dividió según los niveles de expresión de firma de MHC de clase II. Los pacientes con expresión baja de firma de MHC de clase II tienen supervivencia global significativamente inferior en comparación con pacientes con expresión normal de MHC de clase II.

La figura 8C es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de supervivencia global frente al tiempo (en años) en una cohorte de “LLMPP R-CHOP”, que se dividió según los niveles de expresión de firma de MHC de clase II. No hubo diferencia significativa en la supervivencia global de pacientes con expresión baja de firma de MHC de clase II en comparación con pacientes con expresión normal de MHC de clase II.

La figura 9A es un par de gráficas de estimación de Kaplan-Meier que representan las probabilidades de supervivencia libre de progresión o supervivencia global, tal como se indica, frente al tiempo (en años) entre pacientes agrupados en cuartiles según un modelo de expresión génica que consiste en firma de estromal-1, firma de GCB y firma 122 tras la terapia con R-CHOP.

La figura 9B es un par de gráficas de estimación de Kaplan-Meier que representan las probabilidades de supervivencia global frente al tiempo (en años) entre pacientes de la cohorte de “MMMLNP CHOP” agrupados en cuartiles según un modelo de expresión génica que consiste en o bien firma de estromal-1 y firma de GCB o bien firma de estromal-1, GCB y firma de 122, tal como se indica, tras la terapia con CHOP.

La figura 9C es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa las probabilidades de supervivencia global frente al tiempo (en años) entre pacientes de la cohorte de “MMMLNP CHOP” agrupados en cuartiles según un modelo de expresión génica que consiste en firma de estromal-1, firma de GCB y firma de estromal-2 tras la terapia con CHOP.

La figura 10A es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la supervivencia global entre pacientes de grupo de riesgo de índice de pronóstico internacional (IPI) revisado bajo estratificados según la puntuación de factor de predicción de resultado basado en la expresión génica. Tras agrupar a los pacientes en cuartiles según la puntuación de factor de predicción de resultado basado en la expresión génica, se fusionaron los cuartiles 1 y 2 (puntuación de modelo baja), y se fusionaron los cuartiles 3 y 4 (puntuación de modelo alta).

La figura 10B es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la supervivencia global entre pacientes de grupo de riesgo de índice de pronóstico internacional (IPI) revisado intermedio estratificados según el factor de predicción de resultado basado en la expresión génica. Tras agrupar a los pacientes en cuartiles según la puntuación de factor de predicción de resultado basado en la expresión génica, se fusionaron los cuartiles 1 y 2 (puntuación de modelo baja), y se fusionaron los cuartes 3 y 4 (puntuación de modelo alta).

La figura 10C es una gráfica de estimación de Kaplan-Meier que representa la supervivencia global entre pacientes de grupo de riesgo de índice de pronóstico internacional (IPI) revisado alto estratificados según el factor de predicción de resultado basado en la expresión génica. Tras agrupar a los pacientes en cuartiles según la puntuación de factor de predicción de resultado basado en la expresión génica, se fusionaron los cuartiles 1 y 2 (puntuación de modelo baja), y se fusionaron los cuartiles 3 y 4 (puntuación de modelo alta).

La figura 11 representa la expresión génica de firma mesenquimal-1 normal y firma mesenquimal-2 normal en diversos tejidos normales.

Descripción detallada de la invención

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   La invención proporciona un factor de predicción de supervivencia basado en la expresión génica para pacientes con DLBCL, incluyendo aquellos pacientes que reciben el tratamiento de referencia actual, R-CHOP. El factor de predicción de supervivencia puede usarse para determinar la probabilidad relativa de un resultado de supervivencia en un sujeto específico. El factor de predicción de supervivencia también puede usarse para predecir; es decir, determinar la probabilidad esperada de que se produzca un resultado de supervivencia en un periodo definido tras el tratamiento para DLBCL. Tal información de pronóstico puede ser muy útil tanto para el paciente como para el médico. Los pacientes con puntuaciones de factor de predicción de supervivencia que indican un resultado inferior con terapia con R-CHOP podrían ser candidatos a un régimen terapéutico diferente si, por ejemplo, experimentan recidiva a partir del tratamiento con R-CHOP. El factor de predicción de supervivencia también puede usarse en el diseño de estudios clínicos y análisis de datos clínicos para proporcionar un estudio cuantitativo de los tipos de pacientes con DLBCL de los que se reunieron datos clínicos. El factor de predicción puede usarse para mejorar una o más comparaciones entre datos de fuentes diferentes (por ejemplo, de ensayos clínicos diferentes), permitiendo comparaciones con respecto a características de pacientes, que se manifiestan en los niveles de expresión génica que determinan y, por tanto, se incorporan en el factor de predicción. Además, la invención proporciona información que puede ser muy valiosa para un paciente con DLBCL, puesto que el paciente puede verse inclinado a organizar su vida de manera muy diferente, dependiendo de si el paciente tiene una probabilidad de supervivencia alta o baja y/o permanece libre de progresión durante un periodo de tiempo tras el tratamiento.

En el presente documento se usan las siguientes abreviaturas: ABC, linfoma difuso de células B grandes de tipo de células B activadas; CHOP, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona; IC, intervalo de confianza; COP, ciclofosfamida, vincristina y prednisona; DLBCL, linfoma difuso de células B grandes; DOD, muerto por enfermedad; ECOG, Eastern Cooperative Oncology Group (grupo oncológico cooperativo del este); FACS, clasificación celular activada por fluorescencia; FH, hiperplasia folicular; FISH, hibridación in situ por fluorescencia; FL, linfoma folicular; GC, centro germinal; GCB, linfoma difuso de células B grandes de tipo de células B de centro germinal; IPI, índice de pronóstico internacional; LPC, linfoma linfoplasmacítico; MHC, complejo mayor de histocompatibilidad; NA, no disponible o no aplicable; NK, linfocito citolítico natural; PCR, reacción en cadena de la polimerasa; RQ-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa; SAGE, análisis en serie de la expresión génica; WHO, Organización Mundial de la Salud.

El término “R-CHOP” tal como se usa en el presente documento se refiere generalmente a cualquier régimen terapéutico que incluye quimioterapia y la administración de rituximab. Por consiguiente, aunque el término puede referirse a la terapia de combinación con rituximab que incluye un régimen de CHOP de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona, el término R-CHOP también puede referirse a terapia que incluye rituximab en combinación con un régimen quimioterápico distinto de CHOP.

El término “datos de expresión génica” así como “nivel de expresión génica” tal como se usan en el presente documento se refiere a información en relación con el nivel de expresión relativo o absoluto de un gen o conjunto de genes en una célula o grupo de células. El nivel de expresión de un gen puede determinarse basándose en el nivel de ARN, tal como ARNm, codificado por el gen. Alternativamente, el nivel de expresión puede determinarse basándose en el nivel de un polipéptido o fragmento del mismo codificado por el gen. Los datos de expresión génica pueden adquirirse para una célula individual, o para un grupo de células tal como una muestra de tumor o biopsia. Los datos de expresión génica y los niveles de expresión génica pueden almacenarse en medios legibles por ordenador, por ejemplo, el medio legible por ordenador usado conjuntamente con un dispositivo de lectura de chip o micromatriz. Tales datos de expresión génica pueden manipularse para generar firmas de expresión génica.

El término “micromatriz” “matriz,” o “chip” se refiere a una pluralidad de sondas de ácido nucleico acopladas a la superficie de un sustrato en ubicaciones conocidas diferentes. El sustrato es preferiblemente sólido. Se han descrito micromatrices de manera general en la técnica en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.143.854 (Pirrung), 5.424.186 (Fodor), 5.445.934 (Fodor), 5.677.195 (Winkler), 5.744.305 (Fodor), 5.800.992 (Fodor) y 6.040.193 (Winkler) y Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991).

El término “firma de expresión génica” o “firma” tal como se usa en el presente documento se refiere a un grupo de genes que se expresan de manera coordinada. Los genes que constituyen esta firma pueden expresarse en un linaje celular, fase de diferenciación específicos, o durante una respuesta biológica particular. Los genes pueden reflejar aspectos biológicos de los tumores en los que se expresan, tales como la célula de origen del cáncer, la naturaleza de las células no malignas en la biopsia y los mecanismos oncogénicos responsables del cáncer (Shaffer et al., Immunity, 15: 375-385 (2001)). Los ejemplos de firmas de expresión génica incluyen firmas de ganglio linfático, proliferación (Rosenwald et al., New Engl. J. Med., 346: 1937-1947 (2002)), MHC de clase II, DLBCL ABC alto, diferenciación de células B, células T, macrófagos, respuesta inmunitaria-1 y respuesta inmunitaria-2 (publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2007/0105136 (Staudt)).

El término “valor de firma” tal como se usa en el presente documento corresponde a una combinación matemática de mediciones de niveles de expresión de los genes en una firma de expresión génica. Un valor de firma a modo de ejemplo es un promedio de firma que corresponde al promedio o media de los niveles de expresión individuales en una firma de expresión génica.

El término “puntuación de factor de predicción de supervivencia” tal como se usa en el presente documento se 6

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   refiere a una puntuación generada por un modelo de múltiples variables usado para predecir la supervivencia basándose en la expresión génica. Se prevé que un sujeto con una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia tendrá una supervivencia inferior que un sujeto con una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia.

El término “supervivencia” o “supervivencia global” tal como se usa en el presente documento puede referirse a la probabilidad o posibilidad de que un sujeto sobreviva durante un periodo de tiempo particular. Alternativamente, puede referirse al periodo probable de supervivencia para un sujeto, tal como la media o la mediana esperada del tiempo de supervivencia para un sujeto con un patrón de expresión génica particular.

El término “supervivencia libre de progresión” tal como se usa en el presente documento puede referirse a la probabilidad o posibilidad de que un sujeto sobreviva sin progresión o empeoramiento significativo de la enfermedad durante un periodo de tiempo particular. Alternativamente, puede referirse al periodo probable de supervivencia para un sujeto sin progresión o empeoramiento significativo de la enfermedad, tal como la media o la mediana esperada del tiempo de supervivencia para un sujeto con un patrón de expresión génica particular sin progresión o empeoramiento significativo de la enfermedad.

El término “resultado de supervivencia” tal como se usa en el presente documento puede referirse a supervivencia, supervivencia global o supervivencia libre de progresión.

El término “factor de escala” tal como se usa en el presente documento se refiere a un factor que relaciona el cambio en la expresión génica con el pronóstico. Un ejemplo de un factor de escala es un factor obtenido maximizando las probabilidades parciales del modelo de riesgos proporcionales de Cox.

Las firmas de expresión génica, los valores de firma, las puntuaciones de factor de predicción de supervivencia, las puntuaciones estromales, las curvas de estimación de supervivencia y las probabilidades de supervivencia dadas a conocer en el presente documento pueden almacenarse en formato codificado digitalmente en medios legibles por ordenador, por ejemplo, medios legibles por ordenador usados conjuntamente con dispositivos de lectura de chip o micromicromatriz o medios legibles por ordenador usados para almacenar datos de pacientes durante el tratamiento para DLBCL. Tales medios y dispositivos especializados que los usan, por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico y clínicas, se conocen en la técnica.

La invención proporciona un método para predecir un resultado de supervivencia en un sujeto al que se le diagnostica DLBCL usando datos de expresión génica. Tales datos pueden reunirse usando cualquier método eficaz de cuantificación de la expresión génica. Por ejemplo, los datos de expresión génica pueden medirse o estimarse usando una o más micromicromatrices. Las micromatrices pueden ser de cualquier tipo eficaz, incluyendo, pero sin limitarse a, a base de ácidos nucleicos o a base de anticuerpos. La expresión génica también puede medirse mediante una variedad de otras técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, PCR, RT-PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, amplificación de ARN, hibridación in situ, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, FACS, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) (Velculescu et al., Science, 270: 484-87 (1995)), hibridación por transferencia de tipo Northern o hibridación por inmunotransferencia de tipo Western.

Las micromatrices de ácidos nucleicos comprenden generalmente sondas de ácidos nucleicos derivadas de genes individuales y colocadas en una matriz ordenada o sobre un soporte. Este soporte puede ser, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio, una membrana de nailon o una oblea de silicio. Los patrones de expresión génica en una muestra se obtienen hibridando la micromatriz con el producto de expresión génica de la muestra. Este producto de expresión génica puede ser, por ejemplo, ARNm celular total, ARNr o ADNc obtenido mediante transcripción inversa del ARN celular total. El producto de expresión génica de una muestra se marca con un marcador radiactivo, fluorescente u otro marcador para permitir la detección. Tras la hibridación, se lava la micromatriz y se detecta la hibridación del producto de expresión génica para cada sonda de ácido nucleico en la micromatriz y se cuantifica usando un dispositivo de detección tal como un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad o microscopio confocal de barrido.

Hay dos clases amplias de micromatrices: alineamientos de ADNc y de oligonucleótidos. Los alineamientos de ADNc consisten en cientos o miles de sondas de ADNc inmovilizadas sobre un soporte sólido. Estas sondas de ADNc tienen habitualmente un tamaño de 100 nucleótidos o más. Hay dos diseños usados comúnmente para alineamientos de ADNc. El primero es el alineamiento de filtro de nitrocelulosa, que se prepara generalmente mediante disposición en manchas robótica de fragmentos de ADN purificados o lisados de bacterias que contienen clones de ADNc sobre un filtro de nitrocelulosa (Southern et al., Genomics, 13: 1008-17 (1992); Southern et al., Nucl Acids Res 22: 1368-73 (1994); Gress et al., Oncogene, 13: 1819-30 (1996); Pietu et al., Genome Res., 6: 492-503 (1996)). Los otros alineamientos de ADNc usados comúnmente se fabrican mediante disposición en manchas robótica de fragmentos de PCR de clones de ADNc sobre portaobjetos de vidrio de microscopio (Schena et al., Science, 270: 467-70 (1995); DeRisi et al., Nature Genet., 14: 457-60 (1996); Schena et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 93: 10614-19 (1996); Shalon et al., Genome Res., 6: 639-45 (1996); DeRisi et al., Science, 278: 680-86 (1997); Heller et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 94: 2150-55 (1997); Lashkari et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 94: 13057- 62 (1997)). Estas micromatrices de ADNc se hibridan simultáneamente con dos sondas de ADNc fluorescentes, marcada cada una con un colorante fluorescente diferente (normalmente Cy3 o Cy5). En este formato, la expresión 7

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   de ARNm relativa en dos muestras se compara directamente para cada gen en la micromatriz. Los alineamientos de oligonucleótidos difieren de los alineamientos de ADNc en que las sondas tienen oligonucleótidos de 20 a 25 meros. Los alineamientos de oligonucleótidos se producen generalmente mediante síntesis de oligonucleótidos in situ conjuntamente con técnicas de enmascaramiento fotolitográfico (Pease et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 91: 5022- 26 (1994); Lipshutz et al., Biotechniques 19: 442-47 (1995); Chee et al., Science, 274: 610-14 (1996); Lockhart et al., Nature Biotechnol., 14: 1675-80 (1996); Wodicka et al., Nature Biotechnol., 15: 1359-6714 (1997)). El soporte sólido para los alineamientos de oligonucleótidos es normalmente una superficie de vidrio o de silicio.

Se han descrito métodos y técnicas aplicables a la síntesis y el uso de alineamientos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.143.854 (Pirrung), 5.242.974 (Holmes), 5.252.743 (Barrett), 5.324.633 (Fodor), 5.384.261 (Winkler), 5.424.186 (Fodor), 5.445.934 (Fodor), 5.451.683 (Barrett), 5.482.867 (Barrett), 5.491.074 (Aldwin), 5.527.681 (Holmes), 5.550.215 (Holmes), 5.571.639 (Hubbell), 5.578.832 (Trulson), 5.593.839 (Hubbell), 5.599.695 (Pease), 5.624.711 (Sundberg), 5.631.734 (Stern), 5.795.716 (Chee), 5.831.070 (Pease), 5.837.832 (Chee), 5.856.101 (Hubbell), 5.858.659 (Sapolsky), 5.936.324 (Montagu), 5.968.740 (Fodor), 5.974.164 (Chee), 5.981.185 (Matson), 5.981.956 (Stern), 6.025.601 (Trulson), 6.033.860 (Lockhart), 6.040.193 (Winkler), 6.090.555 (Fiekowsky) y 6.410.229 (Lockhart) y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0104411 (Fodor).

Los micromatrices pueden producirse generalmente usando una variedad de técnicas, tales como métodos de síntesis mecánica o dirigida por luz que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y métodos de síntesis en fase sólida. Se describen técnicas para la síntesis de micromatrices usando métodos de síntesis mecánica en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.384.261 (Winkler) y 6.040.193 (Winkler). Aunque se prefiere una superficie de alineamiento plana, la micromatriz puede fabricarse sobre una superficie de prácticamente cualquier forma, o incluso sobre una multiplicidad de superficies. Las micromatrices pueden ser ácidos nucleicos sobre perlas, geles, superficies poliméricas, fibras tales como fibras ópticas, vidrio o cualquier otro sustrato apropiado. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.708.153 (Dower), 5.770.358 (Dower), 5.789.162 (Dower), 5.800.992 (Fodor) y 6.040.193 (Winkler).

Las micromatrices pueden empaquetarse de tal manera que se permite el uso diagnóstico, o pueden ser dispositivos de todo incluido. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.856.174 (Lipshutz) y 5.922.591 (Anderson).

Se dispone comercialmente de micromatrices dirigidas a una variedad de fines de Affymetrix (Santa Clara, CA). Por ejemplo, estas micromatrices pueden usarse para genotipado y monitorización de la expresión génica.

Los datos de expresión génica pueden usarse para identificar genes que se regulan de manera coordinada. Los genes que codifican para componentes del mismo complejo de proteínas de múltiples subunidades a menudo se regulan de manera coordinada. También se observa regulación coordinada entre genes cuyos productos funcionan en un programa de diferenciación común o en la misma ruta de respuesta fisiológica. La reciente aplicación de la obtención de perfiles de expresión génica al sistema inmunitario ha mostrado que la diferenciación y activación de linfocitos van acompañadas por cambios paralelos en la expresión entre cientos de genes. Pueden usarse bases de datos de expresión génica para interpretar los cambios patológicos en la expresión génica que acompañan a autoinmunidad, deficiencias inmunitarias, cánceres de células inmunitarias y de respuestas inmunitarias normales.

El examen y la interpretación de grandes cuerpos de datos relativos de expresión génica es una tarea formidable. Esta terea se facilita en gran medida por algoritmos diseñados para organizar los datos de forma que destacan características sistemáticas, y mediante herramientas de visualización que representan la expresión diferencial de cada gen como intensidades y matices de color variables (Eisen et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 95: 14863-68 (1998)). El desarrollo de micromatrices, que pueden generar cantidades masivas de datos de expresión en un solo experimento, ha aumentando en gran medida la necesidad de métodos más rápidos y más eficaces de análisis de los conjuntos de datos de expresión a gran escala. Para utilizar eficazmente los datos de expresión génica de micromatrices para la predicción de supervivencia en pacientes con DLBCL, existe la necesidad de desarrollar nuevos algoritmos que puedan identificar información importante y convertirla en un formato más manejable. Además, las micromatrices usadas para generar estos datos pueden estar optimizadas para incorporar conjuntos de sondas que son útiles para la predicción del resultado de supervivencia.

El análisis matemático de los datos de expresión génica es una ciencia que evoluciona rápidamente basada en una ciencia matemática rica de reconocimiento de patrones desarrollada en otros contextos (Kohonen, Self-Organizing Maps, Springer Press (Berlín 1997)). Puede usarse el análisis matemático de los datos de expresión génica, por ejemplo, para identificar grupos de genes que se regulan de manera coordinada dentro de un sistema biológico, para reconocer e interpretar similitudes entre muestras biológicas basándose en similitudes en patrones de expresión génica, y/o para reconocer e interpretar aquellas características de un patrón de expresión génica que están relacionadas con procesos o fenotipos biológicos distintos.

El análisis matemático de los datos de expresión génica a menudo comienza estableciendo el patrón de expresión para cada gen sobre un alineamiento a través de un número (n) de muestras experimentales. El patrón de expresión de cada gen puede representarse por un punto en un espacio n-dimensional, especificándose cada coordenada mediante una medición de expresión en una de las n muestras (Eisen et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 95: 14863- 8

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   68 (1998)). Entonces puede aplicarse un algoritmo de agrupamiento que usa métricas de distancia para localizar agrupaciones de genes en este espacio n-dimensional. Estas agrupaciones indican genes con patrones similares de variación en la expresión a lo largo de una serie de experimentos. Los métodos de agrupamiento que se han aplicado a datos de micromatrices en el pasado incluyen agrupamiento jerárquico (Eisen et al., citado anteriormente), mapas de auto-organización (SOM) (Tamayo et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 96: 2907-12 (1999)), k-medias (Tavazoie et al., Nature Genet., 22: 281-85 (1999)) y apareamiento determinístico (Alon et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 96: 6745-50 (1999)).

Puede requerirse una variedad de algoritmos diferentes, destacando cada uno características de orden distinto de los datos, para recoger el conocimiento biológico máximo de un conjunto de muestras (Alizadeh et al., J. Clin.

Immunol., 18: 373-79 (1998)). Uno de tales algoritmos, el agrupamiento jerárquico, comienza determinando los coeficientes de correlación de expresión génica para cada par de los n genes estudiados. Los genes con coeficientes de correlación de expresión génica similares se agrupan uno junto al otro de forma jerárquica. Generalmente, genes con patrones de expresión similares en un conjunto de condiciones particulares pueden codificar para productos proteicos con papeles relacionados en la adaptación fisiológica a esas condiciones. Los genes novedosos de función desconocida que se agrupan con un gran grupo de genes relacionados funcionalmente participan posiblemente en procesos biológicos similares o relacionados. Asimismo, otros métodos de agrupamiento mencionados en el presente documento también pueden agrupar entre sí genes que codifican para proteínas con función biológica relacionada.

En tales métodos de agrupamiento, los genes que se agrupan entre sí reflejan una función biológica particular, y se denominan firmas de expresión génica (Shaffer et al., Immunity 15: 375-85 (2001)). Un tipo general de firma de expresión génica incluye genes que se expresan de manera característica en un tipo de célula particular o en una fase de diferenciación o activación celular particular. Otro tipo general de firma de expresión génica incluye genes que se regulan en su expresión por un proceso biológico particular tal como proliferación, o por la actividad de un factor de transcripción o ruta de señalización particular.

El patrón de expresión génica en una muestra biológica puede proporcionar una imagen molecular particular y accesible de su estado e identidad funcionales (DeRisi et al., Science, 278: 680-86 (1997); Cho et al., Mol. Cell., 2: 65-73 (1998); Chu et al., Science, 282: 699-705 (1998); Holstege et al., Cell., 95: 717-728 (1998); Spellman et al., Mol. Biol. Cell, 9: 3273-97 (1998)). Cada célula transduce variaciones en su entorno, estado interno y estado de desarrollo en variaciones reconocibles y medidas fácilmente en sus patrones de expresión génica. Por tanto, es probable que dos muestras diferentes con patrones de expresión génica relacionados sean biológica y funcionalmente similares entre sí. Por tanto, una firma de expresión génica específica en una muestra puede proporcionar conocimientos biológicos importantes en su composición celular y la función de diversas rutas intracelulares dentro de esas células.

Las bases de datos de firmas de expresión génica han demostrado ser útiles para elucidar los patrones expresión génica complejos de diversos cánceres. Por ejemplo, el patrón de expresión de genes en la firma de células B de centro germinal en una biopsia de linfoma indica que el linfoma incluye células derivadas de la fase de diferenciación de centro germinal. En la misma biopsia de linfoma, la expresión de genes de la firma de células T puede usarse para estimar el grado de infiltración del tumor por las células T del huésped, mientras que la expresión de genes de la firma de proliferación puede usarse para cuantificar la tasa de proliferación de células tumorales. De esta manera, las firmas de expresión génica proporcionan un “resumen ejecutivo” de las propiedades biológicas de una muestra de tumor. Las firmas de expresión génica también pueden ser útiles para interpretar los resultados de un análisis supervisado de datos de expresión génica. Un análisis supervisado genera una lista de genes con patrones de expresión que se correlacionan con la supervivencia. Las firmas de expresión génica pueden ser útiles para asignar estos genes “de predicción” a categorías funcionales. En la construcción de un modelo de múltiples variables de supervivencia basado en datos de expresión génica, esta categorización funcional ayuda a limitar la inclusión de múltiples genes en el modelo que mide el mismo aspecto de la biología tumoral.

El siguiente enfoque se utilizó para crear modelos de predicción de supervivencia para el DLBCL de la invención. Se usaron perfiles de expresión génica para crear modelos de múltiples variables para predecir la supervivencia. Los métodos para crear estos modelos estaban “supervisados” porque usaban datos clínicos para guiar la selección de genes que iban a usarse en la clasificación de pronóstico. El método identificó genes con patrones de expresión que se correlacionaban con la duración de la supervivencia global tras quimioterapia. Generalmente, el procedimiento para identificar el modelo de múltiples variables para predecir la supervivencia incluía las siguientes etapas: 1. Se identificaron genes que tenían patrones de expresión asociados utilizando una sola variable con un resultado clínico particular usando un modelo de riesgos proporcionales de Cox. Generalmente, un valor de p de una sola variable <0,01 se considera el punto de corte para significación (sin embargo, puede usarse otro criterio). Estos genes se denominaron genes “de predicción”.

2. Dentro de un conjunto de genes de predicción, se identificaron firmas de expresión génica.

3. Para cada firma de expresión génica asociada significativamente con supervivencia, se usó la expresión promedio de cada gen componente dentro de esta firma para generar un valor de firma de expresión génica.

9

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   4. Se construyó un modelo de Cox de múltiples variables de resultado clínico usando los valores de firma de expresión génica.

5. Se añadieron genes adicionales al modelo, que se añadieron a la potencia estadística del modelo.

El modelo de la invención genera una puntuación de factor de predicción de supervivencia, estando asociada una puntuación superior con un resultado clínico peor. El modelo resultante puede usarse por separado para predecir un resultado de supervivencia. Alternativamente, el modelo puede usarse conjuntamente con uno o más de otros modelos, dados a conocer en el presente documento o en otras referencias, para predecir un resultado de supervivencia.

La presente invención da a conocer varias firmas de expresión génica relacionadas con el resultado clínico de pacientes con DLBCL. Las firmas se identificaron usando los datos clínicos y métodos descritos más adelante en los ejemplos 1 y 2. Tres de estas firmas de expresión génica son la firma de células B de centro germinal (GCB), la firma de estromal-1 y la firma de estromal-2. Cada gen componente de estas firmas se identifica en la tabla 1 según su número de registro de GenBank, su ID de gen asignada por Entrez Gene, un símbolo de gen común y un título de gen descriptivo. La tabla 1 también proporciona la ID de conjunto de sondas de Affymetrix, que pueden usarse (por ejemplo, en la micromatriz de Affymetrix U133+ (Affymetrix, Santa Clara, CA)) para determinar el nivel de expresión génica para el gen indicado. La lista de secuencias legible por ordenador presentada con el presente documento incluye una secuencia de fragmento representativa (de aproximadamente 100 pb o mayor) para cada secuencia diana genómica enumerada en la tabla 1, seguido por la secuencia para cada sonda en el conjunto de sondas de Affymetrix correspondiente enumerado en la tabla 1.

Tabla 1

ID de conjunto

N.º de registro

ID de gen

Símbolo del

Firma

Título del gen

de sondas de

de GenBank

de Entrez

gen

Affymetrix

GCB NM_052932 114908 TMEM123 proteína transmembrana 123 211967_at proteína 1 similar a GCB NM_001014380 84056 KATNAL1 227713_at subunidad A de katanina p60 GCB NM_004665 8875 VNN2 vanina 2 205922_at serina/treonina cinasa 17a GCB NM_004760 9263 STK17A (inductora de apoptosis) 202693_s_at Clon de ADNc de longitud completa CS0DF007YJ21 de cerebro fetal de Homo

GCB CR590554

sapiens (ser humano) 228464_at vezatina, proteína transmembrana de uniones GCB NM_017599 55591 VEZT adherentes 223089_at Proteína 6 que contiene los dominios FYVE, RhoGEF y GCB NM_018351 55785 FGD6 PH 1555136_at proteína 5 similar a kelch GCB NM_001007075 51088 KLHL5 226001_at (Drosophila) fosfato citidililtransferasa 1, GCB NM_004845 9468 PCYT1B colina, beta 228959_at ADNc: FLJ23228 fis, clon GCB AK026881 CAE06654 226799_at fosfoproteína asociada con microdominios de GCB NM_018440 55824 PAG1 glicoesfingolípido 1 225626_at dominio 1 de unión a nucleosoma de grupo de alta GCB NM_004965 3150 HMGN1 movilidad 200944_s_at linfoma 6/LLC de células B (proteína de dedos de cinc GCB NM_001706 604 BCL6 51) 228758_at proteína de dedos de cinc GCB NM_020747 57507 ZNF608 229817_at 608 GCB NM_001001695 400941 FLJ42418 proteína FLJ42418 231455_at GCB NM_015055 23075 SWAP70 proteína SWAP-70 209306_s_at PTK2 proteína tirosina cinasa GCB NM_005607 5747 PTK2 208820_at 2 GCB XM_027236 23508 TTC9 dominio 9 de repetición de 213172_at

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

ID de conjunto

N.º de registro

ID de gen

Símbolo del

Firma

Título del gen

de sondas de

de GenBank

de Entrez

gen

Affymetrix

tetratricopéptido gen hipotético soportado por GCB BQ213652 440864 LOC440864 BC040724 1569034_a_at dominio LIM sólo 2 (proteína GCB NM_005574 4005 LMO2 1 similar a rombotina) 204249_s_at proteína 4 similar a vestigial GCB NM_014667 9686 VGLL4 212399_s_at (Drosophila) inositol 1,4,5-trifosfato 3- GCB NM_002221 3707 ITPKB cinasa B 203723_at metalo-endopeptidasa de membrana (endopeptidasa GCB NM_000902 4311 MME neutra, encefalinasa) 203434_s_at proteína 2 de unión a ADN GCB NM_012446 23635 SSBP2 monocatenario 203787_at miembro 2 de la familia F (con dominio FYVE) que contiene dominio de GCB NM_024613 79666 PLEKHF2 homología a pleckstrina 222699_s_at GCB AV705976 Locus transcrito 204681_s_at proteína 1 de señalización GCB NM_012108 26228 BRDG1 220059_at posterior de BCR 1 cinasa 6 relacionada con NIMA (gen a nunca en GCB NM_014397 10783 NEK6 mitosis) 223158_s_at homólogo de DnaJ (Hsp40), GCB NM_018981 54431 DNAJC10 subfamilia C, miembro 10 225174_at ADN (citosina-5-)- GCB NM_001379 1786 DNMT1 metiltransferesa 1 227684_at proteína de membrana GCB NM_006152 4033 LRMP restringida a linaje linfoide 35974_at proteína 13 que contiene repetición de anquirina y caja GCB NM_024701 79754 ASB13 SOCS 218862_at 3’(2’), 5’-bisfosfato GCB NM_006085 10380 BPNT1 nucleotidasa 1 232103_at GCB NM_023009 65108 MARCKSL1 proteína 1 similar a MARCKS 200644_at dominio 13A de repetición de GCB NM_033121 88455 ANKRD13A 224810_s_at anquirina GCB NM_015187 23231 KIAA0746 proteína KIAA0746 235353_at inhibidor de serpina peptidasa, clado A (alfa-1 antiproteinasa, antitripsina), GCB NM_175739 327657 SERPINA9 miembro 9 1553499_s_at proteína 2B que contiene GCB NM_001012391 400509 RUNDC2B 1554413_s_at dominio RUN proteína 1 similar a homólogo (aviar) de oncogén de GCB XM_034274 4603 MYBL1 mieloblastosis viral v-myb 1 213906_at marco de lectura abierto 54 Estromal-1 NM_024579 79630 C1orf54 del cromosoma 1 219506_at Estromal-1 NM_001645 341 APOC1 apolipoproteína C-1 213553_x_at interleucina 18 (factor de inducción de interferón- Estromal-1 NM_001562 3606 IL18 gamma) 206295_at Estromal-1 NM_014479 27299 ADAMDEC1 decisina 1; similar a ADAM 206134_at Estromal-1 NM_003465 1118 CHIT1 quitinasa 1 (quitotriosidasa) 208168_s_at prostaglandina D2 sintasa de Estromal-1 NM_000954 5730 PTGDS 21 kDa (cerebro) 211748_x_at familia de sulfotransferasa, Estromal-1 NM_001056 6819 SULT1C1 citosólico, 1C, miembro 1 211470_s_at Estromal-1 NM_018000 55686 MREG melanorregulina 219648_at 11

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Estromal-1 NM_001018058 22797 TFEC factor de transcripción EC 206715_at Estromal-1 NM_000239 4069 LYZ lisozima (amiloidosis renal) 213975_s_at RAB32, miembro de la familia Estromal-1 NM_006834 10981 RAB32 del oncogén RAS 204214_s_at receptor 1 de interferón Estromal-1 NM_000416 3459 IFNGR1 202727_s_at gamma Estromal-1 NM_004666 8876 VNN1 vanina 1 205844_at proteína 5 de unión a retinol, Estromal-1 NM_031491 83758 RBP5 223820_at celular proteína 1 similar a quitinasa 3 (glicoproteína-39 de Estromal-1 NM_001276 1116 CHI3L1 cartílago) 209396_s_at marco de lectura abierto 29 Estromal-1 NM_138434 113763 C7orf29 del cromosoma 7 227598_at glicoproteína Estromal-1 NM_001005340 10457 GPNMB (transmembrana) nmb 201141_at proteína 2 de membrana Estromal-1 NM_002294 3920 LAMP2 asociada al lisosoma 203041_s_at agente de respuesta 1 (inducido por tazaroteno) al Estromal-1 NM_002888 5918 RARRES1 receptor de ácido retinoico 221872_at receptor del factor 2 estimulante de colonias, alfa, de baja afinidad Estromal-1 NM_172248 1438 CSF2RA (granulocitos-macrófagos) 210340_s_at familia 29 de portador de solutos (transportadores de Estromal-1 NM_018344 55315 SLC29A3 nucleósidos), miembro 3 219344_at marco de lectura abierto 48 Estromal-1 NM_032413 84419 C15orf48 del cromosoma 15 223484_at inhibidor H5 inter-alfa Estromal-1 NM_001001851 80760 ITIH5 1553243_at (globulina) integrina, beta 2 (subunidad del receptor 3 de los componentes del Estromal-1 NM_000211 3689 ITGB2 complemento 3 y 4) 1555349_a_at Estromal-1 NM_005213 1475 CSTA cistatina A (estefina A) 204971_at Estromal-1 NM_003874 8832 CD84 molécula de CD84 205988_at Estromal-1 NM_000228 3914 LAMB3 laminina, beta 3 209270_at Estromal-1 NM_005651 6999 TDO2 triptófano 2,3-dioxigenasa 205943_at marco de lectura abierto 21 Estromal-1 NM_001005266 283651 C15orf21 del cromosoma 15 242649_x_at Estromal-1 AV659177 Locus transcrito 230391_at proteína con protección (filamento de actina), similar Estromal-1 NM_001747 822 CAPG a gelsolina 201850_at citocromo P450, familia 27, Estromal-1 NM_000784 1593 CYP27A1 subfamilia A, polipéptido 1 203979_at Estromal-1 NM_052998 113451 ADC arginina descarboxilasa 228000_at clase A de receptor Estromal-1 NM_016240 51435 SCARA3 eliminador, miembro 3 219416_at Estromal-1 Z74615 COL1A1 Colágeno, tipo I, alfa 1 217430_x_at Estromal-1 NM_052947 115701 ALPK2 alfa-cinasa 2 228367_at Estromal-1 NM_021136 6252 RTN1 reticulón 1 210222_s_at Clon de ADNc de longitud completa CL0BB018ZE07 de neuroblastoma de Homo

Estromal-1 AL049370

sapiens (ser humano) 213100_at heparán sulfato (glucosamina) 3-O- Estromal-1 NM_006042 9955 HS3ST3A1 sulfotransferasa 3A1 219985_at 12

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Estromal-1 NM_000041 348 APOE apolipoproteína E 203382_s_at metalopeptidasa de la matriz 9 (gelatinasa B, gelatinasa de 92 kDa, colagenasa de tipo Estromal-1 NM_004994 4318 MMP9 IV de 92kDa) 203936_s_at Estromal-1 NM_001831 1191 CLU clusterina 222043_at lectina, de unión a galactósido, soluble, 1 Estromal-1 NM_002305 3956 LGALS1 (galectina 1) 201105_at marco de lectura abierto 11 Estromal-1 NM_032024 83938 C10orf11 del cromosoma 10 223703_at Estromal-1 NM_001025201 1123 CHN1 quimerina (quimaerina) 1 212624_s_at proteína 1 de interacción con Estromal-1 NM_003489 8204 NRIP1 receptor nuclear 202599_s_at homólogo 2 de tweety Estromal-1 NM_032646 94015 TTYH2 223741_s_at (Drosophila) Estromal-1 NM_001312 1397 CRIP2 proteína 2 rica en cisteína 208978_at Estromal-1 NM_023075 65258 MPPE1 metalofosfoesterasa 1 213924_at proteína de unión a CCAAT/potenciador (C/EBP), Estromal-1 NM_004364 1050 CEBPA alfa 204039_at factor de transcripción Estromal-1 NM_000248 4286 MITF asociado a microftalmia 207233_s_at Estromal-1 NM_002185 3575 IL7R receptor de interleucina 7 226218_at proteína asociada a Estromal-1 NM_021638 60312 AFAP 203563_at filamentos de actina casete de unión a ATP, subfamilia C (CFTR/MRP), Estromal-1 NM_003786 8714 ABCC3 miembro 3 208161_s_at proteína hipotética Estromal-1 730351 LOC730351 229407_at LOC730351 Estromal-1 NM_012153 26298 EHF factor homólogo a ets 225645_at ligando 14 de quimiocina Estromal-1 NM_004887 9547 CXCL14 222484_s_at (motivo C-X-C) proteína 2 similar a receptor Estromal-1 NM_002030 2359 FPRL2 230422_at de péptido de formilo proteína 2 rica en cisteína y Estromal-1 NM_001321 1466 CSRP2 207030_s_at glicina factor de crecimiento similar Estromal-1 NM_001945 1839 HBEGF a EGF de unión a heparina 203821_at proteína 1 similar a proteína asociada a receptor de Estromal-1 NM_031412 23710 GABARAPL1 GABA(A) 208869_s_at familia de dominio TSC22, Estromal-1 NM_006022 8848 TSC22D1 215111_s_at miembro 1 molécula 1 de adhesión a células endoteliales Estromal-1 NM_016174 51148 CEECAM1 cerebrales 224794_s_at Estromal-1 NM_015103 23129 PLXND1 plexina D1 212235_at Estromal-1 NM_003270 7105 TSPAN6 tetraespanina 6 209109_s_at integrina, alfa X (subunidad del receptor 4 del componente del Estromal-1 NM_000887 3687 ITGAX complemento 3) 210184_at polipéptido 1 (músculo) de subunidad VIIa de citocromo Estromal-1 NM_001864 1346 COX7A1 oxidasa 204570_at clon de ADNc de longitud completa CS0DJ007YL22 de células T (línea celular Estromal-1 CR599008 GPR157 Jurkat) Cot 10 normalizado 227970_at 13

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de Homo sapiens (ser humano) familia 27 de portadores de solutos (transportador de Estromal-1 NM_198580 376497 SLC27A1 ácidos grasos), miembro 1 226728_at proteína 1 que contiene dominio receptor de Estromal-1 NM_025106 80176 SPSB1 splA/rianodina y caja SOCS 226075_at marco de lectura abierto 4 del Estromal-1 NM_020130 56892 C8orf4 cromosoma 8 218541_s_at clase A de receptor eliminador, miembro 5 Estromal-1 NM_173833 286133 SCARA5 (supuesto) 229839_at receptor 176 acoplado a Estromal-1 NM_007223 11245 GPR176 227846_at proteínas G proteína 12 relacionada con Estromal-1 NM_013437 29967 LRP12 lipoproteína de baja densidad 219631_at canal catiónico de potencial de receptor transitorio, Estromal-1 NM_007332 8989 TRPA1 subfamilia A, miembro 1 228438_at homólogo 1 de sidekick Estromal-1 NM_152744 221935 SDK1 229912_at (pollo) dominios 6 similares a EGF Estromal-1 NM_001409 1953 MEGF6 226869_at múltiple proteína de dedos de cinc, Estromal-1 NM_012082 23414 ZFPM2 219778_at multitipo2 Estromal-1 NM_080430 140606 SELM selenoproteína M 226051_at Estromal-1 NM_030971 81855 SFXN3 sideroflexina 3 217226_s_at Estromal-1 NM_003246 7057 THBS1 trombospondina 1 201109_s_at proteína 1 de la ruta de señalización inducible de Estromal-1 NM_003882 8840 WISP1 WNT1 235821_at Estromal-1 NM_005202 1296 COL8A2 colágeno, tipo VIII, alfa 2 221900_at ácido fosfatídico fosfatasa Estromal-1 NM_003711 8611 PPAP2A tipo 2A 210946_at metalopeptidasa de la matriz 14 (insertada en la Estromal-1 NM_004995 4323 MMP14 membrana) 202828_s_at Estromal-1 NM_001005336 1759 DNM1 dinamina 1 215116_s_at síndrome de Ellis van Estromal-1 NM_153717 2121 EVC 219432_at Creveld papilina, glicoproteína sulfatada similar a Estromal-1 NM_173462 89932 PAPLN proteoglicano 226435_at Estromal-1 XM_496707 441027 FLJ12993 LOC441027 hipotética 229623_at Estromal-1 NM_001839 1266 CNN3 calponina 3, ácida 228297_at proteína de unión a la familia génica ABI, miembro 3 Estromal-1 NM_015429 25890 ABI3BP (NESH) 223395_at proteína tirosina fosfatasa, Estromal-1 NM_002840 5792 PTPRF tipo receptor, F 200636_s_at Estromal-1 NM_001001522 6876 TAGLN transgelina 1555724_s_at Estromal-1 NM_017637 54796 BNC2 basonuclina 2 229942_at miembro 2 de la familia de sitio de integración de MMTV Estromal-1 NM_003391 7472 WNT2 de tipo wingless 205648_at proteína de dedos de cinc Estromal-1 NM_015461 25925 ZNF521 226677_at 521 periostina, factor específico Estromal-1 NM_006475 10631 POSTN de osteoblastos 210809_s_at Estromal-1 NM_005418 6764 ST5 supresión de tumorigenicidad 202440_s_at 14

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

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Estromal-1 NM_005203 1305 COL13A1 colágeno, tipo XIII, alfa 1 211343_s_at Estromal-1 NM_000681 150 ADRA2A receptor adrenérgico, alfa-2A 209669_at cinasa 2 similar a polo Estromal-1 NM_006622 10769 PLK2 201939_at (Drosophila) Clon de ADNc de longitud completa CS0DD001YA12 de neuroblastoma Cot 50 normalizado de Homo

Estromal-1 AL528626

sapiens (ser humano) 228573_at proteína 3 similar a proteína asociada a receptores de Estromal-1 AF180519 23766 GABARAPL3 GABA(A) 211458_s_at Estromal-1 NM_024723 79778 MICALL2 proteína 2 similar a MICAL 219332_at homólogo B 3 defectuoso en el reparto de par-3 (C.

Estromal-1 NM_057177 117583 PARD3B

elegans) 228411_at Estromal-1 NM_004949 1824 DSC2 desmocolina 2 226817_at homólogo 3 de R-espondina Estromal-1 NM_032784 84870 RSPO3 (Xenopus laevis) 228186_s_at proteína tirosina fosfatasa, Estromal-1 NM_007039 11099 PTPN21 tipo 21 no receptora 226380_at Estromal-1 NM_031935 83872 HMCN1 hemicentina 1 235944_at ARNm de la región Cri-du- Estromal-1 AK022877 chat del clon TUA8 213169_at ADNc FLJ45742 fis, clon Estromal-1 AK127644 KIDNE2016327 236297_at clon de ADNc de inserto de Estromal-1 AK056963 longitud completa ZE03F06 226282_at Estromal-1 NM_000899 4254 KITLG ligando de KIT 226534_at mutada en cánceres Estromal-1 NM_002387 4163 MCC 226225_at colorrectales síndrome de Nance-Horan (cataratas congénitas y Estromal-1 NM_198270 4810 NHS anomalías dentales) 228933_at proteína 4 que contiene Estromal-1 NM_183376 91947 ARRDC4 225283_at dominio arrestina secuencia 1 de síndrome de Estromal-1 NM_000216 3730 KAL1 205206_at Kallmann autoantígeno uveal con dominios superenrollados y Estromal-1 NM_001008224 55075 UACA repeticiones de anquirina 223279_s_at Estromal-1 NM_133493 135228 CD109 molécula CD109 226545_at superfamilia de inmunoglobulinas que contiene repetición rica en Estromal-1 NM_005545 3671 ISLR leucinas 207191_s_at proteína 8 de 22 kDa de Estromal-1 NM_014365 26353 HSPB8 221667_s_at choque térmico Estromal-1 NM_014476 27295 PDLIM3 dominio 3 de PDZ y LIM 209621_s_at ortólogo probable de vecino Estromal-1 NM_020962 57722 NOPE de ratón de Punc E11 227870_at familia de dominios de ribonucleoproteína La, Estromal-1 NM_018357 55323 LARP6 miembro 6 218651_s_at homólogo F (aviar) de oncogén de fibrosarcoma Estromal-1 NM_012323 23764 MAFF musculoaponeurótico v-maf 36711_at ácido fosfatídico fosfatasa Estromal-1 NM_003713 8613 PPAP2B tipo 2B 212230_at Estromal-1 NM_023016 65124 ANKRD57 dominio 57 de repetición de 227034_at

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

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anquirina receptor 124 acoplado a Estromal-1 NM_032777 25960 GPR124 65718_at proteínas G inductor angiogénico, rico en Estromal-1 NM_001554 3491 CYR61 cisteínas, 61 201289_at Estromal-1 NM_145117 89797 NAV2 navegador neuronal 2 218330_s_at receptor 177 acoplado a Estromal-1 NM_001002292 79971 GPR177 228950_s_at proteínas G receptor acoplado a proteínas G de ácido lisofosfatídico, diferenciación Estromal-1 NM_001401 1902 EDG2 endotelial, 2 204036_at Estromal-1 NM_198282 340061 TMEM173 proteína transmembrana 173 224929_at proteína 1 de interacción con Estromal-1 NM_014934 22873 DZIP1 204556_s_at DAZ factor de crecimiento de Estromal-1 NM_001901 1490 CTGF 209101_at tejido conjuntivo marco de lectura abierto 30 Estromal-1 NM_024600 79652 C16orf30 del cromosoma 16 219315_s_at Estromal-1 NM_138370 91461 LOC91461 proteína hipotética BC007901 225380_at proteína 2 que contiene dominio monooxigenasa asociado a microtúbulos, Estromal-1 NM_014632 9645 MICAL2 calponina y LIM 212472_at Estromal-1 NM_032866 84952 CGNL1 proteína 1 similar a cingulina 225817_at Estromal-1 NM_003687 8572 PDLIM4 dominio 4 de PDZ y LIM 211564_s_at Estromal-1 BM544548 Locus transcrito 236179_at Estromal-1 NM_001856 1307 COL16A1 colágeno, tipo XVI, alfa 1 204345_at homólogo 1 de HEG 1 (pez Estromal-1 XM_087386 57493 HEG1 213069_at cebra) factor 2 de potenciación del Estromal-1 NM_003887 8853 DDEF2 desarrollo y la diferenciación 2064144_s_at proteína tirosina fosfatasa, Estromal-1 NM_002844 5796 PTPRK tipo receptor, K 203038_at proteína 2 de unión a calcio modular relacionada con Estromal-1 NM_022138 64094 SMOC2 SPARC 223235_s_at Estromal-1 NM_001006624 10630 PDPN podoplanina 204879_at Estromal-1 NM_003174 6840 SVIL supervilina 202565_s_at proteína tirosina fosfatasa, Stromat-1 NM_002845 5797 PTPRM tipo receptor, M 1555579_s_at agente de respuesta 2 (inducido por tazaroteno) al Estromal-1 NM_002889 5919 RARRES2 receptor de ácido retinoico 209496_at proteína 1 delecionada en Estromal-1 NM_006094 10395 DLC1 210762_s_at cáncer de hígado Estromal-1 NM_022463 64359 NXN nucleorredoxina 219489_s_at ADNc FLJ14388 fis, clon Estromal-1 AK027294 HEMBA1002716 229802_at repeticiones similares a EGF y dominios 3 similares a Estromal-1 NM_005711 10085 EDIL3 discoidina I 225275_at gelsolina (amiloidosis, tipo Estromal-1 NM_000177 2934 GSN finés) 200696_s_at superfamilia de receptores de factor de necrosis tumoral, Estromal-1 NM_016639 51330 TNFRSF12A miembro 12A 218368_s_at proteína de activación Estromal-1 NM_004460 2191 FAP 209955_s_at fibroblastos, alfa componente 3 del Estromal-1 NM_000064 718 C3 217767_at complemento 16

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proteína 3 similar a vestigial Estromal-1 NM_016206 389136 VGLL3 227399_at (Drosophila) proteína de interacción 1 de transformación de tumor Estromal-1 NM_004339 754 PTTG1 IP hipofisario 200677_at inhibidor 2 de Estromal-1 NM_003255 7077 TIMP2 224560_at metalopeptidasa TIMP sindecano 2 (heparán sulfato proteoglicano 1, asociado a superficie celular, Estromal-1 NM_002998 6383 SDC2 fibroglicano) 212158_at Estromal-1 NM_012223 4430 MYO1B miosina IB 212364_at reticulocalbina 3, dominio de Estromal-1 NM_020650 57333 RCN3 unión a calcio de mano EF 61734_at Estromal-1 AL573464 Locus transcrito 229554_at ADNc FLJ11041 fis, clon Estromal-1 AK001903 PLACE1004405 227140_at proteína de factor 8 de EGF de glóbulos de la grasa de la Estromal-1 NM_005928 4240 MFGE8 leche 210605_s_at peptidilprolil isomerasa C Estromal-1 NM_000943 5480 PPIC (ciclofilina C) 204518_s_at similar a ADNc RIKEN Estromal-1 NM_001008397 493869 LOC493869 2310016C16 227628_at proteína 1 similar a receptor Estromal-1 AK025431 768211 RELL1 expresado en tejidos linfoides 226430_at proteína 2 de enfermedad de riñón poliquístico (autosómica Estromal-1 NM_000297 5311 PKD2 dominante) 203688_at familia 11 de dominios de Estromal-1 NM_002975 6320 CLEC11A lectina de tipo C, miembro A 211709_s_at Estromal-1 NM_001920 1634 DCN decorina 211813_x_at Estromal-1 NM_001723 667 DST distonina 215016_x_at ARNm; ADNc DKFZp686118116 (del clon Estromal-1 CR749529 DKFZp686118116) 227554_at proteína de unión gap, alfa 1, Estromal-1 NM_000165 2697 GJA1 43 kDa (conexina 43) 201667_at enzima 1 de escisión de APP Estromal-1 NM_012104 23621 BACE1 217904_s_at de sitio beta Estromal-1 NM_001957 1909 EDNRA receptor de endotelina tipo A 204464_s_at proteína 1 que contiene repetición de triple hélice de Estromal-1 NM_138455 115908 CTHRC1 colágeno 225681_at catenina (proteína asociada a Estromal-1 NM_001331 1500 CTNND1 cadherina), delta 1 208407_s_at actina, alfa 2, músculo liso, Estromal-1 NM_001613 59 ACTA2 aorta 200974_at inhibina, beta A (activina A, polipéptido alfa de activina Estromal-1 NM_002192 3624 INHBA AB) 210511_s_at procolágeno-lisina, 2- Estromal-1 NM_000935 5352 PLOD2 oxoglutarato 5-dioxigenasa 2 202620_s_at Estromal-1 NM_015170 23213 SULF1 sulfatasa 1 212354_at Estromal-1 NM_006039 9902 MRC2 receptor de manosa, C tipo 2 37408_at proteína de unión a GTP sobreexpresada en músculo Estromal-1 NM_005261 2669 GEM esquelético 204472_at proteína 1 similar a proteína asociada a microtúbulos de Estromal-1 NM_001008707 2009 EML1 equinodermos 204797_s_at 17

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

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metionina sulfóxido reductasa Estromal-1 NM_001031679 253827 MSRB3 B3 225782_at proteína 1 candidata a Estromal-1 NM_001004125 286319 TUSC1 227388_at supresor de tumores miosina, cinasa de cadena Estromal-1 NM_005965 4638 MYLK 202555_s_at ligera factor de crecimiento C Estromal-1 NM_016205 56034 PDGFC 218718_at derivado de plaquetas Estromal-1 NM_015976 51375 SNX7 nexina 7 de clasificación 205573_s_at proteína 15 que contiene Estromal-1 NM_130830 131578 LRRC15 213909_at repetición rica en leucinas Estromal-1 NM_002026 2335 FN1 fibronectina 1 212464_s_at receptor 3 de retención de proteínas en el retículo endoplasmático KDEL (Lys- Estromal-1 NM_006855 11015 KDELR3 Asp-Glu-Leu) 204017_at Estromal-1 NM_002292 3913 LAMB2 laminina, beta 2 (laminina S) 216264_s_at activador de plasminógeno, Estromal-1 NM_002658 5328 PLAU 205479_s_at urocinasa heparán sulfato proteoglicano Estromal-1 NM_005529 3339 HSPG2 2 (perlecano) 201655_s_at inhibidor de serpina peptidasa, clado H (proteína 47 de choque térmico), miembro 1, (proteína 1 de Estromal-1 NM_001235 871 SERPINH1 unión a colágeno 1) 207714_s_at ADNc FLJ44429 fis, clon Estromal-1 AJ318805 CDNA CDNA UTERU2015653 227061_at Estromal-1 NM_000396 1513 CTSK catepsina K 202450_s_at proteína 2 que contiene Estromal-1 NM_031302 83468 GLT8D2 dominio glicosiltransferasa 8 227070_at marco de lectura abierto 108 Estromal-1 NM_080821 116151 C20orf108 del cromosoma 20 224690_at Estromal-1 NM_002345 4060 LUM lumicano 201744_s_at glutamina-fructosa-6-fosfato Estromal-1 NM_005110 9945 GFPT2 transaminasa 2 205100_at roundabout, receptor de guiado de axones, homólogo Estromal-1 NM_002941 6091 ROBO1 1 (Drosophila) 213194_at factor de crecimiento C Estromal-1 NM_005429 7424 VEGFC endotelial vascular 209946_at Estromal-1 NM_002213 3693 ITGB5 integrina, beta 5 201125_s_at Estromal-1 XM_051017 23363 OBSL1 proteína 1 similar a obscurina 212775_at Estromal-1 NM_181724 338773 TMEM119 proteína transmembrana 119 227300_at domino 12 de metalopeptidasa ADAM Estromal-1 NM_003474 8038 ADAM12 (meltrina alfa) 213790_at Estromal-1 NM_018222 55742 PARVA parvina, alfa 217890_s_at proteína 1 similar a proteína Estromal-1 NM_006478 10634 GAS2L1 2 específica de detención del 31874_at crecimiento Estromal-1 NM_000093 1289 COL5A1 colágeno, tipo V, alfa 1 212489_at antígeno de superficie celular Estromal-1 NM_006288 7070 THY1 208851_s_at Thy-1 Locus transcrito, fuertemente similar a XP_511714.1 similar a precursor de inhibidor 2 de metaloproteinasa (TIMP-2) (inhibidor tisular de metaloproteinasas-2) (CSC- Estromal-1 CD357685 TIMP2 21 K) [Pan troglodytes] 231579_s_at 18

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

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Estromal-1 NM_003247 7058 THBS2 trombospondina 2 203083_at Estromal-1 NM_000088 1277 COL1A1 colágeno, tipo I, alfa 1 1556499_s_at miembro 1 que contiene domino de homología a pleckstrina, familia C (con Estromal-1 NM_006832 10979 PLEKHC1 dominio FERM) 209210_s_at miembro 1 de familia de dominios TEA (factor de potenciador transcripcional Estromal-1 NM_021961 7003 TEAD1 de SV40) 224955_at ADNc FLJ25106 fis, clon Estromal-1 AK128814 CBR01467 213675_at marco de lectura abierto 56 Estromal-1 NM_153367 219654 C10orf56 del cromosoma 10 212423_at ARNm; ADNc DKFZp313C0240 (del clon Estromal-1 AK092048 DKFZp313C0240) 227623_at homólogo 1 de supresor de Estromal-1 NM_005245 2195 FAT tumores FAT (Drosophila) 201579_at Estromal-1 NM_001129 165 AEBP1 proteína 1 de unión a AE 201792_at proteína 2 asociada a Estromal-1 NM_002403 4237 MFAP2 203417_at microfibrillas Estromal-1 NM_004342 800 CALD1 caldesmona 1 201616_s_at proteína 1 similar a lisil Estromal-1 NM_005576 4016 LOXL1 203570_at oxidasa proteína 80 que contiene Estromal-1 NM_199511 151887 CCDC80 225242_s_at dominio superenrollado proteína 2 similar a Estromal-1 NM_012098 23452 ANGPTL2 213001_at angiopoyetina integrina, alfa V (receptor de vitronectina, polipéptido alfa, Estromal-1 NM_002210 3685 ITGAV antígeno CD51) 202351_at Estromal-1 NM_000366 7168 TPM1 tropomiosina 1 (alfa) 210986_s_at proteína 1 similar a Estromal-1 NM_198474 283298 OLFML1 217525_at olfactomedina proteína 2 de membrana Estromal-1 NM_001424 2013 EMP2 225078_at epitelial dedo de cinc 2 de la familia Estromal-1 NM_032575 84662 GLIS2 223378_at GLIS Estromal-1 NM_007173 11098 PRSS23 proteasa, serina, 23 226279_at 3’-fosfoadenosina 5’- Estromal-1 NM_001015880 9060 PAPSS2 fosfosulfato sintasa 2 203060_s_at proteína 5 relacionada con C1q y factor de necrosis Estromal-1 NM_015645 114902 C1QTNF5 tumoral 223499_at ADNc FLJ26539 fis, clon Estromal-1 AK130049 KDN09310 213429_at Estromal-1 NM_001849 1292 COL6A2 colágeno, tipo VI, alfa 2 209156_s_at familia de receptor de dominio de discoidina, Estromal-1 NM_001014796 4921 DDR2 miembro 2 225442_at marco de lectura abierto 32 Estromal-1 NM_015463 25927 C2orf32 del cromosoma 2 226751_at ADNc FLJ31066 fis, clon Estromal-1 AK055628 ADAM12 HSYRA2001153 226777_at Estromal-1 NM_014799 9843 HEPH hefaestina 203903_s_at condroitin sulfato Estromal-1 NM_004385 1462 CSPG2 proteoglicano 2 (versicano) 221731_x_at proteína 6 que contiene Estromal-1 NM_152330 122786 FRMD6 225481_at dominio FERM 6 Estromal-1 BQ917964 PPP4R2 Locus transcrito 235733_at 19

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

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inhibidor de serpina peptidasa, clado F (alfa-2 antiplasmina, factor derivado de epitelio pigmentario), Estromal-1 NM_002615 5176 SERPINF1 miembro 1 202283_at proteína 8 asociada a Estromal-1 NM_032348 54587 MXRA8 213422_s_at remodelación de la matriz proteína 1 asociada a Yes, Estromal-1 NM_006106 10413 YAP1 224894_at 65kDa ARN inducido por andrógenos de próstata, Estromal-1 NM_020182 56937 TMEPAI transmembrana 222449_at Estromal-1 CB999028 Locus transcrito 226834_at Estromal-1 NM_001711 633 BGN biglicano 201261_x_at caja homeótica 1 relacionada Estromal-1 NM_006902 5396 PRRX1 226695_at con paired proteína 2 de unión a factor de crecimiento transformante Estromal-1 NM_000428 4053 LTBP2 beta latente 204682_at Estromal-1 NM_004369 1293 COL6A3 colágeno, tipo VI, alfa 3 201438_at Estromal-1 NM_000393 1290 COL5A2 colágeno, tipo V, alfa 2 221730_at proteína 5 asociada a Estromal-1 NM_015419 25878 MXRA5 209596_at remodelación de la matriz Estromal-1 NM_001102 87 ACTN1 actinina, alfa 1 208637_x_at receptor de interleucina 1, Estromal-1 NM_000877 3554 IL1R1 202948_at tipo I transcrito 1 inducido por factor de crecimiento Estromal-1 NM_015927 7041 TGFB111 transformante beta 1 209651_at proteína de dedos de cinc Estromal-1 NM_032772 84858 ZNF503 227195_at 503 regulador negativo de receptor de prostaglandina Estromal-1 NM_020440 5738 PTGFRN F2 224937_at Estromal-1 NM_000138 2200 FBN1 fibrilina 1 202765_s_at Estromal-1 NM_031442 83604 TMEM47 proteína transmembrana 47 209656_s_at componente 1 del complemento, Estromal-1 NM_001734 716 C1S subcomponente s 208747_s_at Estromal-1 NM_002290 3910 LAMA4 laminina, alfa 4 202202_s_at Locus transcrito, débilmente similar a NP_001013658.1 proteína LOC387873 [Homo

Estromal-1 CN312045 PPP4R2

sapiens] 222288_at Estromal-1 NM_000089 1278 COL1A2 colágeno, tipo I, alfa 2 202403_s_at metalopeptidasa de la matriz 2 (gelatinasa A, gelatinasa de 72 kDa, colagenasa de 72 Estromal-1 NM_004530 4313 MMP2 kDa tipo IV) 201069_at proteína 3 similar a Estromal-1 NM_001387 1809 DPYSL3 201431_s_at dihidropirimidinasa familia con similitud de Estromal-1 NM_138389 92689 FAM114A1 secuencia 114, miembro A1 213455_at Estromal-1 NM_006670 7162 TPBG glicoproteína de trofoblastos 203476_at proteína 22 de mielina Estromal-1 NM_000304 5376 PMP22 210139_s_at periférica Estromal-1 NM_002775 5654 HTRA1 HtrA serina peptidasa 1 201185_at potenciador de procolágeno Estromal-1 NM_002593 5118 PCOLCE C-endopeptidasa 202465_at proteína secretada, ácida, Estromal-1 NM_003118 6678 SPARC rica en cisteína 212667_at

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

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(osteonectina) Estromal-1 NM_007085 11167 FSTL1 proteína 1 similar a folistatina 208782_at proteína 4 que contiene dominio de glicosil- Estromal-1 NM_001080393 727936 transferasa 8 predicho 235371_at Estromal-1 NM_018153 84168 ANTXR1 receptor 1 de toxina antrácica 224694_at componente 1 del complemento, Estromal-1 NM_001733 715 C1R subcomponente r 212067_s_at cadherina 11, tipo 2, OB- Estromal-1 NM_001797 1009 CDH11 cadherina (osteoblasto) 207173_x_at proteína 2 de la matriz extracelular similar a fibulina Estromal-1 NM_016938 30008 EFEMP2 que contiene EGF 209356_x_at proteína 2 que contiene Estromal-2 NM_014601 30846 EHD2 45297_at dominio EH dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto Estromal-2 NM_017789 54910 SEMA4C (semaforina) 4C 46665_at proteína precursora de amiloide beta (A4) (peptidasa nexina-II, enfermedad de Estromal-2 NM_000484 351 APP Alzheimer) 200602_at proteína 1 similar a SPARC Estromal-2 NM_004684 8404 SPARCL1 200795_at (mast9, hevina) Estromal-2 NM_002291 3912 LAMB1 laminina, beta 1 201505_at Estromal-2 NM_000210 3655 ITGA6 integrina, alfa 6 201656_at Estromal-2 NM_000552 7450 VWF factor de von Willebrand 202112_at Estromal-2 NM_001233 858 CAV2 caveolina 2 203323_at receptor de proteína C, Estromal-2 NM_006404 10544 PROCR endotelial (EP.CR) 203650_at ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de células del Estromal-2 NM_000609 6387 CXCL12 estroma) 203666_at receptor de dominio de inserto cinasa (una tirosina Estromal-2 NM_002253 3791 KDR cinasa receptor de tipo III) 203934_at proteína 4 de unión a ácidos Estromal-2 NM_001442 2167 FABP4 grasos, adipocito 203980_at GULP, proteína 1 que contiene dominio PTB Estromal-2 NM_016315 51454 GULP1 adaptador de internamiento 204237_at proteína que contiene repetición sushi, ligada al Estromal-2 NM_006307 8406 SRPX cromosoma X 204955_at receptor de hormona de Estromal-2 NM_000163 2690 GHR 205498_at crecimiento Gla (ácido G- carboxiglutámico) 1 rico en Estromal-2 NM_000950 5638 PRRG1 prolina 205618_at Estromal-2 NM_002666 5346 PLIN perilipina 205913_at TEK tirosina cinasa, endotelial (malformaciones venosas, cutáneas y Estromal-2 NM_000459 7010 TEK mucosas múltiples) 206702_at proteína que contiene dominio adiponectina, C1Q y Estromal-2 NM_004797 9370 ADIPOQ colágeno 207175_at 21

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

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ID de gen

Símbolo del

Firma

Título del gen

de sondas de

de GenBank

de Entrez

gen

Affymetrix

molécula de adhesión a células endoteliales/plaquetas Estromal-2 NM_000442 5175 PECAM1 (antígeno CD31) 208981_at acuaporina 1 (grupo Estromal-2 NM_198098 358 AQP1 209047_at sanguíneo Colton) subfamilia 2 de receptores nucleares, grupo F, miembro Estromal-2 NM_021005 7026 NR2F2 2 209120_at miembro 1 de la familia Estromal-2 NM_014220 4071 TM4SF1 transmembrana 4 L seis 209386_at proteína 10 unida a receptor Estromal-2 NM_001001549 2887 GRB10 de factor de crecimiento 209409_at espondina 1, proteína de la Estromal-2 NM_006108 10418 SPON1 matriz extracelular 209436_at Estromal-2 NM_001003679 3953 LEPR receptor de leptina 209894_at proteína 5 de unión a factor de crecimiento de tipo Estromal-2 NM_000599 3488 IGFBP5 insulina 211959_at caveolina 1, proteína de Estromal-2 NM_001753 857 CAV1 caveolas, 22 kDa 212097_at homólogo 1 de sprouty, antagonista de la señalización de FGF Estromal-2 NM_005841 10252 SPRY1 (Drosophila) 212558_at activador asociado a dishevelled de la Estromal-2 NM_015345 23500 DAAM2 morfogénesis 2 212793_at receptor 116 acoplado a Estromal-2 NM_015234 221395 GPR116 212950_at proteínas G espondina 1, proteína de la Estromal-2 NM_006108 10418 SPON1 matriz extracelular 213993_at dominio similar a EGF, Estromal-2 NM_016215 51162 EGFL7 218825_at múltiple 7 Estromal-2 NM_022481 64411 CENTD3 centaurina, delta 3 218950_at proteína 1 que contiene EGF, latrofilina y siete dominios Estromal-2 XM_371262 64123 ELTD1 transmembrana 219134_at Estromal-2 NM_016563 51285 RASL12 familia 12, similar a RAS 219167_at proteína 1 delecionada en Estromal-2 NM_006094 10395 DLC1 224822_at cáncer 1 Estromal-2 NM_019035 54510 PCDH18 protocadherina 18 225975_at homólogo 4 de roundabout, magic roundabout Estromal-2 NM_019055 54538 ROBO4 (Drosophila) 226028_at Estromal-2 NM_002207 3680 ITGA9 integrina, alfa 9 227297_at molécula 2 específica de Estromal-2 XM_93060B 641700 ECSM2 células endoteliales 227779_at dominios 3 de SH3 y repeticiones de anquirina Estromal-2 XM_037493 85358 SHANK3 múltiples 227923_at proteína 1 rica en Estromal-2 NM_052954 116159 CYYR1 228665_at cisteína/tirosina proteína tirosina fosfatasa, Estromal-2 NM_002837 5787 PTPRB tipo receptor, B 230250_at Estromal-2 NM_019558 3234 HOXD8 caja homeótica D8 231906_at proteína 4 de unión a ácidos Estromal-2 NM_001442 2167 FABP4 grasos, adipocito 235978_at Estromal-2 NM_024756 79812 MMRN2 multimerina 2 236262_at Estromal-2 BQ897248 Locus transcrito 242680_at Estromal-2 NM_020663 57381 RHOJ familia génica homologa a 243481_at 22

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

ID de conjunto

N.º de registro

ID de gen

Símbolo del

Firma

Título del gen

de sondas de

de GenBank

de Entrez

gen

Affymetrix

ras, miembro J ADNc FLJ34100 fis, clon Estromal-2 AK091419 FCBBF3007597 1558397_at Estromal-2 NM_015719 50509 COL5A3 colágeno, tipo V, alfa 3 52255_s_at Estromal-2 NM_012072 22918 CD93 molécula CD93 202878_s_at fosfolipasa A2, grupo IIA Estromal-2 NM_000300 5320 PLA2G2A (plaquetas, líquido sinovial) 203649_s_at Estromal-2 NM_019105 7148 TNXB tenascina XB 206093_x_at Estromal-2 NM_030754 6289 SAA2 amilioide sérico A2 208607_s_at Estromal-2 NM_019105 7148 TNXB tenascina XB 208609_s_at miembro 1 de familia Estromal-2 NM_014220 4071 TM4SF1 transmembrana 4 L seis 209367_s_at alcohol deshidrogenasa IB Estromal-2 NM_000668 125 ADH1 B (clase I), polipéptido beta 209612_s_at alcohol deshidrogenasa IB Estromal-2 NM_000668 125 ADH1B (clase I), polipéptido beta 209613_s_at familia 1 de aldo-ceto reductasa, miembro C2 (dihidrodiol-deshidrogenasa 2; proteína de unión a ácidos biliares; 3-alfa hidroxiesteroide Estromal-2 NM_001354 1646 AKR1C2 deshidrogenasa, tipo III) 209699_x_at inhibidor de la ruta de factor tisular (inhibidor de la coagulación asociado a Estromal-2 NM_001032281 7035 TFPI lipoproteínas) 210664_s_at supresor 1 de tumores Estromal-2 NM_001001924 57509 MTUS1 212096_s_at mitocondriales Estromal-2 NM_019105 7148 TNXB tenascina XB 213451_x_at homólogo (aviar) de oncogén E26 de virus de Estromal-2 NM_004449 2078 ERG eritroblastosis v-ets 213541_s_at proteína transmembrana 4 Estromal-2 NM_018407 55353 LAPTM4B beta asociada al lisosoma 214039_s_at Estromal-2 NM_000331 6288 SAA1 amiloide sérico A1 214456_x_at Estromal-2 NM_019105 7148 TNXB tenascina XB 216333_x_at proteína 1 que contiene Estromal-2 NM_001034954 10580 SORBS1 dominio sorbina y SH3 218087_s_at Estromal-2 NM_017734 54873 PALMD palmdelfina 218736_s_at Estromal-2 NM_024756 79812 MMRN2 multimerina 2 219091 _s_at proteína 4 de unión a retinol, Estromal-2 NM_006744 5950 RBP4 219140_s_at plasma proteína 1 que contiene Estromal-2 NM_001034954 10580 SORBS1 dominio sorbina y SH3 222513_s_at Se generaron factores de predicción de supervivencia de DLBCL de la invención usando datos de expresión y los métodos descritos en los ejemplos 1 y 2, a continuación. El primer factor de predicción de supervivencia de dos variables incorpora las firmas de expresión génica de GCB y estromal-1. El ajuste del modelo de riesgos proporcionales de Cox a los datos de expresión génica obtenidos a partir de estas dos firmas dio como resultado una puntuación de factor de predicción de supervivencia de modelo de dos variables calculada usando la siguiente ecuación generalizada: Puntuación de factor de predicción de supervivencia de DLBCL de dos variables = A - [(x)*(valor de firma de GCB)] - [(y)*(valor de firma de estromal-1)] En esta ecuación, A es un término de desviación, mientras que (x) e (y) son factores de escala. El valor de firma de GCB y el valor de firma de estromal-1 pueden corresponder al promedio de los niveles de expresión de todos los genes en la firma de GCB y la firma de estromal-1, respectivamente. Una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia más favorable, y una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia menos favorable para el sujeto.

23

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   El factor de predicción de supervivencia de dos variables se refinó para dar un factor de predicción de supervivencia de múltiples variables que incorpora las firmas de expresión génica de GCB, estromal-1 y estromal-2. El ajuste del modelo de riesgos proporcionales de Cox a los datos de expresión génica obtenidos a partir de estas tres firmas dio como resultado una puntuación de factor de predicción de supervivencia de modelo de múltiples variables calculado usando la siguiente ecuación generalizada: Puntuación de factor de predicción de supervivencia de DLBCL de múltiples variables general = A - [(x)*(valor de firma de GCB)] - [(y)*(valor de firma de estromal-1)] + [(z)*(valor de firma de estromal-2)].

En esta ecuación, A es un término de desviación, mientras que (x), (y) y (z) son factores de escala. El valor de firma de GCB, el valor de firma de estromal-1 y el valor de firma de estromal-2 pueden corresponder al promedio de los niveles de expresión de todos los genes en la firma de GCB, la firma de estromal-1 y la firma de estromal-2, respectivamente. Una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia más favorable y una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia menos favorable para el sujeto.

En una realización, la invención proporciona la siguiente ecuación de factor de predicción de supervivencia de múltiples variables: Puntuación de factor de predicción de supervivencia de DLBCL de múltiples variables = 8,11 - [0,419*(valor de firma de GCB)] - [1,015*(valor de firma de estromal-1)] + [0,675*(valor de firma de estromal-2)].

En esta ecuación, una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia más favorable, y una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia indica un peor resultado de supervivencia para el sujeto.

En otras realizaciones de la ecuación de puntuación de factor de predicción de supervivencia de DLBCL de múltiples variables, el término de desviación (A) o (8,11) puede variarse sin afectar a la utilidad de la ecuación en la predicción del resultado clínico. También pueden variarse los factores de escala (x), (y) y (z), individualmente o en combinación. Por ejemplo, el factor de escala (x) puede ser de desde aproximadamente 0,200 o más, desde aproximadamente 0,225 o más, desde aproximadamente 0,250 o más, desde aproximadamente 0,275 o más, desde aproximadamente 0,300, desde aproximadamente 0,325 o más, desde aproximadamente 0,350 o más, desde aproximadamente 0,375 o más, o desde aproximadamente 0,400 o más. Alternativamente, o además, el factor de escala (x) puede ser de aproximadamente 0,625 o menos, aproximadamente 0,600 o menos, aproximadamente 0,575 o menos, aproximadamente 0,550 o menos, aproximadamente 0,525 o menos, aproximadamente 0,500 o menos, aproximadamente 0,475 o menos, aproximadamente 0,450 o menos, o aproximadamente 0,425 o menos. Por tanto, el factor de escala (z) puede ser uno que está limitado por dos cualesquiera de los puntos de extremo anteriores. Por ejemplo, el factor de escala (x) puede ser un valor de desde 0,200-0,625, desde 0,350-0,550, desde 0,350-0,475 o desde 0,400-0,425. De manera similar, el factor de escala (y) puede ser de desde aproximadamente 0,800 o más, desde aproximadamente 0,825 o más, desde aproximadamente 0,850 o más, desde aproximadamente 0,875 o más, desde aproximadamente 0,900 o más, desde aproximadamente 0,925 o más, desde aproximadamente 0,950 o más, desde aproximadamente 0,975 o más, o desde aproximadamente 1,000 o más. Alternativamente, o además, el factor de escala (y) puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1,250 o menos, por ejemplo, aproximadamente 1,225 o menos, aproximadamente 1,200, aproximadamente 1,175 o menos, aproximadamente 1,150 o menos, aproximadamente 1,125 o menos, aproximadamente 1,100 o menos, aproximadamente 1,075 o menos, aproximadamente 1,050 o menos, o aproximadamente 1,025 o menos. Por tanto, el factor de escala (y) puede ser uno que está limitado por dos cualesquiera de los puntos de extremo anteriores. Por ejemplo, el factor de escala (y) puede ser un valor de desde 0,800-1,250, un valor de desde 0,950-1,1025, un valor de desde 0,950-1,200 o un valor de desde 1,000-1,025. También de manera similar, el factor de escala (z) puede ser de desde aproximadamente 0,450 o más, aproximadamente 0,475 o más, aproximadamente 0,500 o más, aproximadamente 0,525 o más, aproximadamente 0,550 o más, aproximadamente 0,575 o más, aproximadamente 0,600 o más, aproximadamente 0,625 o más, o aproximadamente 0,650 o más. Alternativamente, o además, el factor de escala (z) puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,900 o menos, por ejemplo, aproximadamente 0,875 o menos, aproximadamente 0,850, aproximadamente 0,825 o menos, aproximadamente 0,800 o menos, aproximadamente 0,775 o menos, aproximadamente 0,750 o menos, o aproximadamente 0,725 o menos. Por tanto, el factor de escala (z) puede ser uno que está limitado por dos cualesquiera de los puntos de extremo anteriores. Por ejemplo, el factor de escala (z) puede ser un valor de desde 0,450-0,900, cualquier valor de desde 0,650-0,725, cualquier valor de desde 0,625-0,775 o cualquier valor de desde 0,650-0,700.

Además, la invención incluye cualquier conjunto de factores de escala (x), (y) y (z) conjuntamente en la puntuación de factor de predicción de supervivencia de DLBCL de múltiples variables general que crea una función que está relacionada de manera monótona con una ecuación de puntuación de factor de predicción de supervivencia de DLBCL de múltiples variables que usa cualquier combinación de los valores de factor de escala (x), (y) y (z) especificados anteriormente.

En algunas realizaciones de la invención, puede calcularse una puntuación de factor de predicción de supervivencia usando menos de la totalidad de los componentes génicos de la firma de GCB, la firma de estromal-1 y/o la firma de 24

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   estromal-2 enumerados en la tabla 1. Por ejemplo, las ecuaciones de predicción de supervivencia dadas a conocer en el presente documento pueden calcularse usando combinaciones matemáticas de las expresiones del 98% (38), el 95% (37), el 93% (36) o el 90% (35) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB, aproximadamente el 99% (aproximadamente 280), aproximadamente el 98% (aproximadamente 277), el 97% (aproximadamente 275), aproximadamente el 96% (aproximadamente 272), aproximadamente el 95% (aproximadamente 270), aproximadamente el 94% (aproximadamente 266), aproximadamente el 93% (aproximadamente 263), aproximadamente el 92% (aproximadamente 260), aproximadamente el 91% (aproximadamente 257) o aproximadamente el 90% (aproximadamente 255) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal-1, y/o el 99% (71), el 97% (70), el 96% (69), el 95% (68) el 93% (67), el 92% (66) o el 90% (65) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal-2 (en lugar de usar todos los genes correspondientes a una firma génica en la tabla 1 para calcular el valor de firma de GCB, el valor de firma de estromal-1 y/o el valor de firma de estromal-2, respectivamente). En otras realizaciones, las ecuaciones de predicción de supervivencia dadas a conocer en el presente documento pueden calcularse usando combinaciones matemáticas de las expresiones del 88% (34 genes), el 85% (33 genes), el 82% (32 genes), el 80% (31 genes) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB, aproximadamente el 89% (aproximadamente 252), aproximadamente el 88% (aproximadamente 249), aproximadamente el 87% (aproximadamente 246), aproximadamente el 86% (aproximadamente 243), aproximadamente el 85% (aproximadamente 241), aproximadamente el 84% (aproximadamente 238), aproximadamente el 83% (aproximadamente 235), aproximadamente el 82% (aproximadamente 232), aproximadamente el 81% (aproximadamente 229) o aproximadamente el 80% (aproximadamente 226) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal- 1, y/o el 89% (64), el 88% (63), el 86% (62), el 85% (61), el 83% (60), el 82% (59) o el 80% (58) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal-2 (en lugar de usar todos los genes correspondientes a una firma de gen en la tabla 1 para calcular el valor de firma de GCB, el valor de firma de estromal-1 y/o el valor de firma de estromal-2, respectivamente).

La invención también proporciona un método para usar una puntuación de factor de predicción de supervivencia de DLBCL para predecir la probabilidad de un resultado de supervivencia más allá de una cantidad de tiempo t tras el tratamiento para DLBCL. El método incluye calcular la probabilidad de un resultado de supervivencia para un sujeto usando la siguiente ecuación general: P(SO) = SO0(t)(exp((S)*(puntuación de factor de predicción de supervivencia))) En esta ecuación, P(SO) es la probabilidad del resultado de supervivencia del sujeto más allá del tiempo t tras el tratamiento para DLBCL, SO0(t) es la probabilidad de resultado de supervivencia, que corresponde al valor de tiempo más grande menor que t en una curva de resultado de supervivencia, y (s) es un factor de escala. El tratamiento para DLBCL puede incluir quimioterapia y la administración de rituximab. Puede calcularse una curva de supervivencia usando métodos estadísticos, tales como el modelo de riesgos proporcionales de Cox. Se expone información adicional referente a curvas de resultado de supervivencia en Lawless, Statistical Models and Methods for Lifetime Data, John Wiley and Sons (Nueva York 1982) y Kalbfleisch et al., Biometrika, 60: 267-79 (1973).

En una realización, el método de la invención incluye calcular la probabilidad de supervivencia global para un sujeto más allá de una cantidad de tiempo t tras el tratamiento para DLBCL. El método incluye calcular la probabilidad de un resultado de supervivencia para un sujeto usando la siguiente ecuación general: P(SO) = SO0(t)(exp(puntuación de factor de predicción de supervivencia)) En la ecuación, P(OS) es la probabilidad de supervivencia global del sujeto más allá del tiempo t tras el tratamiento para DLBCL, SO0(t) es la probabilidad de resultado de supervivencia de curva, que corresponde al valor de tiempo más largo en una curva de supervivencia que es menor que t, y el factor de escala de la ecuación general (s) = 1. El tratamiento para DLBCL puede incluir quimioterapia sola o en combinación con la administración de rituximab (R- CHOP).

En otra realización, el método de la invención incluye calcular la probabilidad de supervivencia libre de progresión para un sujeto más allá de una cantidad de tiempo t tras el tratamiento para DLBCL. El método incluye calcular la probabilidad de un resultado de supervivencia para un sujeto usando la siguiente ecuación general: P(PFS) = SO0(t)(exp(0,976*(puntuación de factor de predicción de supervivencia))) En esta ecuación, P(PFS) es la probabilidad de supervivencia libre de progresión del sujeto más allá del tiempo t tras el tratamiento para DLBCL, SO0(t) es la probabilidad de resultado de supervivencia libre de progresión de curva, que corresponde al valor de tiempo más largo en una curva de supervivencia que es menor que t, y el factor de escala de la ecuación general (s) = 0,976. El tratamiento para DLBCL puede incluir quimioterapia sola o en combinación con la administración de rituximab (R-CHOP).

Las ecuaciones anteriores para P(OS) y P(PFS) se generaron maximizando las probabilidades parciales del modelo de riesgos proporcionales de Cox dentro de los datos de LLMPP CHOP descritos a continuación en los ejemplos 1 y 2. Se consideraron modelos de riesgos proporcionales de Cox variables individuales separados para la supervivencia global P(OS) y para la supervivencia libre de progresión P(PFS) basándose en esta formulación de

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   puntuación del modelo. Se generaron factores de escala variables individuales (1,0 para supervivencia global y 0,997 para supervivencia libre de progresión) para cada modelo mediante la maximización de las probabilidades parciales dentro de los pacientes con R-CHOP descritos a continuación en los ejemplos 1 y 2.

En otras realizaciones, el factor de escala en la P(PFS) anterior puede variarse de manera que (en lugar de 0,976) el factor de escala (s) sea un valor entre 0,970 y 0,980, por ejemplo 0,971, 0,972, 0,973, 0,973, 0,974, 0,975, 0,977, 0,978 y 0,979.

La invención proporciona además un alineamiento seleccionado como diana que puede usarse para detectar los niveles de expresión de todos o casi todos los genes en una firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB), una firma de expresión génica de estromal-1 y/o una firma de expresión génica de estromal-2. Un alineamiento seleccionado como diana, tal como se usa en el presente documento, es un alineamiento dirigido a un conjunto limitado de genes y por tanto difiere de un alineamiento de genoma completo. El alineamiento seleccionado como diana de la invención puede incluir sondas para menos de 10.000 genes, menos de 8.000 genes, menos de 7.000 genes, menos de 6.000 genes, menos de 5.000 genes o menos de 4.000 genes. Generalmente, el alineamiento seleccionado como diana incluye sondas para al menos el 80% de los genes en una firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB), una firma de expresión génica de estromal-1 y/o una firma de expresión génica de estromal-2. Los alineamientos seleccionados como diana de la invención pueden usarse, por ejemplo, para detectar niveles de expresión para su uso en los métodos descritos en el presente documento.

La invención proporciona un alineamiento seleccionado como diana que incluye sondas para todos los genes en la firma de expresión génica de estromal-1. La invención también proporciona un alineamiento seleccionado como diana que incluye sondas para todos los genes en la firma de expresión génica de estromal-2. Adicionalmente, la invención proporciona un alineamiento seleccionado como diana que incluye sondas para todos los genes en la firma de expresión génica de estromal-1 y todos los genes en la firma de expresión génica de estromal-2. Además, la invención proporciona un alineamiento seleccionado como diana que incluye sondas para todos los genes en la firma de expresión génica de estromal-1, todos los genes en la firma de expresión génica de estromal-2 y todos los genes en la firma de GCB.

En determinadas realizaciones, los alineamientos de la invención pueden incluir el 98% (38), el 95% (37), el 93% (36) o el 90% (35) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB, aproximadamente el 99% (aproximadamente 280), aproximadamente el 98% (aproximadamente 277), el 97% (aproximadamente 275), aproximadamente el 96% (aproximadamente 272), aproximadamente el 95% (aproximadamente 270), aproximadamente el 94% (aproximadamente 266), aproximadamente el 93% (aproximadamente 263), aproximadamente el 92% (aproximadamente 260), aproximadamente el 91% (aproximadamente 257), o aproximadamente el 90% (aproximadamente 255) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal- 1, y/o el 99% (71), el 97% (70), el 96% (69), el 95% (68) el 93% (67), el 92% (66) o el 90% (65) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal-2 (en lugar de todos los genes enumerados en la tabla 1 para el promedio de firma de GCB, el promedio de firma de estromal-1 y/o el promedio de firma de estromal-2, respectivamente). En determinadas realizaciones, los alineamientos de la invención pueden incluir el 88% (34 genes), el 85% (33 genes), el 82% (32 genes), el 80% (31 genes) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB, aproximadamente el 89% (aproximadamente 252), aproximadamente el 88% (aproximadamente 249), aproximadamente el 87% (aproximadamente 246), aproximadamente el 86% (aproximadamente 243), aproximadamente el 85% (aproximadamente 241), aproximadamente el 84% (aproximadamente 238), aproximadamente el 83% (aproximadamente 235), aproximadamente el 82% (aproximadamente 232), aproximadamente el 81% (aproximadamente 229) o aproximadamente el 80% (aproximadamente 226) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal-1, y/o el 89% (64), el 88% (63), el 86% (62), el 85% (61), el 83% (60), el 82% (59) o el 80% (58) de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de estromal-2 (en lugar de todos los genes enumerados en la tabla 1 para el promedio de firma de GCB, el promedio de firma de estromal-1 y/o el promedio de firma de estromal-2, respectivamente).

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

EJEMPLO 1 Este ejemplo demuestra que se encontraron diferencias significativas entre los resultados de supervivencia para pacientes con DLBCL ABC y DLBCL GCB tratados con R-CHOP y que el resultado de supervivencia se correlacionaba con tres firmas de expresión génica de pronóstico.

Se obtuvieron datos clínicos y muestras de biopsias tumorales antes del tratamiento de 414 pacientes con DLBCL de novo tratados en 10 instituciones en América del Norte y Europa y se estudiaron según un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional del National Cancer Institute. Los pacientes incluidos en una “cohorte de LLMP CHOP” de 181 pacientes se trataron con combinaciones a base de antraciclina, lo más a menudo ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona (CHOP) o regímenes similares, tal como se describió anteriormente (Rosenwald et al., N. Engl. J. Med., 346: 1937-47 (2002)). Los 233 pacientes restantes constituyeron una cohorte de R-CHOP que recibió quimioterapia similar más rituximab. La mediana del seguimiento en la cohorte de R-CHOP fue de 2,1 años (2,8 años para los supervivientes). Un panel de hematopatólogos expertos confirmó el diagnóstico de 26

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   DLBCL usando los criterios actuales de la OMS. En la tabla 2 se describen características clínicas adicionales de los pacientes para la cohorte de R-CHOP. Un análisis adicional usó una segunda cohorte de “MMMNLP CHOP” de 177 pacientes estudiados por el Molecular Mechanisms of Non-Hodgkin’s Lymphoma Network Project (Hummel et al., N. Engl. J. Med., 354: 2419-30 (2006)).

Tabla 2: Características clínicas de pacientes con DLBCL tratados con R-CHOP

% de DLBCL de

% de DLBCL

% del

% de DLBCL no

tipo células B de

de tipo células

Valor de

Característica

total

clasificado

centro germinal

B activadas

P

(N=233)

(N=33)

(N=107)

(N=93)

Edad > 60 años 52 47 63 39 0,02 Estadio de Ann Arbor > II 54 48 62 0,06 Lactato deshidrogenasa> 48 43 58 41 0,06 1x Normal N.º de sitios 14 14 0,8 extraganglionares >1 Estado funcional del 17 33 27 0,02 Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) Puntuación del índice de <0,001 pronóstico internacional (IPI) 0 ó 1 41 21 2 ó 3 46 33 63 38 4 ó 5 13 12 12 Puntuación de IPI <0,001 revisada 0 19 27 28 1 ó 2 56 52 64 48 3-5 21 31 24 Se realizó la obtención de perfiles de expresión génica usando micromatrices de Affymetrix U133+ 2.0. Los datos de la obtención de perfiles de expresión génica están disponibles a través del sitio web del National Center for Biotechnology Information tal como se describe en Lenz et al., New Engl. J. Med, 359: 2313-23 (2008), en la página 2314. Se normalizaron todos los datos de alineamientos de expresión génica usando el software MAS 5.0, y se transformaron mediante log2. Para explicar las diferencias técnicas en el procesamiento de micromatrices entre los datos de la cohorte de R-CHOP y los datos de la cohorte de LLMPP CHOP, se ajustaron los valores de expresión de cada gen en los datos de la cohorte de R-CHOP de modo que su mediana coincidiera con la mediana de los datos de LLMPP CHOP.

La identificación de firmas de expresión génica y el desarrollo de un modelo de factores de predicción de supervivencia se basaron únicamente en los datos del conjunto de entrenamiento de LLMPP CHOP. No se realizaron análisis de subgrupos o análisis de supervivencia previos con los conjuntos de prueba (cohortes de MMMLNP CHOP y R-CHOP). Se usó el modelo de Cox para identificar genes asociados con supervivencia en el conjunto de entrenamiento de CHOP y para construir modelos de supervivencia de múltiples variables. Los modelos y sus coeficientes de escala asociados se fijaron basándose en el conjunto de entrenamiento de CHOP y se evaluaron entonces en los conjuntos de prueba. Se calcularon los valores de P de los efectos de supervivencia de variables continuas tales como expresión génica o expresión de firma con la prueba de razón de probabilidades de Cox. Se calculó la significación de los efectos de supervivencia basados variables diferenciadas tales como el subtipo de linfoma o el índice de pronóstico internacional (IPI) usando la prueba de rangos logarítmicos. Los valores de P de validación presentados son unilaterales en la dirección observada en el conjunto de entrenamiento. El resto de los otros valores de P eran bilaterales. Se estimaron curvas de supervivencia usando el método de Kaplan-Meier.

Todos los aspectos de la identificación de firmas de expresión génica y el desarrollo de un modelo de factores de predicción de supervivencia se basaron únicamente en los datos del conjunto de entrenamiento de CHOP. No se realizaron análisis de subgrupos o análisis de supervivencia previos con los conjuntos de prueba (cohortes de MMMLNP CHOP y R-CHOP). Se usó el modelo de Cox para identificar genes asociados con supervivencia en el conjunto de entrenamiento de CHOP y para construir modelos de supervivencia de múltiples variables. Los modelos y sus factores de escala asociados se fijaron basándose en el conjunto de entrenamiento de CHOP y se evaluaron entonces en los conjuntos de prueba.

Puesto que los subtipos de ABC y GCB DLBCL tienen distintas tasas de supervivencia global con quimioterapia con CHOP (Rosenwald et al., N. Engl. J. Med., 346: 1937-47 (2002); Alizadeh et al., Nature, 403:503-11(2000); Hummel

et al., N. Engl. J. Med., 354:2419-30 (2006); Monti, Blood, 105:1851-61(2005)), se sometió a prueba si esta distinción 27

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   sigue siendo significativa para el pronóstico entre pacientes tratados con R-CHOP (Coiffier et al, N. Engl. J. Med., 346: 235-42 (2002)). Se determinaron los perfiles de expresión génica para muestras de biopsia antes del tratamiento de un “conjunto de entrenamiento” de 181 pacientes tratados con quimioterapia con CHOP o similar a CHOP solo y de un “conjunto de prueba” de 233 pacientes tratados con R-CHOP. Los pacientes en estas dos cohortes eran comparables con respecto al intervalo de edad y distribución de las variables clínicas de pronóstico que constituyen el índice de pronóstico internacional (IPI) (tabla 2). En la cohorte de R-CHOP, los pacientes con DLBCL GCB tenían mejores tasas de supervivencia que aquéllos con DLBCL ABC. Específicamente, los pacientes con DLBCL GCB y DLBCL ABC tratados con R-CHOP tenían tasas de supervivencia global a los 3 años del 84% y el 56%, respectivamente, y tasas de supervivencia libre de progresión a los 3 años del 74% y el 40%, respectivamente (figuras 1A y 1B). En el conjunto de entrenamiento de CHOP, y en una segunda cohorte de “MMMLMP” CHOP (Hummel et al., citado anteriormente), las tasas de supervivencia global para DLBCL ABC y DLBCL GCB fueron menores que en la cohorte de R-CHOP (figura 6). El análisis de múltiples variables indicó que el beneficio relativo (es decir, el cambio en el resultado de supervivencia) debido a la terapia con R-CHOP (en comparación con CHOP) no era significativamente diferente entre DLBCL ABC y GCB.

Se ha mostrado anteriormente que cuatro firmas de expresión génica tienen significación en el pronóstico en pacientes con DLBCL tratados con CHOP (Rosenwald et al., citado anteriormente). De éstas, la firma de GCB y la firma de ganglio linfático estaban asociadas con supervivencia favorable, y la firma de proliferación estaba asociada con supervivencia inferior dentro del conjunto de entrenamiento de CHOP, en la cohorte de MMMLNP CHOP (véanse los paneles de firmas correspondientes en la figura 7), y en la cohorte de R-CHOP (véanse los paneles de firmas correspondientes en la figura 1C). Por tanto, las diferencias biológicas entre tumores de DLBCL reflejadas por estas tres firmas siguen siendo importantes para el pronóstico en pacientes tratados con rituximab, aun cuando el tratamiento con rituximab mejoró en general la supervivencia en DLBCL.

Las cuarta firma de expresión génica restante, la firma de MHC de clase II, que estaba asociada con supervivencia en el conjunto de entrenamiento de CHOP cuando se trataba como una variable continua, no estaba asociada con supervivencia en la cohorte de R-CHOP (véase también el panel de firmas de MHC de clase II en la figura 1C). Además, tumores con expresión de “resultados atípicos” extremadamente baja de esta firma estaban asociados con supervivencia inferior en ambas cohortes de CHOP (véanse las figuras 8A y 8B), pero no en la cohorte de R-CHOP (véase la figura 8C).

Los resultados anteriores indican que la inmunoterapia con rituximab combinada con quimioterapia (R-CHOP) es beneficiosa para los subtipos tanto ABC como GCB de DLBCL y que las firmas de expresión génica que predecían la supervivencia en el contexto de la quimioterapia con CHOP mantenían su poder de pronóstico entre pacientes tratados con R-CHOP.

Los resultados anteriores también indican que la variación biológica entre tumores de DLBCL, tal como se mide mediante las firmas de expresión génica, tiene una relación constante con la respuesta terapéutica independientemente del régimen de tratamiento usado. Hay una diferencia sorprendente en la supervivencia libre de progresión a los 3 años entre pacientes con DLBCL ABC y pacientes con DLBCL GCB tratados con R-CHOP (el 40% frente al 74%). Esta diferencia se debe probablemente a diferencias genéticas y biológicas entre estos subtipos de DLBCL (Staudt et al., Adv. Immunol., 87: 163-208 (2005)).

Por tanto, futuros ensayos clínicos en DLBCL deben incorporar métodos cuantitativos para discernir estas diferencias biológicas de modo que las cohortes de pacientes en diferentes ensayos puedan compararse y las respuestas al tratamiento puedan relacionarse con fenotipos tumorales definidos.

EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra el desarrollo de firmas de supervivencia de GCB, estromal-1 y estromal-2 y un modelo de múltiples variables de supervivencia para DLBCL tratado con R-CHOP.

A menos que se indique otra cosa, las cohortes de pacientes y los métodos de análisis de la expresión génica son tal como se describen en el ejemplo 1.

En los datos de la cohorte de LLMPP CHOP, se identificaron 936 genes como asociados con mal pronóstico p<0,01 (unilateral). Para genes que tienen múltiples conjuntos de sondas de alineamientos asociados con supervivencia, sólo se usó el conjunto de sondas con la asociación más fuerte con supervivencia. Entonces se agruparon los valores de expresión de los conjuntos de sondas en los datos de la cohorte de LLMPP CHOP. Se identificó la mayor agrupación con una correlación promedio de >0,6 y que contenía myc como la firma de supervivencia de proliferación. Se identificaron 1396 genes como asociados con resultado favorable. Se identificó la mayor agrupación con una correlación promedio de >0,6 y que contenía BCL6 como firma de supervivencia de células B de centro germinal (GCB). Se identificó una agrupación con una correlación promedio de >0,6 y que contenía FNl como firma de supervivencia de estromal-1, mientras que se identificó otra agrupación con una correlación promedio de >0,6 que contenía HLADRA como firma de supervivencia de MHC de clase II. Entonces se calculó el promedio de los niveles de expresión de genes dentro de cada firma para crear un “promedio de firma” para cada muestra de biopsia. Para el conjunto de datos de MMMLNP CHOP, se calculó el promedio para los elementos de alineamientos 28

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   representados en la micromatriz de Affymetrix U133A.

De las cuatro firmas o agrupaciones de pronóstico, se usaron dos firmas, la firma de estromal-1 y de GCB para crear el mejor modelo de supervivencia de dos variables. Ni la firma de proliferación ni la de MHC de clase II se añadieron al valor de pronóstico de este modelo de dos variables. Este modelo de dos variables funcionó bien en la cohorte de MMMLNP CHOP (figura 9A) y en la cohorte de R-CHOP (figura 2A).

Se usó el conjunto de entrenamiento de CHOP para descubrir y refinar firmas que se añadieron a la significación de pronóstico de este modelo de dos variables, y se sometieron a prueba los modelos de múltiples variables resultantes en la cohorte de R-CHOP. Se identificó que 563 genes se añadían al modelo en la dirección de pronóstico adverso. Estos genes se agruparon mediante agrupamiento jerárquico, y se identificaron tres agrupaciones de más de 10 genes con una correlación promedio de >0,6. Además, se identificaron 542 genes que se añadieron al modelo de firma de estromal-1 y de GCB en la dirección de pronóstico favorable. Se agruparon estos genes, y se identificaron dos agrupaciones de más de 10 genes con una correlación promedio de >0,6. Se determinaron los promedios de las firmas para estas agrupaciones, y se formaron tres modelos de variables que contenían la firma de estromal-1 y de GCB y se formó cada uno de los promedios de agrupaciones en los conjuntos de datos de MMMLNP CHOP y R- CHOP. De los cinco promedios de agrupaciones, se encontró que dos añadían significación estadística (p<0,02) en los datos de MMMLNP CHOP en comparación con un modelo que contenía las firmas de estromal-1 y de GCB solo. En cambio, en los datos de R-CHOP, se encontró que tres de cinco promedios de agrupaciones añadían significación (p<0,02) al modelo de dos variables. Uno de estos promedios de agrupaciones se añadió significativamente al modelo de dos variables en los datos de tanto MMMLNP CHOP como R-CHOP. También se encontró que esta firma, designada firma 122, se añadía a la firma de estromal-1 y de GCB mucho más significativamente que cualquiera de las otras cuatro firmas en los datos de LLMPP CHOP y, por tanto, se mantuvo para su análisis adicional.

La firma 122 se añadía significativamente al modelo de dos variables tanto en la cohorte de MMMLNP CHOP (p=0,011) como en la cohorte de R-CHOP (p=0,001) (figuras 9B y 9C). Esta firma 122 se correlacionaba positivamente con la firma de estromal-1, aunque estaba asociada con supervivencia adversa cuando se añadía al modelo de dos variables. Para refinar adicionalmente el modelo, se identificaron genes que estaban más correlacionados con la firma 122 que con la firma de estromal-1 (p<0,02). Se organizaron estos genes mediante agrupamiento jerárquico, y se observaron tres conjuntos de genes correlacionados (r>0,6). Una de estas agrupaciones, la firma de estromal-2, se añadió a la significación del modelo de dos variables tanto en la cohorte de MMMLNP CHOP (p=0,002) como en la cohorte de R-CHOP (p<0,001) (figuras 2B y 9D).

Se formó un modelo de supervivencia de múltiples variables ajustando un modelo de Cox con las firmas de GCB, de estromal-1 y de estomal-2 a los datos de la cohorte de LLMPP CHOP mostrados en la tabla 3. Entonces se evaluó este modelo de múltiples variables final con sus coeficientes de escala asociados en los conjuntos de datos de las cohortes de MMLLMPP CHOP y R-CHOP. Se usaron las puntuaciones de factores de predicción de supervivencia del modelo final para dividir la cohorte de R-CHOP en grupos de cuartil con tasas de supervivencia global a los 3 años del 89%, el 82%, el 74% y el 48%, y tasas de supervivencia libre de progresión a los 3 años del 84%, el 69%, el 61% y el 33% (figura 2B). Las puntuaciones de factores de predicción de supervivencia del modelo final se ilustran en la figura 3 junto con las firmas de tres componentes y genes representativos de cada firma.

29

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34

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36

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   El índice de pronóstico internacional (IPI), que se basa en 5 variables clínicas, predice la supervivencia en pacientes tanto tratados con CHOP como tratados con R-CHOP (Shipp et al., N. Engl. J. Med., 329:987-94 (1993); Sehn et al., Blood, 109: 1857-61 (2007)). El modelo de supervivencia basado en la expresión génica de la invención conservó su significación de pronóstico entre pacientes tratados con R-CHOP segregados según el IPI en grupos de riesgo alto, intermedio y bajo, tanto tal como se definió originalmente (Shipp et al., citado anteriormente) (p<0,001) (figura 2C) como tal como se modificó recientemente para DLBCL tratado con R-CHOP (Sehn et al., citado anteriormente) (p<0,001) (figura 10).

Los resultados anteriores indican que el modelo de múltiples variables basado en la expresión génica puede usarse para identificar grandes disparidades en la supervivencia entre pacientes con diferentes perfiles de firmas genes de DLBCL. Por tanto, se usaron las puntuaciones de factores de predicción de supervivencia para dividir a los pacientes en grupos de cuartil menos y más favorables que tienen tasas de supervivencia libre de progresión a los 3 años del 33% y el 84%, respectivamente. Dada su independencia estadística del IPI, el factor de predicción de supervivencia basado en la expresión génica proporciona una vista complementaria de la variación de DLBCL que puede considerarse cuando se analizan datos de ensayos clínicos de DLBCL. Adicionalmente, los resultados anteriores indican que los perfiles de expresión génica del genoma completo conjuntamente con el modelo de supervivencia descrito en el presente documento pueden usarse para proporcionar predicciones óptimas de resultados de supervivencia esperados para sujetos que padecen DLBCL.

EJEMPLO 3 Este ejemplo demuestra el uso de una puntuación de factor de predicción de supervivencia para predecir la probabilidad de resultados de supervivencia global y libre de progresión en un periodo de tiempo t tras el tratamiento con R-CHOP según la invención.

Se aísla ARN de la biopsia de DLBCL de un paciente y se hibrida con un alineamiento U133+ de Affymetrix (Santa Clara, CA). Se escanea el alineamiento, y se aplica el algoritmo MAS 5.0 para obtener valores de señal normalizados a una intensidad objetivo de 500. Los valores de señal se transforman mediante log2 en valores de intensidad. Para genes de interés con múltiples conjuntos de sondas, se calcula el promedio del valor de intensidad de los múltiples conjuntos de sondas para obtener un único valor de intensidad para cada gen. Se calcula el promedio de los valores de intensidad únicos de genes en la firma de GCB para obtener un promedio de firma de GCB de 9,2. Se calcula el promedio de los valores de intensidad únicos en la firma de estromal-1 para obtener un promedio de firma de estromal-1 de 8,5. Se calcula el promedio de los valores de intensidad únicos de genes en la firma de estromal-2 para obtener un promedio de firma de estromal-2 de 7,2.

Se calcula la puntuación de factor de predicción de supervivencia del paciente usando la siguiente ecuación 8,11 - [0,419*(promedio de firma de GCB)] - [1,015*(promedio de firma de estromal-1)] + [0,675*(promedio de firma de estromal-2)], de manera que la puntuación de factor de predicción de supervivencia = 8,11 - [0,419*(9,2)] - [1,015*(8,5)] + [0,675*(7,2)] = 0,389 La tabla 4 incluye valores de una curva de supervivencia libre de progresión generada usando funciones de riesgo iniciales calculadas a partir de los datos de pacientes con R-CHOP descritos en la tabla 3. Se generó la curva según los métodos de Kalbfleisch y Prentice, Biometrika, 60: 267-279 (1973), que implican maximizar la probabilidad total, suponiendo que los coeficientes de escala verdaderos eran iguales a las estimaciones previas. En la tabla 4, F0(t) es la probabilidad de supervivencia libre de progresión para cada periodo de tiempo indicado tras el tratamiento con R- CHOP (t-R-CHOP).

Tabla 4

t-RCHOP (años)

F0(t)

0,000 1,000 0,008 0,997 0,016 0,993 0,025 0,990 0,030 0,987 0,036 0,983 0,049 0,980 0,082 0,977 0,096 0,973 0,107 0,970 0,118 0,967 0,120 0,963 0,156 0,960 0,156 0,956 0,159 0,953 0,178 0,950 37

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

t-RCHOP (años)

F0(t)

0,192 0,946 0,211 0,943 0,233 0,939 0,241 0,936 0,246 0,932 0,252 0,928 0,290 0,925 0,298 0,921 0,307 0,918 0,364 0,914 0,381 0,910 0,381 0,907 0,400 0,903 0,441 0,899 0,446 0,895 0,463 0,891 0,468 0,887 0,515 0,884 0,517 0,880 0,531 0,876 0,534 0,872 0,537 0,868 0,537 0,864 0,539 0,860 0,561 0,856 0,586 0,852 0,611 0,848 0,679 0,843 0,698 0,839 0,698 0,834 0,720 0,830 0,747 0,826 0,756 0,821 0,761 0,816 0,767 0,812 0,786 0,807 0,849 0,803 0,879 0,798 0,884 0,793 0,898 0,789 0,912 0,784 0,977 0,779 0,986 0,774 1,046 0,770 1,057 0,765 1,076 0,760 1,128 0,755 1,166 0,750 1,216 0,745 1,227 0,740 1,270 0,735 1,481 0,729 1,547 0,724 1,624 0,718 1,900 0,711 1,919 0,705 2,105 0,699 2,231 0,692 2,245 0,685 2,352 0,678 2,546 0,671 2,968 0,662 38

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

t-RCHOP (años)

F0(t)

3,890 0,648 4,364 0,623 Se calcula la probabilidad de supervivencia libre de progresión a los 2 años del paciente usando la ecuación: P(PFS) = F0(t)(exp(0-976*puntuación de factor de predicción de supervivencia)), en la que F0(t) es el valor de F0(t) que corresponde al valor de tiempo más largo menor de 2 años en la curva de supervivencia libre de progresión. En la tabla 4, el valor de tiempo más largo menor de 2 es 1,919, y el valor de PF0(t) correspondiente es 0,705. Por consiguiente, la probabilidad de supervivencia libre de progresión a los 2 años del paciente P(PFS) = 0,705(exp(0,976*puntuación de factor de predicción de supervivencia)) = 0,7051,462 = 0,600 o de aproximadamente el 60%.

La tabla 5 incluye valores de una curva de supervivencia global generada usando funciones de riesgo iniciales calculadas a partir de los datos de pacientes con R-CHOP en la tabla 3. Se preparó la curva según el método de Kalbfleisch y Prentice, Biometrika, 60: 267-279 (1973), que implica maximizar la probabilidad total, suponiendo que los coeficientes de escala verdaderos eran iguales a las estimaciones. En la tabla 5, OS0(t) es la probabilidad de supervivencia global para cada periodo de tiempo indicado tras el tratamiento con R-CHOP (t-R-CHOP).

Tabla 5

t-RCHOP (años)

OS0(t)

0,000 1,000 0,008 0,997 0,016 0,994 0,030 0,991 0,033 0,988 0,036 0,984 0,049 0,981 0,082 0,978 0,096 0,975 0,156 0,972 0,156 0,969 0,159 0,965 0,178 0,962 0,192 0,959 0,211 0,956 0,233 0,952 0,246 0,949 0,307 0,946 0,367 0,942 0,380 0,939 0,386 0,935 0,402 0,932 0,416 0,928 0,463 0,925 0,468 0,921 0,504 0,918 0,515 0,914 0,517 0,910 0,531 0,907 0,556 0,903 0,586 0,900 0,610 0,896 0,619 0,892 0,698 0,888 0,747 0,885 0,807 0,881 0,862 0,877 0,868 0,873 0,873 0,869 0,895 0,864 0,944 0,860 0,963 0,856 1,010 0,852 1,057 0,848 39

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015  

t-RCHOP (años)

OS0(t)

1,169 0,843 1,169 0,839 1,215 0,835 1,262 0,830 1,273 0,826 1,382 0,821 1,412 0,817 1,492 0,812 1,527 0,807 1,552 0,802 1,708 0,796 1,889 0,791 2,244 0,784 2,693 0,777 3,826 0,763 3,889 0,749 4,363 0,724 Se calcula la probabilidad de supervivencia global a los 2 años del paciente usando la ecuación: P(OS) = OS0(t)(exp(puntuación de factor de predicción de supervivencia)), en la que OS0(t) es el valor que corresponde al valor de tiempo más largo en la curva de supervivencia global que es menor de 2 años. En la tabla 5, el valor de tiempo más largo menor de 2 es 1,889, y el valor de OS0(t) correspondiente es 0,791. Por consiguiente, la probabilidad de supervivencia global a los 2 años del paciente es P(PFS) = 0,791(exp(0,389)) = 0,7911,4476 = 0,707 o el 70,7%.

EJEMPLO 4 Este ejemplo demuestra la base biológica para las firmas de pronóstico de DLBCL.

A menos que se indique otra cosa, en los ejemplos 1 y 2 se describen cohortes y métodos de análisis de la expresión génica. Además, se separaron suspensiones celulares de tres biopsias mediante citometría de flujo en una subpoblación maligna CD19+ y una subpoblación no maligna CD19-. Se realizó la obtención de perfiles de expresión génica tras dos rondas de amplificación lineal a partir de ARN total (Dave et al., N. Engl. J. Med., 351: 2159-69 (2004)). Tras la normalización con MAS5.0, se seleccionaron genes que tenían un valor de señal de log2 mayor de 7 en las fracciones o bien CD19+ o bien CD19- en al menos dos de las muestras clasificadas.

Para evaluar si las la firmas de expresión génica en el modelo de supervivencia final del ejemplo 2 se derivaban de las células de linfoma malignas o del microentorno del huésped, se fraccionaron tres muestras de biopsia de DLBCL en células malignas CD19+ y células no malignas CD19- mediante clasificación celular. La mayoría de los genes de firma de células B de centro germinal se expresaban más en la fracción maligna, mientras que los genes de las firmas de estromal-1 y estromal-2 se expresaban más en la fracción estromal no maligna (figura 4A), de ahí su nombre. Puesto que estas dos firmas eran sinérgicas en la predicción de la supervivencia, se combinaron en una “puntuación estromal” (figura 3), cuyos altos valores estaban asociados con resultado adverso.

La firma de células B de centro germinal se refiere a la distinción entre los subtipos de DLBCL ABC y GCB (figura 3). En cambio, los genes que definen la firma de estromal-1 codifican para componentes de la matriz extracelular, incluyendo fibronectina, osteonectina, diversas isoformas de colágeno y laminina, y el factor antiangiogénico trombospondina (figura 3 y tabla 1). Esta firma también codifica para modificadores de la síntesis de colágeno (LOXL1, SERPINH1), proteínas que remodelan la matriz extracelular (MMP2, MMP9, MMP14, PLAU, TIMP2), y CTGF, una proteína secretada que puede iniciar respuestas fibróticas (Frazier et al., J. Invest. Dermatol., 107(3): 404-11 (1996)). Además, la firma de estromal-1 incluye genes expresados de manera característica en células del linaje monocítico, tales como CEBPA y CSF2RA.

La firma de estromal-1 está relacionada significativamente con varias firmas de expresión génica curadas anteriormente (Shaffer et al., Immunol. Rev., 210: 67-85 (2006)) basándose en análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (Subramanian et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 102(43): 15545-50 (2005)). Dos de estas firmas incluyen genes que se expresan de manera coordinada en tejidos mesenquimales normales pero no en subconjuntos hematopoyéticos, muchos de los cuales codifican para proteínas de la matriz extracelular (tasa de falso descubrimiento (FDR) < 0,001) (figuras 4B y 11) (Su et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 101: 6062-7 (2004)).

También se enriqueció una firma de “monocitos”, compuesta por genes que se expresan más en monocitos de la sangre CD14+ que en células B, células T o células NK (FDR=0,014) (figura 4B). En cambio, una firma de células pan-T no estaba relacionada con la firma de estromal-1 (figura 4B). Estos hallazgos sugieren que una alta expresión de la firma de estromal-1 identifica tumores con deposición vigorosa de matriz extracelular e infiltración por células del linaje monocítico.

En este sentido, el producto génico de la firma de estromal-1, fibronectina, se localizada de manera destacada

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   mediante inmunohistoquímica en hebras fibrosas que discurren entre las células malignas en muestras de biopsia de DLBCL, lo que concuerda con su papel en la formación de la matriz extracelular. En cambio, los productos de proteína de los otros tres genes de estromal-1 (MP9, SPARC y CTGF) se localizaban principalmente en células histiocíticas que se infiltraban en las biopsias de DLBCL. Mediante inmunofluorescencia, SPARC y CTGF se localizaban conjuntamente con CD68, que es un marcador para células del linaje monocítico. Tal como se esperaba para un producto génico de estromal-1, los niveles de proteína SPARC estaban asociados con supervivencia global favorable (figura 5A).

La firma de estromal-1 incluye genes que se expresan de manera coordinada en muchos tejidos mesenquimales normales, la mayoría de los cuales codifican para proteínas que forman o modifican la matriz extracelular. La localización de fibronectina en hebras fibrosas insinuada entre las células de linfoma malignas sugiere que la firma de estromal-1 refleja la naturaleza fibrótica de muchos tumores de DLBCL. Esta reacción fibrótica puede relacionarse con otro componente de la firma de estromal-1, CTGF, que participa en muchas respuestas y enfermedades fibróticas, y que promueve el crecimiento tumoral y la metástasis de cánceres epiteliales (Shi-Wen et al., Cytokine Growth Factor Rev., 19: 133-44 (2008)).

Los resultados anteriores también indican que la firma de estromal-1 refleja una reacción del huésped rica en monocitos al linfoma que está asociada con la deposición abundante de matriz extracelular. Tumores con alta expresión de la firma de estromal-1 estaban infiltrados por células del linaje mieloide, que incluyen células que se han implicado en la patogénesis cánceres epiteliales, incluyendo macrófagos asociados a tumores, células supresoras derivadas del linaje mieloide y monocitos que expresan Tie2 (revisado en Wels et al., Genes Dev., 22: 559-74 (2008)). En modelos animales, estas células del linaje mieloide promueven la invasión de células tumorales secretando metaloproteinasas de la matriz tales como MMP9, suprimen respuestas inmunitarias de células T e inician la angiogénesis.

Varios genes de firma de estromal-2 codifican para marcadores bien conocidos de células endoteliales. Estos incluyen factor de von-Willebrand (VWF) y CD31 (PECAM1), así como otros genes expresados específicamente en el endotelio tales como EGFL7, MMRN2, GPR116 y SPARCL (tabla 1). Esta firma también incluye genes que codifican para reguladores clave de la angiogénesis, tales como, por ejemplo, KDR (receptor de VEGF 2); Grb10, que media en la señalización de KDR; integrina alfa 9, que potencia la señalización de VEGF; TEK, la tirosina cinasa receptora para la citocina angiopoyetina; ROBO4, una molécula de guiado molecular específica del endotelio que regula la angiogénesis; y ERG, un factor de transcripción requerido para la formación de tubos endoteliales. Los genes de firma de estromal-2 CAV1, CA V2 y EHD2 codifican para componentes de caveolas, que son estructuras especializadas de la membrana plasmática que son abundantes en células endoteliales y se requieren para la angiogénesis (Frank et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 23: 1161-8 (2003); Woodman et al., Am. J. Pathol., 162: 2059-68 (2003)). Aunque la firma de estromal-2 incluye un gran número de genes expresados en células endoteliales, otros genes se expresan exclusivamente en adipocitos, incluyendo ADIPOQ, FABP4, RBP4 y PLIN.

Se realizaron pruebas cuantitativas para determinar si la expresión de la firma de estromal-2 en relación con la firma de estromal-1 (es decir, alta puntuación estromal) está relacionada con alta densidad de vasos sanguíneos tumorales, dada la conexión entre muchos genes de firma de estromal-2 y angiogénesis. Más específicamente, se restaron los promedios de firma de estromal-1 del promedio de firma de estromal-2 para obtener de ese modo una puntuación estromal para cada biopsia. Las pruebas mostraron una medida cuantitativa de la densidad de vasos sanguíneos que se correlacionaba significativamente con la puntuación estromal (r=0,483, p=0,019) (véanse las figuras 5B y 5C), de manera que densidades de vasos sanguíneos superiores se correlacionaban con puntuaciones estromales superiores.

Por tanto, las firmas de expresión génica de estromal-1 y estromal-2 reflejan el carácter de las células no malignas en tumores de DLBCL, y la firma de estromal-2 puede representar un “cambio angiogénico” en el que la progresión de una lesión hiperplásica a un tumor completamente maligno va acompañada por la formación de nuevos vasos sanguíneos (Hanahan et al., Cell, 86: 353-64 (1996)). Tumores de DLBCL con alta expresión relativa de la firma de estomal-2 estaban asociados con un aumento de la densidad de vasos sanguíneos tumorales y supervivencia adversa. La infiltración de macrófagos significativa en algunos tumores de DLBCL puede predisponer a angiogénesis puesto que, en modelos experimentales, se acumulan macrófagos asociados a tumores antes del cambio angiogénico y se requieren para que se produzca el cambio (Lin et al., Cancer Res., 66: 11238-46 (2006)). Adicionalmente, CXCL12 (SDF-1), un componente de la firma de estromal-2, es una quimiocina secretada o bien por fibroblastos o bien por células endoteliales que puede promover la angiogénesis reclutando células precursoras endoteliales CXCR4+ de la médula ósea (Orimo et al., Cell, 121: 335-48 (2005)). Además, un antagonista de la angiogénesis, trombospondina-2 (Kazerounian et al., Cell Mol. Life Sci., 65: 700-12 (2008)), es un componente de la firma de estromal-1, lo que puede explicar por qué muchos tumores con expresión relativa baja de esta firma tenían una densidad elevada de vasos sanguíneos. Además, la expresión de genes asociados a adipocitos en tumores de DLBCL con alta expresión de la firma de estromal-2 puede desempeñar un papel en la angiogénesis puesto que algunas células en el tejido adiposo pueden tener el potencial para diferenciarse en células endoteliales (Planat- Benard et al., Circulation, 109: 656-63 (2004)). Alternativamente, la expresión de genes asociados a tejido adiposo puede reflejar el reclutamiento de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, que se dirigen eficazmente a tumores (Karnoub et al., Nature, 449: 557-63 (2007)) y pueden estabilizar vasos sanguíneos recién formados (Au et al., Blood, 111: 4551-4558 (2008)).

41

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   Los resultados anteriores indican que las firmas de genes de estromal-1 y estromal-2 pueden usarse para generar una puntuación estromal que se correlaciona con un aumento de la densidad de vasos sanguíneos. Por tanto, la puntuación estromal puede usarse para determinar si un paciente con DLBCL es probable que se beneficie de la administración de la terapia antiangiogénica (sola, o conjuntamente con otro régimen terapéutico para DLBCL).

El uso de los términos “un” y “una” y “el/la” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique otra cosa en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” deben interpretarse como términos de extremos abiertos (es decir, que significan “que incluye, pero sin limitarse a,”) a menos que se indique otra cosa. La mención de intervalos de valores en el presente documento pretende meramente servir como método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionase individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o por lo demás se contradiga claramente por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o expresiones a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en el presente documento, pretende meramente esclarecer mejor la invención. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse que indica que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.

En el presente documento se describen realizaciones preferidas de esta invención, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Pueden resultar evidentes variaciones de esas realizaciones preferidas a los expertos habituales en la técnica tras la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos en la técnica empleen tales variaciones según sea apropiado.

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REIVINDICACIONES

1.

Método de predicción del resultado de supervivencia basándose en una o más muestras de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), método que comprende: a) aislar productos de expresión génica de una o más muestras de biopsia de DLBCL de un sujeto tratado con un régimen terapéutico que incluye quimioterapia y rituximab (R-CHOP); b) obtener un perfil de expresión génica a partir de los productos de expresión génica, en el que el perfil de expresión comprende un nivel de expresión para cada uno de al menos 31 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB) y al menos 226 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-1; c) determinar un valor de firma de GCB y un valor de firma estromal-1 a partir del perfil de expresión génica, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 31 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de GCB y el valor de firma de estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 226 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-1; d) calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia = A - [(x)*(el valor de firma de GCB)] - [(y)*(el valor de firma de estromal-1)], en la que A es un término de desviación, (x) es un factor de escala de entre 0,200 y 0,625, e (y) es un factor de escala de entre 0,800 y 1,250, y e) determinar el resultado de supervivencia para el sujeto basándose en la puntuación de factor de predicción de supervivencia calculada en la etapa d) para cualquier valor igual fijo de A y para cualquier valor igual fijo de (x) e (y), en el que una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia más favorable y una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia menos favorable para el sujeto.

2.

Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende: b) obtener un perfil de expresión génica a partir de los productos de expresión génica, en el que el perfil de expresión comprende un nivel de expresión para cada uno de al menos 31 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión de GCB, al menos 226 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-1 y al menos 58 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-2; c) determinar un valor de firma de GCB, un valor de firma estromal-1 y un valor de firma génica estromal-2 a partir del perfil de expresión génica, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 31 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de GCB y el valor de firma estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 226 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal-1 y el valor de firma estromal-2 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 58 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-2; y d) calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia = A - [(x)*(el valor de firma de GCB)] - [(y)*(el valor de firma de estromal-1)] + [(z)*(el valor de firma de estromal-2)], en la que A es un término de desviación, (x) es un factor de escala de entre 0,200 y 0,625, (y) es un factor de escala de entre 0,800 y 1,250 y (z) es un factor de escala de entre 0,450 y 0,900, y e) determinar el resultado de supervivencia para el sujeto basándose en la puntuación de factor de predicción de supervivencia calculada en la etapa d) para cualquier valor igual fijo de A y para cualquier valor igual fijo de (x), (y) y (z), en el que una puntuación inferior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia más favorable y una puntuación superior de factor de predicción de supervivencia indica un resultado de supervivencia menos favorable para el sujeto.

3.

Método según la reivindicación 2, en el que el método comprende d) calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia usando la ecuación: puntuación de factor de predicción de supervivencia = 8,11 - [0,419*(el valor de firma de GCB)] - [1,015*(el valor de firma de estromal-1)] + [0,675*(el valor de firma de estromal-2)] 4.

Método de predicción del resultado de supervivencia basándose en una o más muestras de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), método que comprende: a) aislar productos de expresión génica de una o más muestras de biopsia de DLBCL de un sujeto tratado con un régimen terapéutico que incluye quimioterapia y Rituximab (R-CHOP); b) obtener un perfil de expresión génica a partir de los productos de expresión génica, en el que el perfil de 43

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   expresión génica comprende un nivel de expresión para cada uno de al menos 31 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB), al menos 226 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-1 y al menos 58 de los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-2; c) determinar un valor de firma de GCB, un valor de firma estromal-1 y un valor de firma estromal-2 a partir del perfil de expresión génica, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 31 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de GCB y el valor de firma estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 226 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica de estromal-1 y el valor de firma estromal-2 es un promedio de los niveles de expresión de los al menos 58 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de expresión génica estromal-2; d) calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia usando la ecuación: puntuación de factor de predicción de supervivencia = A - [(x)*(el valor de firma de GCB)] - [(y)*(el valor de firma de estromal-1)] + [(z)*(el valor de firma de estromal-2)], en la que A es un término de desviación y (x) es un factor de escala de entre 0,200 y 0,625, (y) es un factor de escala de entre 0,800 y 1,250 y (z) es un factor de escala de entre 0,450 y 0,900; y e) calcular la probabilidad de un resultado de supervivencia para el sujeto más allá de una cantidad de tiempo t tras el tratamiento para DLBCL, en el que la probabilidad del resultado de supervivencia del sujeto P(SO) se calcula usando la ecuación: P(SO) = SO0(t)(exp((s)*puntuación de factor de predicción de supervivencia)), en la que SO0(t) es la probabilidad del resultado de supervivencia, que corresponde al valor de tiempo más largo menor que t en una curva de resultado de supervivencia, y en la que (s) es un factor de escala de entre 0,970 y 0,980.

5.

Método según la reivindicación 4, en el que el resultado de supervivencia es supervivencia global y el método comprende: d) calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia usando la ecuación: puntuación de factor de predicción de supervivencia = [0,419*(el valor de firma de GCB)] - [1,015*(el valor de firma estromal-1)] + [0,675*(el valor de firma estromal-2)]; y e) calcular la probabilidad de supervivencia global tras el tiempo t para el sujeto, en el que la probabilidad de supervivencia global del sujeto P(OS) se calcula usando la ecuación: P(OS) = OS0(t)(exp(puntuación de factor de predicción de supervivencia)) en la que OS0(t) es la probabilidad de supervivencia global, que corresponde al valor de tiempo más largo menor que t en una curva de supervivencia global.

6.

Método según la reivindicación 4, en el que el resultado de supervivencia es supervivencia libre de progresión y el método comprende: d) calcular una puntuación de factor de predicción de supervivencia usando la ecuación: puntuación de factor de predicción de supervivencia = 8,11 - [0,419*(el valor de firma de GCB)] - [1,015*(el valor de firma estromal-1)] + [0,675*(el valor de firma estromal-2)]; y e) calcular la probabilidad de supervivencia libre de progresión tras el tiempo t para el sujeto, en el que la probabilidad de supervivencia libre de progresión del sujeto P(PFS) se calcula usando la ecuación P(PFS) = F0(t)(exp(0,976*puntuación de factor de predicción de supervivencia)), en la que F0(t) es la probabilidad de supervivencia libre de progresión, que corresponde al tiempo más largo menor que t en una curva de supervivencia, y en la que en el que el factor de escala (s) = 0,976.

7.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que la probabilidad de un resultado de supervivencia es la probabilidad de un resultado de supervivencia para el sujeto más allá de una cantidad de tiempo t tras el tratamiento para DLCBL que incluye quimioterapia y la administración de Rituximab.

8.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que el método incluye además proporcionar al sujeto la probabilidad calculada del resultado de supervivencia tras el tiempo t.

9.

Matriz diana que comprende al menos una sonda o conjunto de sondas para cada gen en (a) una firma de expresión génica de células B de centro germinal (GCB) que comprende al menos 31 de los genes de firma de GCB enumerados en la tabla 1, (b) una firma de expresión génica de estromal-1 que comprende al menos 226 de los genes de firma de estromal-1 enumerados en la tabla 1 y (c) una firma de expresión génica de estromal-2 que comprende al menos 58 de los genes de firma de estromal-2 enumerados en la tabla 1, en el que el alineamiento comprende sondas para menos de 10.000 genes.

10.

Matriz diana según la reivindicación 9, en el que la firma de expresión de GCB comprende al menos 37 de los genes de firma de GCB enumerados en la tabla 1, en el que la firma de expresión génica estromal-1 comprende al menos 270 de los genes de firma estromal-1 enumerados en la tabla 1, y en el que la firma 44

E09759517 ES 2 552 937 T3 10-11-2015   de expresión génica estromal-2 comprende al menos 68 de los genes de firma estromal-2 enumerados en la tabla 1.

11.

Método según la reivindicación 1, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de al menos 37 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB y el valor de firma estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de al menos 270 genes enumerados en la tabla 1 para la firma estromal-1.

12.

Método según la reivindicación 1, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de todos los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB y el valor de firma estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de todos los genes enumerados en la tabla 1 para la firma estromal-1.

13.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de al menos 37 genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB, el valor de firma estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de al menos 270 genes enumerados en la tabla 1 para la firma estromal-1 y el valor de firma estromal-2 es un promedio de los niveles de expresión de al menos 68 genes enumerados en la tabla 1 para el valor de firma estromal-2.

14.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que el valor de firma de GCB es un promedio de los niveles de expresión de todos los genes enumerados en la tabla 1 para la firma de GCB, el valor de firma estromal-1 es un promedio de los niveles de expresión de todos los genes enumerados en la tabla 1 para la firma estromal-1 y el valor de firma estromal-2 es un promedio de los niveles de expresión de todos los genes enumerados en la tabla 1 para el valor de firma estromal-2.

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