ENZIBIÓTICOS BACTERICIDAS MEJORADOS FRENTE A NEUMOCOCO Y OTRAS BACTERIAS.

Enzibióticos bactericidas mejorados frente a neumococo y otras bacterias.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. En la presente invención se presenta una secuencia polipeptídica derivada del módulo de unión a pared del enzima lítica del fago Cp7

(Cpl-7), que permite la construcción de nuevas enzimas líticas con actividad bactericida mejorada y amplio espectro. Igualmente, en esta invención se incluyen enzimas quiméricas que contienen dicho módulo de unión a pared mejorado y se dan ejemplos de su actividad frente a especies Gram-positivas y Gram-negativas.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201330777.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: GARCIA GONZALEZ,PEDRO, GARCIA LOPEZ, ERNESTO, MENÉNDEZ FERNÁNDEZ,Margarita, DÍEZ MARTÍNEZ,Roberto, DE PAZ FERNÁNDEZ,Héctor, BUSTAMANTE SPUCH,Noemí.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/47 (que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. celulosas, lactasas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos,... > A61P31/04 (Agentes antibacterianos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/24 (actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2))

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Fragmento de la descripción:

ENZIBIÓTICOS BACTERICIDAS MEJORADOS FRENTE A NEUMOCOCO Y OTRAS BACTERIAS

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que se une a la pared celular de diversos microorganismos (módulo de unión a pared) derivado de la enzima lítica del fago Cp-7 de Streptococcus pneumoniae. A este módulo de unión a pared se le pueden acoplar, mediante técnicas de biología molecular, diversos módulos catalíticos que degradan la pared bacteriana (mureín-hidrolasas) lo que genera enzimas líticas con un efecto bactericida tanto en neumococo como en otras bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

ESTADO DE LA TECNICA

Streptococcus pneumoniae, o neumococo, es un patógeno Gram-positivo y el principal agente causal de enfermedades infecciosas tan importantes como neumonía, sepsis y 15 meningitis. Los grupos de población más afectados son los niños menores de cinco años, los ancianos y los pacientes inmunodeprimidos. De hecho, según estimaciones recientes de la Organización Mundial de la Salud neumococo es la causa más común de las neumonías severas en niños de esas edades, tanto en países desarrollados como en los que están en vías de desarrollo (UNICEF, WHO, 2006. Pneumonia: the forgotten killer of

children.http://www.unicef.org/spanish/publications/files/Pneumonia_ The_Forgotten_Killer_of _Children.pdf) . En general, la tasa de mortalidad de las infecciones neumocócicas en la población pediátrica es mayor que la provocada por el SIDA, la malaria y el sarampión juntos (Wardlaw et al. 2006. Lancet 368: 1048-1050; Rudan y Campbell. 2009. Lancet 374: 854-856) .

En los últimos años se ha producido un generalizado incremento de cepas clínicas de neumococo resistentes a una variedad de antibióticos, sobre todo a los ¡3-lactámicos, lo que está provocando la búsqueda urgente de otros tratamientos o terapias alternativas para combatir este patógeno. En este contexto, el uso de mureín-hidrolasas líticas (enzimas que degradan de forma específica y eficaz el peptidoglicano bacteriano) codificadas por

bacterias o bacteriófagos constituye una prometedora línea de investigación para luchar contra las infecciones bacterianas. Ya se ha demostrado que este tipo de enzimas (denominadas enzibióticos) son eficaces para matar "in vivo" determinadas bacterias en una variedad de modelos animales (Fenton et al. 2010. Bioeng. Bugs 1: 9-16; Fischetti, VA. 2011. Bacteriophage 1:1-7) .

En el sistema de neumococo se han descrito varias mureín-hidrolasas, tanto bacterianas como fágicas (Hermoso et al. 2007. Curr. Opino Microbiol. 10: 461-472) . Todas ellas son enzimas modulares con un dominio responsable de la catálisis y otro de la unión al sustrato insoluble que es la pared celular. Todas estas enzimas con actividad mureín-hidrolasa son, con excepción de Cpl-7, dependientes de la presencia del aminoalcohol colina para su actividad enzimática. La lisozima Cpl-7, codificada por el fago Cp-7, es capaz de degradar paredes de neumococo conteniendo tanto colina como su análogo estructural etanolamina. Cpl-7 contiene un dominio de unión a la pared celular (C-Cpl-7) , formado por tres repeticiones idénticas (motivos CW_7) , completamente diferente al que comparten las otras enzimas colina-dependientes, lo que explica este comportamiento (García et al. 1990. Gene 86: 81-88) . Hasta el momento se ha demostrado la efectividad como agentes antibacterianos de Pal (Loeffler et al. 2001. Science 294: 2170-2172) , Cpl-1 (Jado et al. 2003. J. Antimicrob. Chemother. 52: 967-973) y LytA (Rodríguez-Cerrato et al. 2007. Antimicrob. Agents Chemother. 51: 3371-3373) usando diferentes modelos animales de infección neumocócica.

EXPLlCACION DE LA INVENCiÓN

El objeto principal de la presente invención es la construcción de nuevas mureín-hidrolasas capaces de degradar muy eficazmente la pared celular de neumococo y de otras especies bacterianas. Los inventores han modificado sustancialmente el módulo de unión a la pared bacteriana de la lisozima del fago Cp7 de S. pneumoniae, reduciendo su elevada carga neta negativa, para disminuir las interacciones electrostáticas desfavorables que se establecen entre la envuelta celular (negativamente cargada) y la enzima cuando ésta actúa desde el exterior de la bacteria (Low et al. 2011. J. Biol. Chem. 286: 34391-34403) . Las modificaciones introducidas en las tres repeticiones que constituyen el módulo de unión al sustrato (C-Cpl-7) provocan que tenga mayor facilidad de acceso e interacción con la pared bacteriana (peptidoglicano) y, en consecuencia, su capacidad lítica y bactericida sea mayor que la de la Cpl-7 silvestre, no solo frente a S. pneumoniae sino también frente a otras bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En el caso de neumococo, la gran capacidad bactericida de las nuevas construcciones que emplean este módulo de unión a pared mejorado se extiende también a cepas multirresistentes a diversos antibióticos de amplia importancia clínica.

Asimismo, esta invención también aporta otras construcciones quiméricas que emplean el mismo módulo de unión a la pared celular, combinado con módulos catalíticos mejorados 5 de Cpl-7 o Cpl-1, lo que demuestra la amplia versatilidad de enzibióticos que se pueden construir empleando las enzimas líticas ya conocidas.

EXPLICACiÓN DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invención describe una secuencia polipeptídica derivada del módulo de unión a pared del enzima lítica del fago Cp7 (Cpl-7) , que permite la construcción de nuevas enzimas 10 líticas con actividad bactericida mejorada y amplio espectro mediante la modificación de, al menos, 15 aminoácidos clave en la secuencia original o parental de partida C-Cpl-7. Igualmente, se describe la secuencia de nucleótidos codificante de dicho módulo así como construcciones genéticas derivadas que incluyen módulos catalíticos procedentes de otros fagos, o de Cpl-7 mejorados, que permiten la construcción de nuevas enzimas líticas con actividad bactericida mejorada y amplio espectro.

El punto de partida fue el módulo de unión a pared del enzima lítica del fago Cp7 (Cpl-7) descrito en (García et al. 1990. Gene 86: 81-88) . El procedimiento de mejora modificó la carga neta de las tres repeticiones que forman el dominio de unión a pared (C-Cpl-7) sin que los cambios de secuencia introducidos alteren el plegamiento de la proteína. La selección de las posiciones a modificar y el tipo de mutación introducida en cada posición se llevó a cabo teniendo en cuenta la conservación de secuencias dentro de la familia CW_7 (PF08230) y los modelos a alta resolución previamente generados para N-Cpl-7 (dominio catalítico Nterminal) y C-Cpl-7 (Bustamante et al. 2010. J. Biol. Chem. 285:33184-33196) .

Esta adaptación permite una sustancial mejora de la capacidad de unión del módulo peptídico de unión a pared, lo que combinado con su amplio espectro de bacterias a las que se une, lo convierte en una herramienta útil para el diseño de nuevos antibióticos con un espectro interespecies más amplio que los enzibióticos hasta ahora descritos (como ejemplos: US20120258088, W02013052643, W02010002959, W02008018854, US2007025978, US2005208038) dado que cubre tanto bacterias Gram-positivas como Gram-Negativas lo que permite que sean usadas como antibióticos en combinación con elementos que alteren la pared celular (enzibióticos) , o incluso en aplicaciones biotecnológicas como la purificación y/o concentración de poblaciones bacterianas.

Un resumen de los polinucleótidos y péptidos descritos en la presente invención se resumen en la siguiente tabla:

Descripción Secuencia Secuencia polipeptídica nucleotídica... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polipéptido que consiste en el módulo de unión a pared de la lisina epl-7, e-epl-7, modificado para que aumente su carga neta lo que le confiere una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana, y caracterizado porque su secuencia de aminoácidos presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la secuencia parental SEQ ID NO 7, Y porque comprende, al menos, las siguientes alteraciones en su secuencia de aminoácidos:

la posición homóloga a la posición 216 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K) , la posición homóloga a la posición 225 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (K) , la posición homóloga a la posición 230 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R) , la posición homóloga a la posición 233 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N) , la posición homóloga a la posición 239 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N) , la posición homóloga a la posición 264 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K) , la posición homóloga a la posición 273 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (K) , la posición homóloga a la posición 278 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R) , la posición homóloga a la posición 281 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N) , la posición homóloga a la posición 287 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N) , la posición homóloga a la posición 312 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K) , la posición homóloga a la posición 321 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (K) , la posición homóloga a la posición 326 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R) , la posición homóloga a la posición 329 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N) ,

la posición homóloga a la posición 335 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N) .

2. Polipéptido según la reivindicación 1 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 11.

3. Polinucleótido caracterizado por que codifica para el polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.

4. Polinucleótido según la reivindicación 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 12.

5. Vector caracterizado por que comprende, al menos, el polinucleótido según las 10 reivindicaciones 3 y 4.

6. Célula hospedadora caracterizada por que comprende, al menos, el vector según la reivindicación 5.

7. Célula hospedadora según la reivindicación 6 caracterizada por ser Escherichia coli.

8. Método de obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por

que comprende: a) introducir el vector según la reivindicación 5 en una célula hospedadora adecuada b) cultivar la célula hospedadora según las reivindicaciones 5 y 6 en un medio adecuado, y,

c) purificar el polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.

9. Uso del polinucleótido según las reivindicaciones 3 y 4 para la obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.

10. Uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 5 y 6 para la obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.

11. Polipéptido según la reivindicación 1 y 2 caracterizado por que está unido a una etiqueta de marcaje.

12. Uso del polipéptido según la reivindicación 11 en técnicas de marcaje bacteriano.

13. Uso del polipéptido según la reivindicación 12 caracterizado por que está unido a una

partícula de aislamiento útil para la concentración de la población bacteriana de una muestra.

14. Enzima quimérica caracterizada por que, al menos, comprende los siguientes polipéptidos:

a) un módulo catalítico N-terminal procedente de un fago bacteriano, 10 b) un módulo de unión pared C-terminal según las reivindicaciones 1 y 2.

15. Enzima quimérica según la reivindicación 14 caracterizado por que su secuencia se corresponde con alguna de las siguientes SEO ID NO 17, SEO ID NO 19, SEO ID NO 23, SEO ID NO 25.

16. Polinucleótido caracterizado por que codifica una enzima quimérica según las 15 reivindicaciones 14 y 15.

17. Polinucleótido según la reivindicación 16 caracterizado por que su secuencia se corresponde con alguna de las siguientes SEO ID NO 18, SEO ID NO 20, SEO ID NO 24, SEO ID NO 26.

18. Vector caracterizado por que comprende, al menos, el polinucleótido según las 20 reivindicaciones 16 y 17.

19. Célula hospedadora caracterizada por que comprende, al menos, el vector según la reivindicación 18.

20. Célula hospedadora según la reivindicación 19 caracterizada por ser Escherichia coli.

21. Método de obtención de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15 que

comprende: a) introducir el vector según la reivindicación 18 en una célula hospedadora adecuada b) cultivar la célula hospedadora según las reivindicaciones 19 y 20 en un medio adecuado, y, c) purificar la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.

22. Uso del polinucleótido según las reivindicaciones 16 y 17 para la obtención de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.

23. Uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 19 y 20 para la obtención de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.

24. Uso de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15 en la elaboración de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de una infección bacteriana o como antiséptico.

25. Composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades infecciosas o como antiséptico caracterizada por que comprende al menos una enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.

26. Composición farmacéutica según la reivindicación 25 caracterizada por que la secuencia de la enzima quimérica se corresponde con alguna de las siguientes: SEO ID NO 20 17, SEO ID NO 19, SEO ID NO 23, SEO ID NO 25.

27. Composición farmacéutica según la reivindicación 25 caracterizada por que contiene además un adyuvante y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 25 a 27 caracterizada por que contiene además otro principio activo.

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