Ensayo con gen indicador, las células y el kit para realizar dicho ensayo.

Una célula para ser utilizada en ensayos con anticuerpos contra un ligando extracelular seleccionado del grupo compuesto de una citocina y un factor de crecimiento, iniciando dicho ligando extracelular una señal específica de ligando en el núcleo de la célula, comprendiendo dicha célula:

a) un primer constructo de ADN que tiene una secuencia que comprende un primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción, siendo dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción inducible por el ligando, y una porción codificadora de un primer producto génico indicador, activada por dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción, pudiendo ser detectado dicho primer producto génico indicador cuando el primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción es inducida por el ligando, comprendiendo dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción un elemento de control de transcripción seleccionado a partir del grupo compuesto de un elemento de respuesta a la estimulación con IFN

(ISRE), una secuencia activada por gamma (GAS), un sitio de reconocimiento NFkB, un transductor de señal y activador de transcripción

(STAT5); y

b) un segundo constructo de ADN con una secuencia que comprende:

i) un segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción diferente de dicho primer conjunto;

ii) un segmento activado por dicho segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción que codifica un segundo producto génico indicador, y dicho segundo producto génico indicador puede ser medido independientemente en presencia de dicho primer producto génico indicador y viceversa; y

iii) en un cistrón separado, un segmento que codifica dicho ligando, también activado por dicho segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/036044.

Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 3, RUE MICHEL-ANGE 75794 PARIS CEDEX 16 FRANCIA.

Inventor/es: TOVEY, MICHAEL, LALLEMAND,CHRISTOPHE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/02 (en los que intervienen microorganismos vivos)

PDF original: ES-2543381_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

breve de ia invención

[0041] La invención es tal como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona una célula para usar en ensayos de anticuerpos contra un ligando extracelular que inicia una señal específica de ligando en el

núcleo de la célula. La célula según la presente Invención contiene (1) un primer constructo de ADN que tiene una secuencia que Incluye una primera serle de uno o más elementos de control de transcripción, que es Inducible por el ligando, y también codifica una primera etiqueta mensurable (primer producto génlco Indicador), cuya expresión es promovida por la primera serle de uno o más elementos de control de transcripción cuando es Inducida por la presencia del ligando y (2) un segundo constructo de ADN que tiene una secuencia que Incluye una segunda serle de uno o más elementos de control de transcripción diferente de la primera, un segmento de ADN que codifica una segunda etiqueta mensurable (segundo producto génlco Indicador) cuya expresión es promovida por la segunda serle de uno o más elementos de control de transcripción, y en un clstrón separado un segmento que codifica un ligando, cuya expresión es también promovida por la segunda serle de uno o más elementos de control de transcripción.

[0042] La presente Invención también proporciona un kit que contiene una pluralidad de células según la presente Invención, siendo utilizado dicho kit para determinar en una muestra el nivel de un ligando extracelular que ¡niela una señal específica de ligando en el núcleo de la célula o de un anticuerpo neutralizante contra el ligando extracelular o un antagonista del ligando extracelular. Adlclonalmente, la presente Invención proporciona un método para determinar dicho nivel en una muestra.

Descripción breve de ias figuras

[0043] La Figura 1 es un diagrama de flujo esquemático de las fases realizadas en el reciente ensayo basado en células "¡Lite" y en el ensayo de una fase "NanoLIte" según la presente Invención.

[0044] La Figura 2 es una Ilustración esquemática de un modo de realización en el que el ligando (citocina) y el gen Indicador de luclferasa Renllla (RL) son expresados por el mismo promotor. La luciferasa Renilla permanece en la célula mientras que la citocina expresada es secretada, ¡nteractuando con un receptor para el ligando de citocina que ¡niela la transducclón de señal para promover la expresión de luciferasa de luciérnaga (FL) a partir de un promotor de respuesta-ligando citocina. La presencia de anticuerpos neutralizantes (NAb) para la citocina impide que la citocina ¡nteractúe con su receptor de superficie celular y el resultado es una reducción de la actividad de la citocina (determinada por la actividad relativa del Indicador de luciferasa de luciérnaga de respuesta a citocina, FL1/RL (control) > FL2/RL).

[0045] La Figura 3 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen Indicador de luciferasa de luciérnaga y un promotor citomegalovirus (CMV) que promueve la expresión del Interferon a2a (!FNa2a) y el gen indicador de luciferasa de Renilla.

[0046] La Figura 4 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen Indicador de luciferasa de luciérnaga y el promotor de expresión rápida mínima de citomegalovirus (CMV) que promueve la expresión del interferon ct2a (IFNct2a) y el gen indicador de luciferasa de Renllla pero con el orden de expresión de IFNa2a y luciferasa de renilla invertidos con respecto al que aparece en la Fig. 3.

[0047] La Figura 5 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen Indicador de luciferasa de luciérnaga y un elemento de respuesta a tetraciclina (Tet)/el promotor de expresión rápida CMV que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de Renilla y IFNa2a (Tet-On). A falta de tetraciclina o doxiciclina, el represor de Tet inverso (rTetR) se fija al TRE, silenciando la transcripción. También se ¡lustra la fijación del transactivador de tetraciclina inverso (rtTA) al TRE después de la adición de tetraciclina o doxiciclina que conduce a la activación de la transcripción.

[0048] La Figura 6 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen Indicador de luciferasa de luciérnaga y un elemento de respuesta a tetraciclina (Tet)Zpromotor de expresión rápida CMV que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de Renilla y IFN[3 (Tet-On).

[0049] La Figura 7 es una vista esquemática de dos constructos independientes para un ensayo de gen indicador para NAb antl-TNFa, 5 repeticiones en tándem del promotor mínimo SV40/sitio de reconocimiento NFKB canónico que promueve la expresión del gen Indicador de luclferasa de luciérnaga, y un promotor mínimo de expresión rápida CMV/elemento de respuesta Tet (TRE) que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de renilla y TNFct (Tet-On).

[0050] La Figura 8 es una vista esquemática de tres constructos Independientes para un ensayo de gen indicador para Nabs antagonistas de antl-TNFa: 5 repeticiones en tándem del promotor mínimo SV40/sitio de reconocimiento NFKB canónico que promueve la expresión del gen Indicador de luclferasa de renllla; un promotor mínimo de expresión rápida CMV/elemento de respuesta Tet (TRE) que promueve la expresión del gen Indicador CBRLuc y TNFa (Tet-On); y un promotor Inducible de mlfeprlstona quimérico que promueve la transcripción del gen Indicador CBG68Luc y el antagonista de TNFa. El promotor quimérico Inducible de mlfeprlstona consiste en la secuencia TATA y GAL4-UAS del promotor mínimo E1b Adenovirus que es transcrlpclonalmente silencioso a falta de

activación. El dominio de fijación al ADN Gal4 que une la proteína reguladora al promotor GAL4-Elb y el dominio de fijación al ligando receptor de progesterona humana truncado (hPR-LBD) que experimenta un cambio de conformación cuando fija la mifepristona antagonista de progesterona se expresan a partir de un promotor TK mínimo en el vector. Por lo tanto, al añadir mifepristona, el antagonista se fija a la reglón hPR-LBD del vector provocando un cambio de conformación en la proteína reguladora con el resultado de la transcripción del antagonista TNFa y el gen Indicador CBG68Luc.

[0051] La Figura 9 es una vista esquemática de dos constructos independientes para un ensayo de gen Indicador para Nab anti-eritropoietina (EPO), 5 repeticiones en tándem del transductor de señal y activador de transcripción #5 (STAT5)/promotor mínimo SV40 que promueve la expresión del gen indicador de luclferasa de luciérnaga y un elemento de respuesta Tet (TRE)/promotor mínimo de expresión rápida CMV que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de renllla y EPO (Tet-On).

[0052] La Figura 10 muestra una representación esquemática de un constructo de gen Indicador de luclferasa donde la expresión de luciferasa está bajo el control de un promotor quimérico que contiene un elemento de respuesta a la estimulación con IFN (ISRE) del gen ISG15 y un promotor SV40 mínimo.

[0053] La Figura 11 muestra una vista esquemática de un constructo de gen Indicador de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP-1) en el que la expresión de EGFP-1 está bajo el control de un promotor quimérico que contiene un ISRE del gen ISG15 y un promotor SV40 mínimo.

[0054] La Figura 12 es un gráfico que muestra la curva de valoración de anticuerpos neutralizantes antl-IFNa utilizando el método de la presente Invención.

[0055] La Figura 13 es un gráfico de las unidades de luminiscencia relativa (RLU) observadas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula para ser utilizada en ensayos con anticuerpos contra un ligando extracelular seleccionado del grupo compuesto de una cltoclna y un factor de crecimiento, ¡nielando dicho ligando extracelular una señal específica de ligando en el núcleo de la célula, comprendiendo dicha célula:

a) un primer constructo de ADN que tiene una secuencia que comprende un primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción, siendo dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción ¡nduclble por el ligando, y una porción codificadora de un primer producto génlco Indicador, activada por dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción, pudlendo ser detectado dicho primer producto génlco Indicador cuando el primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción es Inducida por el ligando, comprendiendo dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción un elemento de control de transcripción seleccionado a partir del grupo compuesto de un elemento de respuesta a la estimulación con IFN (ISRE), una secuencia activada por gamma (GAS), un sitio de reconocimiento NFkB, un transductor de señal y activador de transcripción # 5 (STAT5); y

b) un segundo constructo de ADN con una secuencia que comprende:

I) un segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción diferente de dicho primer conjunto;

¡I) un segmento activado por dicho segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción que codifica un segundo producto génico Indicador, y dicho segundo producto génlco Indicador puede ser medido Independientemente en presencia de dicho primer producto génlco Indicador y viceversa; y

¡II) en un clstrón separado, un segmento que codifica dicho ligando, también activado por dicho segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción.

2. La célula de la reivindicación 1, donde dicho segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción comprende un elemento de control de transcripción ¡nduclble.

3. La célula de la reivindicación 2, donde dicho elemento de control de transcripción inducible es un elemento de respuesta a tetraclcllna (Tet) y en el que un represor de tetraciclina inverso (rTetR), que se expresa constitutivamente en la célula, desactlva/reprlme la acción de dicho TRE inducible en ausencia de tetraciclina o doxiciclina como un inductor en un sistema de expresión Tet-On; o dicho elemento de control de transcripción es un elemento de respuesta (Tet) a tetraciclina (TRE) y en el que un transactivador controlado por tetraciclina (tTA) se fija a dicho TRE inducible en ausencia de tetraciclina o doxiciclina para activar la transcripción a partir de TRE como un sistema de expresión Tet-Off.

4. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en ensayos con anticuerpos neutralizantes que se unen a un anticuerpo contra un antagonista de dicha citocina o factor de crecimiento, comprendiendo además un tercer constructo de ADN que tiene una secuencia que incluye:

i) un tercer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción diferente del primer y segundo conjunto;

¡i) un segmento activado por dicho tercer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción que codifica un tercer producto génico indicador, pudiendo dicho tercer producto génico indicador ser medido independientemente en presencia de dichos productos génicos indicadores primero y segundo; y (iii) en un cistrón separado, un segmento que codifica dicho antagonista, también activado por dicho tercer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción.

5. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho ligando es un interferón, factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa), o eritropoyetina (EPO).

6. La célula de la reivindicación 5, donde cuando dicho ligando es un interferón dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción comprende un elemento de respuesta a estimulación con IFN (ISRE), o en la que cuando dicho ligando es un factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa) dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción comprende un sitio de unión NFkB, o en la que cuando dicho ligando es eritropoyetina (EPO) dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción comprende un transductor de señal o elemento activador de transcripción # 5 (STAT5)

7. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho primero o segundo producto génico indicador es una luciferasa, preferentemente luciferasa de Renilla o luciferasa de luciérnaga, o en la que dicho primero y segundo productos génicos indicadores son luciferasas diferentes, preferiblemente luciferasa de renilla y luciferasa de luciérnaga.

8. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene la propiedad de mantener la actividad de la transducción de señal específica de ligando al núcleo durante al menos dieciocho horas pero perderá dicha actividad de transducción de señal específica de ligando y sufrirá muerte celular en no más de 14 días a una temperatura por encima del punto de congelación.

9. La célula de la reivindicación 8, donde la célula ha sido tratada con un agente anti-mitótico o pro-apoptótico para que adquiera dicha propiedad.

10. La célula de la reivindicación 9, donde dicho agente anti-mitótico o pro-apoptótico es seleccionado a partir del grupo compuesto de vinblastina, 5-fluorouracilo y mitomicina C.

11. La célula de la reivindicación 9 o 10, donde la célula tratada, sustancialmente inmediatamente después de ser tratada, ha sido suspendida en una solución que contiene un criopreservante y congelada a aproximadamente - 80°C.

12. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es una célula de mamífero o aviar, preferentemente una célula humana.

13. Un kit para determinar el nivel en una muestra de un ligando extracelular que ¡niela una señal específica de ligando en el núcleo de una célula, que comprende:

un reactivo que contiene una pluralidad de la célula de la reivindicación 11 en estado congelado o la célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o 12; y

o bien un dispositivo de prueba con una pluralidad de pocilios o un contenedor, preferentemente en que el kit es para ensayar anticuerpos neutralizantes con respecto a dicho ligando extracelular o un antagonista de dicho ligando extracelular.

14. El kit de la reivindicación 13, donde el nivel del ligando extracelular determinado en la muestra se utiliza para determinar el nivel de anticuerpos neutralizantes o contra el ligando extracelular o contra el antagonista del ligando extracelular.

15. Un método para determinar en una muestra el nivel de un anticuerpo neutralizante o bien contra el ligando extracelular o contra un antagonista del ligando extracelular, o de un ligando extracelular que inicia una señal específica de ligando en el núcleo de una célula que comprende:

Incubar la célula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en una mezcla con una muestra en la que se busca determinar el nivel del ligando extracelular o del anticuerpo neutralizante; y

determinar el nivel del primer producto génico Indicador en la mezcla con respecto al nivel del primer producto génico receptor en ausencia de la muestra para determinar así el nivel en la muestra del ligando extracelular o anticuerpo neutralizante.

16. Un método para determinar en una muestra el nivel de un ligando extracelular que inicia una señal específica de ligando en el núcleo de una célula o de un anticuerpo neutralizante o bien contra el ligando extracelular o contra un antagonista del ligando extracelular que comprende:

descongelar la célula de la reivindicación 11 de su estado congelado en un periodo durante el que la célula descongelada mantiene la actividad de transducción de señal específica de ligando;

Incubar la célula descongelada en una mezcla con una muestra en la que se pretende determinar el nivel del ligando extracelular anticuerpo neutralizante; y determinar el nivel del primer producto génico indicador en ausencia de la muestra para determinar así el nivel en la muestra del ligando extracelular o anticuerpo neutralizante.