Composiciones y métodos para diagnosticar y evaluar miopatías inflamatorias.

Un método para determinar si un sujeto manifiesta un patrón de expresión de genes característico de dermatomiositis o polimiositis,

y no característico de miositis de inclusión corporal (IBM), que comprende:

a) ensayar una muestra biológica de prueba procedente de dicho sujeto que contiene células mononucleares de sangre periférica, para la expresión del dominio del radical S-adenosilo génico /CIG5 (RSAD2);

b) decidir que dicho sujeto tiene un perfil de expresión de genes que es característico de dermatomiositis o polimiositis, y que no es característico de IBM, si los resultados determinados en el ensayo indican que el gen RSAD2 está expresado al menos veces más alto en dicha muestra de prueba que en una o más muestras de control.

Composiciones y métodos para diagnosticar y evaluar miopatías inflamatorias Campo de la invención

La invención se encuentra en el campo de métodos que pueden emplearse para determinar si un sujeto manifiesta un perfil de expresión de genes característico de miopatías inflamatorias.

Antecedentes de la invención

Las miopatías inflamatorias constituyen un grupo de enfermedades que llevan consigo inflamación de músculos o de tejidos asociados y que se caracterizan principalmente por debilidad, atrofia muscular y, con frecuencia, dolor. Los tres subtipos principales de miopatías inflamatorias son la dermatomiositis (DM), la polimiositis (PM), y la miositis de inclusión corporal (IBM). La PM y la DM son similares clínicamente excepto que la DM va asociada con erupciones de la piel mientras que la PM no lo es. Aun cuando la DM ha sido caracterizada como una enfermedad ocasionada por el ataque de anticuerpos de antígenos endoteliales (Dalakas, et al., Lancet, 362(938).971-82 (2003)), no han sido identificados anticuerpos patógenos ni antígenos endoteliales bien caracterizados (Greenberg, et al., Curr. Opin. Neurol. 17(3):359-64 (2004)).

La IBM se ha diagnosticado equivocadamente con frecuencia como PM, pero, a diferencia de PM o DM, no responde típicamente al tratamiento con fármacos inmunosupresores. La diagnosis de IBM; se basa habitualmente en resultados de biopsias que ponen de manifiesto células musculares con cuerpos de inclusión, es decir, con vacuolas que contienen una proteína amiloide. En la actualidad no hay tratamiento eficaz de la IBM pero los pacientes pueden frecuentemente beneficiarse de la administración de prednisona o de una inmunoglobulina intravenosa (IVIG).

La determinación del perfil de expresión de genes de los músculos en DM de adultos comparado con otras miopatías inflamatorias y con controles de salud normales, ha revelado una señal de transcripción génica que está dominada por la regulación por aumento de genes inducibles por interferón-a/j5 (IFN-a/p), Greenberg, et al., Ann. Neurol. 57(5):664-78 (2005). La caracterización adicional de células dendríticas plasmacíticas (PDCs), células que producen IFN-a/p natural, está presentes en los músculos de DM. La proteína inducida por interferón-a/p, MxA, se expresa en miofibras perifasciculares y capilares- Estas observaciones sugieren que el daño en tejidos en DM deriva de una activación autodestructiva del sistema inmunitario innato (Greenberf, et al., Ann. Neurol. 57(5):664-78 (2005)). Una caracterización posterior de tipos de expresión de genes en DM, PM e IBM puede conducir a métodos mejores para distinguir las miopatías inflamatorias una de otra y de otras enfermedades caracterizadas por debilidad muscular progresiva.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en la medida cuantitativa de transcriptos de RNA en la sangre producidos por el gen RSAD2. Un nivel alto de este transcrito tiene un valor que puede predecirse positivo alto para una diagnosis de dermatomiositis o polimiositis, y excluye la diagnosis de la miositis de inclusión corporal (IBM).de miopatías inflamatorias afines. Niveles elevados de transcriptos de este gen no se observan en otras condiciones musculares, tales como distrofia muscular o miastenia grave, que pueden ser importantes para la diferenciación diagnóstica.

En su primer aspecto, la invención se dirige a un método para determinar si un sujeto pone de manifiesto un tipo de expresión génica característico de polimiositis o dermatomiositis, y no característico de miositis de inclusión corporal (IBM) que comprenderá) ensayar una muestra biológica de prueba de células mononucleares de sangre periférica para determinar la expresión del dominio del radical S-adenosilo génico/CIG5 (RSAD2); y (b) llegar a la conclusión de que dicho sujeto posee un perfil de expresión génica que es característico de dermatomiositis o polimiositis, y que no es característico de IBM, si los resultados determinados en el ensayo indican que el gen RSAD2 está expresado en una cantidad al menos 10 veces mayor en dicha muestra de prueba que en una o más muestras de control.

Preferiblemente el método comprende, además, ensayar la muestra de prueba para determinar la expresión de uno o más genes adicionales seleccionados del grupo que consiste en proteína 27 inducible por interferón alfa; proteína 44 similar inducida por interferón; proteína 44 inducida por interferón; proteína hipotética LOC129607; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 1; factor 1 asociado a XIAP; tetratricopéptido 5 inducido por interferón; 2',5'- oligoadenilato sintetasa similar; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 3; tetratricopéptido 1 inducido por interferón; escramblase 1 de fosfolípido; dominio hect y RLD 5; proteína quinasa inducible por interferón; miembro 10 de superfamilia de TNF; proteína 1 de unión a guanilato; proteína 6 inducida porTNF alfa; tetratricopéptido 3 inducido por interferón; dominio 9 similar de motivo alfa estéril; proteína 5 que modifica cromatina; modificador similar a ubiquitina ISG15; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 2; dominio 1 de helicasa C inducido por interferón; resistencia 1 de mixovirus; y gen 1 de interacción estromal epitelial. Los nombres de los genes, las abreviaturas de cada uno y los números de los catálogos de secuencias de las bases de datos de UniGene y GenBank se proporcionan en la Tabla 4.

Para los fines de la presente invención, los ensayos para determinar el nivel de expresión de un gen pueden dirigirse o bien a ácidos nucleicos (p.ej.,. utilizando la amplificación por PCR de mRNA) o bien a productos génicos (p.ej.

utilizando un método ELISA o un radioinmunoensayo). Los resultados obtenidos utilizando la muestra de prueba se comparan con los resultados que proceden de una o más muestras control seleccionadas empleando criterios bien conocidos en la técnica. Las muestras control pueden ser, por ejemplo, muestras de sangre, suero o plasma procedentes de individuos que se sabe que están libres de una miopatía inflamatoria o de otras enfermedades musculares, o pueden tomarse de la población como un todo y, opcionalmente, equilibrarse con la muestra de prueba en lo que respecta a la edad del sujeto, el sexo, etc. Comparando los resultados de los controles y de la muestra de prueba, puede llegarse a la conclusión con respecto a si el sujeto padece una miopatía inflamatoria y, si está presente, el tipo particular de miopatía inflamatoria. Las diferencias que manifiestan la mayoría de los genes y cuanto mayor es la magnitud de las diferencias, mayor es el riesgo de que un sujeto sea positivo para la enfermedad. Preferiblemente los ensayos se llevarán a cabo sobre al menos 5 genes y, más preferiblemente, al menos 15 genes. Un aumento de al menos 10 veces en muestras que proceden de sujetos, comparadas con las de los controles, se observará generalmente en pacientes con una miopatía inflamatoria con aumentos superlores(20 a 50 veces) siendo más característico de DM o PM. Los genes más preferidos indicados en la Tabla 2 son los que manifiestan la máxima diferencia en el nivel de expresión en individuos aquejados de enfermedad con relación a los controles.

En una realización preferida, el método de la invención se lleva a cabo empleando una placa de mlcroarray o una diapositiva que tienen una serie de oligonucleótidos inmovilizados, diferentes, que reconocen las secuencias de los genes Indicadas anteriormente. El término "diferente" indica que los oligonucleótidos tienen secuencias diferentes que les permiten hibridarse con diferentes secuencias complementarias. Se conocen muchos métodos en la técnica para producir placas o diapositivas de esta naturaleza y cualquiera de estos métodos son compatibles con la presente Invención. Las placas o diapositivas deben incluir oligonucleótidos inmovilizados que se hibridan en condiciones restrictivas con al menos uno de los genes anteriormente expuestos, y, preferiblemente, las diapositivas Incluyen varios oligonucleótidos diferentes que se fijan a genes diferentes. La expresión "condiciones restrictivas" Indica condiciones que esencialmente solo permiten que ocurra hibridación con la secuencia complementaria exacta del ollgonucleótido Inmovilizado. En general, estas hibridaciones se llevan a cabo en el seno de tampones de pH aproximadamente neutro que contienen 0,1-0,5 de NaCI y a una temperatura de entre 45 y 70°C. También es posible realizar incubaciones en condiciones restrictivas bajas y después utilizar condiciones de lavado de alta restrictividad para ocasionar la disociación de secuencias hibridadas que no están apareadas. Los procedimientos operatorios para realizar Incubaciones de este tipo en relación con placas de mlcroarray o diapositivas están bien conocidos en la... [Seguir leyendo]

1.- Un método para determinar si un sujeto manifiesta un patrón de expresión de genes característico de dermatomiositis o polimiositis, y no característico de miositis de inclusión corporal (IBM), que comprende:

a) ensayar una muestra biológica de prueba procedente de dicho sujeto que contiene células mononucleares de sangre periférica, para la expresión del dominio del radical S-adenosilo génico /CIG5 (RSAD2);

b) decidir que dicho sujeto tiene un perfil de expresión de genes que es característico de dermatomiositis o polimiositis, y que no es característico de IBM, si los resultados determinados en el ensayo indican que el gen RSAD2 está expresado al menos 10 veces más alto en dicha muestra de prueba que en una o más muestras de control.

2.- El método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra biológica es una muestra de sangre, plasma o suero.

3.- El método según cualquier reivindicación precedente, en donde dicho ensayo se lleva a cabo empleando una placa de microarray

4.- El método según cualquier reivindicación precedente, que comprende además ensayar la muestra de prueba para la expresión de uno o más genes adicionales seleccionados del grupo que consiste en: proteína 27 inducible por interferón alfa, proteína 44 similar inducida por interferón, proteína 44 inducida por ¡nterferón; proteína hipotética LOC129607; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 1; factor 1 asociado a XIAP; tetratricopéptido 5 inducido por interferón; 2',5'-oligoadenilato sintetasa similar; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 3; tetratricopéptido 1 inducido por interferón; escramblase 1 de fosfolípido; dominio hect y RLD 5; proteína quinasa inducible por interferón; miembro 10 de superfamilia deTNF; proteína 1 de unión a guanilato; proteína 6 inducida por alfa de TNF; tetratricopéptido 3 inducido por interferón; dominio 9 similar de motivo de alfa estéril; proteína 5 que modifica cromatina; modificador similar de ubiquitina ISG15; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 2; dominio 1 de helicasa C inducido por interferón; resistencia 1 de mixovirus; y gen 1 de interacción estromal epitelial.

5.- El método según la reivindicación 4, en donde se ensayan al menos 5 genes.

6.- El método según la reivindicación 5, en donde se ensayan al menos 15 genes.

7 - El método según cualquier reivindicación precedente, en donde el ensayo se lleva a cabo empleando una placa de microarray que comprende una serie de oligonucleótidos diferentes inmovilizados, en donde:

a) dichos oligonucleótidos se hibridan en condiciones restrictivas específicamente con una secuencia génica del gen definido en la reivindicación 1;

b) dichos oligonucleótidos están inmovilizadosn en una posición de dicha placa de microarray que no contiene oligonucleótidos que se hibridan con otras secuencia en condiciones restrictivas; y

c) dicha placa de microarray comprende no más de 100 oligonucleótidos diferentes inmovilizados en total.

8.- El método según la reivindicación 7, en donde dicha placa de microarray comprende adicionalmente oligonucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas específicamente con secuencias génicas de uno o más de proteína 27 inducible por interferón alfa; proteína 44 similar inducida por interferón; proteína 44 inducida por interferón; ;proteína hipotética LOC129607; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 1; factor 1 asociado a XIAP; tetratricopéptido 5 inducido por interferón; 2',5'-oligoadenilato sintetasa similar; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 3; tetratricopéptido 1 inducido por interferón; escramblase 1 de fosfolípido; dominio hect y RLD 5; proteína quinasa inducible por interferón; miembro 10 de superfamilia de TNF; proteína 1 de unión a guanilato; proteína 6 inducida por alfa de TNF; tetratricopéptido 3 inducido por interferón; dominio 9 similar de motivo de alfa estéril; proteína 5 que modifica cromatina; modificador similar de ubiquitina ISG15; 2',5'-oligoadenilato sintetasa 2; dominio 1 de helicasa C inducido por interferón; resistencia 1 de mixovirus; y gen 1 de interacción estromal epitelial.

9.- El método según la reivindicación 8, en donde dicha placa de microarray comprende al menos 10 de los oligonucleótidos diferentes inmovilizados, preferiblemente al menos 15 de los oligonucleótidos diferentes inmovilizados, y que comprende preferiblemente oligonucleótidos diferentes inmovilizados que se hibridan en condiciones restrictivas específicamente con todos dichos genes.

10.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde dicha placa de microarray comprende no más que 50 oligonucleótidos diferentes inmovilizados en total.

11,. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde dicha placa de microarray no comprende oligonucleótidos diferentes inmovilizados que se hibridan en condiciones restrictivas con un gen distinto de uno de dichos genes..

12.- El método según cualquier reivindicación precedente, en donde si el resultado determinado en la etapa de ensayo Indica que el gen RSAD2 se expresa al menos 20 veces más alto en dicha muestra de prueba que en una o más de las muestras de control, entonces puede decidirse que dicho sujeto tiene un perfil de expresión génica que es característico de dermatomlosltls o polimiositis y que no es característico de IBM.