Composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno estable a temperatura elevada.

Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno altamente purificada y estable a temperatura elevada,

incluyendo la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, y comprendiendo el método las etapas siguientes:

a) proporcionar sangre completa de mamífero que incluye al menos eritrocitos y plasma;

b) separar los eritrocitos del plasma en la sangre completa de mamífero;

c) filtrar los eritrocitos que se separaron del plasma para obtener una fracción de eritrocitos filtrados;

d) lavar la fracción de eritrocitos filtrados para eliminar las impurezas proteínicas plasmáticas, dando como resultado eritrocitos lavados;

e) disgregar los eritrocitos lavados mediante una lisis hipotónica controlada durante un tiempo suficiente para lisar los eritrocitos sin lisar los leucocitos en un aparato de citólisis instantánea a un caudal de 50-1000 litro/h para crear una disolución que comprende un lisado de eritrocitos disgregados;

f) llevar a cabo una filtración para eliminar al menos una porción del retenido de desecho del lisado;

g) extraer una primera disolución de hemoglobina del lisado;

h) llevar a cabo un primer procedimiento de ultrafiltración utilizando un filtro de ultrafiltración configurado para eliminar las impurezas que presentan un peso molecular mayor que la hemoglobina tetramérica para eliminar además cualquier virus y retenido de desecho residual de la primera disolución de hemoglobina para obtener una segunda disolución de hemoglobina;

i) llevar a cabo una cromatografía en columna de flujo continuo sobre la segunda disolución de hemoglobina para eliminar los fosfolípidos, las impurezas proteínicas y la hemoglobina dimérica y para formar una disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros;

j) llevar a cabo un segundo procedimiento de ultrafiltración sobre la disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros utilizando un filtro configurado para eliminar las impurezas, dando como resultado una disolución de hemoglobina purificada concentrada exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros;

k) bloquear los grupos sulfhidrilo de las moléculas de hemoglobina en la disolución de hemoglobina purificada concentrada exenta de fosfolípidos baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros mediante un reactivo de sulfhidrilo en un entorno completamente oxigenado de manera que las moléculas de hemoglobina presenten cada una al menos un resto de cisteína que incluye un grupo protector de tiol de manera que las moléculas de hemoglobina no puedan unirse al factor relajante derivado del endotelio en el sitio de cisteína;

l) reticular la hemoglobina tiol protegida mediante fumarato de bis-3,5-dibromosalicilo (DBSF) con una relación molar de la hemoglobina tiol protegida a DBSF mayor que 1:2,5 a menor que 1:5,0 en un entorno desoxigenado para formar hemoglobina tetramérica reticulada estable a temperatura elevada sin la formación de hemoglobina polimérica, de manera que el peso molecular de la hemoglobina tetramérica reticulada resultante es 60-70 kDa y consiste esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica;

m) intercambiar un tampón fisiológico adecuado por la hemoglobina tetramérica reticulada;

n) eliminar cualquier hemoglobina tetramérica no reticulada residual y cualesquiera sustancias químicas residuales mediante lavado;

o) añadir N-acetilcisteína a una concentración de 0,2-0,4% a la hemoglobina tetramérica reticulada para mantener un nivel de metahemoglobina inferior a 5%; y

p) añadir la hemoglobina tetramérica reticulada baja en dímeros, exenta de fosfolípidos, tiol protegida, estable a temperatura elevada hasta una temperatura de 80ºC, libre de hemoglobina polimérica, a un vehículo farmacéuticamente aceptable

Composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno estable a temperatura elevada.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno estable a temperatura elevada, y a la composición preparada mediante el procedimiento. La presente invención también se refiere a la utilización de la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno estable a temperatura eleva para el tratamiento de cáncer, trastorno por privación de oxígeno, y conservación de órganos para seres humanos y otros animales.

Antecedentes de la invención

La hemoglobina desempeña un papel importante en la mayoría de los vertebrados para el intercambio gaseoso entre el sistema vascular y los tejidos. Es responsable de transportar oxígeno desde el sistema respiratorio a las células corporales vía la circulación sanguínea, y también de transportar el producto de desecho metabólico dióxido de carbono fuera de las células corporales al sistema respiratorio, en el que se exhala el dióxido de carbono. Puesto que la hemoglobina presenta este rasgo de transporte de oxígeno, puede usarse como un potente proveedor de oxígeno si puede estabilizarse ex vivo y usarse in vivo.

La hemoglobina de origen natural es un tetrámero que es generalmente estable cuando está presente en los eritrocitos. Sin embargo, cuando la hemoglobina de origen natural se elimina de los eritrocitos, deviene inestable en el plasma y se escinde en dos dímeros a-(3. Cada uno de estos dímeros tiene un peso molecular de aproximadamente 32 kDa. Estos dímeros pueden causar una lesión renal sustancial cuando se filtran a través de los riñones y se excretan. La ruptura del enlace del tetrámero también influye negativamente sobre la sostenibilidad de la hemoglobina funcional en circulación.

A fin de evitar la ruptura del tetrámero, los desarrollos recientes en el procesamiento de la hemoglobina han incorporado diversas técnicas de reticulación para crear enlaces intramoleculares en el tetrámero, así como enlaces intermoleculares entre los tetrámeros para formar hemoglobina polimérica. La técnica anterior enseña que la hemoglobina polimérica es la forma preferida para aumentar la semivida circulatoria de la hemoglobina. Sin embargo, como se determina en el contexto de la presente invención, la hemoglobina polimérica se convierte más fácilmente en metahemoglobina en la circulación sanguínea. La metahemoglobina no se puede unir a oxígeno y por lo tanto no puede oxigenar tejidos. Por lo tanto, la reticulación enseñada por la técnica anterior que causa la formación de hemoglobina polimérica es un problema. Existe la necesidad en la técnica de una técnica que permita una reticulación intramolecular para crear tetrámeros estables sin la formación simultánea de hemoglobina polimérica.

Unos problemas adicionales en los intentos de la técnica anterior de estabilizar la hemoglobina incluyen la producción de hemoglobina tetramérica que incluye un porcentaje inaceptablemente elevado de unidades diméricas; la presencia de dímeros hace a la composición de hemoglobina insatisfactoria para administración a mamíferos. La forma dimérica de la hemoglobina puede causar lesión renal grave en un cuerpo de mamífero; esta lesión renal puede ser suficientemente grave para causar la muerte. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de crear hemoglobina tetramérica estable con una forma dimérica indeseable baja en el producto final.

Unos problemas adicionales en los intentos de la técnica anterior de crear hemoglobina estable incluyen la presencia de impurezas proteínicas, tales como inmunoglobulina G, que pueden causar efectos alérgicos en mamíferos. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un procedimiento que pueda producir hemoglobina tetramérica estable sin impurezas proteínicas.

Otros problemas con preparaciones de hemoglobina de la técnica anterior incluyen vasoconstricción tras transfusión en mamíferos. Se ha indicado que esta vasoconstricción es debida a la unión del factor relajante derivado del endotelio a grupos sulfhidrilo reactivos de una molécula de hemoglobina. De este modo, existe la necesidad en la técnica de crear una hemoglobina tetramérica estabilizada que no provoque vasoconstricción tras la transfusión.

Además de los problemas anteriores, existe la necesidad en la técnica de una hemoglobina tetramérica estabilizada que esté exenta de fosfolípidos y pueda producirse a escala industrial.

Sumario de la invención

El alcance de la presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona un método para producir hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, purificada, estable a temperatura elevada, adecuada para la utilización en mamíferos, sin causar lesión renal grave, efectos vasculares perjudiciales, u otros efectos adversos graves (incluyendo la muerte). La presente invención también incluye la hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, purificada, estable a temperatura elevada, que se puede usar para

la oxigenación de tejido in vivo o ex vivo.

El método incluye un material de partida de sangre completa de mamífero que incluye al menos eritrocitos y plasma. Los eritrocitos se separan del plasma en la sangre completa de mamífero, seguido de filtración para obtener una fracción de eritrocitos filtrados. La fracción de eritrocitos filtrados se lava para eliminar las impurezas proteínicas plasmáticas. Los eritrocitos lavados se disgregan mediante una lisis hipotónica controlada, durante un tiempo suficiente para Usar los eritrocitos sin lisar los leucocitos, en un aparato de citólisis instantánea a un caudal de 5- 1 litros/h. La filtración se lleva a cabo para eliminar al menos una parte del retenido (reténtate) de desecho del Usado. Se extrae una primera disolución de hemoglobina a partir del lisado.

Se lleva a cabo un primer procedimiento de ultrafiltración usando un filtro de ultrafiltración configurado para eliminar Impurezas que tienen un peso molecular mayor que la hemoglobina tetramérica y para eliminar adicionalmente cualquier virus y retenido de desecho residual de la primera disolución de hemoglobina, para obtener una segunda disolución de hemoglobina. Se lleva a cabo una cromatografía de columna de flujo continuo sobre la segunda disolución de hemoglobina para eliminar las impurezas proteínicas, hemoglobina dimérica y fosfolípidos, para formar una disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos y baja en dímeros. Se lleva a cabo un segundo procedimiento de ultrafiltración sobre la disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos y baja en dímeros usando un filtro configurado para eliminar impurezas, dando como resultado una disolución de hemoglobina purificada concentrada exenta de fosfolípidos y baja en dímeros.

Los grupos sulfhldrllo de moléculas de hemoglobina están bloqueados en la disolución de hemoglobina concentrada, purificada, exenta de fosfolípidos y baja en dímeros, mediante un reactivo de sulfhidrilo en un entorno totalmente oxigenado. Las moléculas de hemoglobina resultantes tienen cada una al menos un resto cisteínico que incluye un grupo protector de tlol de manera que las moléculas de hemoglobina son incapaces de unirse al factor relajante derivado del endotello en el sitio de cisteína.

Al menos las subunldades a-a y/o P-|3 de la hemoglobina tiol protegida se reticulan mediante fumarato de bis-3,5- dlbromosallcllo (DBSF), con una relación molar de la hemoglobina tiol protegida a DBSF mayor que 1:2,5 a menor que 1:5,, en un entorno desoxigenado para formar hemoglobina tetramérica reticulada estable a temperatura elevada sin la formación de hemoglobina polimérica, de manera que el peso molecular de la hemoglobina tetramérica reticulada resultante es 6-7 kDa. Un tampón fisiológico adecuado se intercambia con la hemoglobina tetramérica reticulada. Cualquier hemoglobina tetramérica no reticulada residual y cualesquiera sustancias químicas residuales se eliminan usando ultrafiltración mediante flujo tangencial. Se añade N-acetilcisteína a una concentración de ,2-,4% a la hemoglobina tetramérica reticulada para mantener un nivel de metahemoglobina por debajo de 5%. La hemoglobina tetramérica reticulada estable a temperatura elevada, tiol protegida, exenta de fosfolípidos, baja en dímeros, se añade entonces a un vehículo farmacéuticamente aceptable; el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un tampón fisiológico o agua.

Después de este procedimiento, la hemoglobina resultante se envasa opcionalmente en envases de infusión herméticos al aire de polletileno, etileno-acetato... [Seguir leyendo]

1. Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno altamente purificada y estable a temperatura elevada, incluyendo la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, y comprendiendo el método las etapas siguientes:

a) proporcionar sangre completa de mamífero que incluye al menos eritrocitos y plasma;

b) separar los eritrocitos del plasma en la sangre completa de mamífero;

c) filtrar los eritrocitos que se separaron del plasma para obtener una fracción de eritrocitos filtrados;

d) lavar la fracción de eritrocitos filtrados para eliminar las Impurezas proteínlcas plasmáticas, dando como resultado eritrocitos lavados;

e) disgregar los eritrocitos lavados mediante una lisis hipotónica controlada durante un tiempo suficiente para lisar los eritrocitos sin lisar los leucocitos en un aparato de citólisis instantánea a un caudal de 5-1 litro/h para crear una disolución que comprende un Usado de eritrocitos disgregados;

f) llevar a cabo una filtración para eliminar al menos una porción del retenido de desecho del lisado;

g) extraer una primera disolución de hemoglobina del Usado;

h) llevar a cabo un primer procedimiento de ultrafiltración utilizando un filtro de ultrafiltración configurado para eliminar las Impurezas que presentan un peso molecular mayor que la hemoglobina tetramérica para eliminar además cualquier virus y retenido de desecho residual de la primera disolución de hemoglobina para obtener una segunda disolución de hemoglobina;

i) llevar a cabo una cromatografía en columna de flujo continuo sobre la segunda disolución de hemoglobina para eliminar los fosfolípidos, las impurezas proteínicas y la hemoglobina dimérica y para formar una disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros;

j) llevar a cabo un segundo procedimiento de ultrafiltración sobre la disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros utilizando un filtro configurado para eliminar las impurezas, dando como resultado una disolución de hemoglobina purificada concentrada exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros;

k) bloquear los grupos sulfhidrilo de las moléculas de hemoglobina en la disolución de hemoglobina purificada concentrada exenta de fosfolípidos baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros mediante un reactivo de sulfhidrilo en un entorno completamente oxigenado de manera que las moléculas de hemoglobina presenten cada una al menos un resto de clsteína que Incluye un grupo protector de tiol de manera que las moléculas de hemoglobina no puedan unirse al factor relajante derivado del endotelio en el sitio de cisteína;

l) reticular la hemoglobina tiol protegida mediante fumarato de bis-3,5-dibromosalicilo (DBSF) con una relación molar de la hemoglobina tiol protegida a DBSF mayor que 1:2,5 a menor que 1:5, en un entorno desoxigenado para formar hemoglobina tetramérica reticulada estable a temperatura elevada sin la formación de hemoglobina polimérica, de manera que el peso molecular de la hemoglobina tetramérica reticulada resultante es 6-7 kDa y consiste esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica;

m) intercambiar un tampón fisiológico adecuado por la hemoglobina tetramérica reticulada;

n) eliminar cualquier hemoglobina tetramérica no reticulada residual y cualesquiera sustancias químicas residuales mediante lavado;

o) añadir N-acetilcisteína a una concentración de ,2-,4% a la hemoglobina tetramérica reticulada para mantener un nivel de metahemogloblna Inferior a 5%; y

p) añadir la hemoglobina tetramérica reticulada baja en dímeros, exenta de fosfolípidos, tiol protegida, estable a temperatura elevada hasta una temperatura de 8°C, libre de hemoglobina polimérica, a un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Método para la preparación de la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 1, en el que la relación molar de hemoglobina tiol protegida a DBSF es superior a 1:2,5 a inferior o igual a 1:4,. 3

3. Método para la preparación de la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la

reivindicación 1 o 2, en el que el aparato de citólisis instantánea incluye un mezclador estático.

4. Método para la preparación de la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha hemoglobina tetramérica reticulada procede de hemoglobina bovina, porcina, canina o equina.

5. Método para la preparación de la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 1 o 2, en el que la cromatografía en columna comprende una o más columnas de intercambio catiónico y columnas de intercambio aniónico.

6. Método para la preparación de la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 5, en el que las columnas de intercambio iónico son una o más columnas de DEAE, columnas de CM, y/o columnas de hidroxiapatita.

7. Método para la preparación de la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 1 o 2, en el que la reticulación de la hemoglobina mediante fumarato de bis-3,5-dibromosalicilo incluye al menos una reticulación a-a y/o (3-(3.

8. Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 7, en el que las condiciones de reticulación se seleccionan de manera que la reticulación (3-|3 es superior a 5% de la reticulación total.

9. Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 7, en el que las condiciones de reticulación se seleccionan de manera que la reticulación (3-|3 es superior a 6% de la reticulación total.

1. Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 7, en el que las condiciones de reticulación se seleccionan de manera que la reticulación (3-|3 es superior a 7% de la reticulación total.

11. Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 1 o 2, en el que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un tampón fisiológico o agua.

12. Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno según la reivindicación 1 o 2, que comprende además envasar la composición preparada en un envase de infusión flexible, de múltiples capas, que presenta una permeabilidad al oxígeno inferior a ,25 cm3 por 24 horas en condiciones ambientales.

13. Composición farmacéutica muy purificada y estable a temperatura elevada que contiene un vehículo de oxígeno, que comprende hemoglobina, consistiendo la hemoglobina esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica formada mediante el procedimiento según la reivindicación 1 o 2.

14. Composición según la reivindicación 13 para la utilización en un método para oxigenar tejido, comprendiendo dicho método proporcionar dicha composición al tejido in vivo.

15. Método para oxigenar tejido que comprende proporcionar la composición según la reivindicación 13 al tejido ex

vivo.