BACTERIAS GRAM NEGATIVAS ATENUADAS.

SOLICITUDES RELACIONADAS/INCORPORACIÓN POR REFERENCIA [0001] Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de Serie No. No. 60/370,282, solicitada el 5 de abril de 2002. CAMPO DE LA INVENCIÓN [0002] La presente invención se refiere a bacterias gram negativas atenuadas vivas. Las bacterias gram negativas atenuadas se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna, por ejemplo, para la prevención de infecciones bacterianas, así como en investigación, como cepas atenuadas presentan un mayor grado de seguridad para los investigadores y para aquellos (por ejemplo, animales, humanos) con los que pueden entrar en contacto. [0003] La presente invención por consiguiente se refiere a composiciones inmunogénicas o de vacuna que comprenden bacterias gram negativas de la invención; por ejemplo, bacterias gram negativas atenuadas vivas. Las bacterias también se podrían estar inactivadas en las composiciones; pero puede ser ventajoso que las bacterias sean bacterias gram negativas atenuadas vivas. Por lo tanto, la descripción se refiere además a métodos para preparar y/o formular dichas composiciones; por ejemplo, cultivar o desarrollar o propagar las bacterias en un medio adecuado, recoger las bacterias, inactivando opcionalmente las bacterias, y mezclar con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable adecuado y/o un adyuvante y/o estabilizante; o, mezclar las bacterias don un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable adecuado y/o un adyuvante y/o estabilizante. De este modo, la descripción también se refiere a la utilización de las bacterias en la formulación de dichas composiciones. [0004] Las bacterias atenuadas también pueden actuar como un vector de expresión o replicación, por ejemplo, para replicar y/o expresar una molécula de ácido nucleico heteróloga a las bacterias atenuadas, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno, antígeno o epítopo de un agente patogénico, tal como un agente patogénico que es diferente de la bacteria atenuada. La utilización de bacterias atenuadas como vector también proporciona un mayor grado de seguridad a los investigadores o técnicos que trabajan con los vectores atenuadas y aquellos (por ejemplo, animales, humanos) con los que pueden entrar en contacto. [0005] Por lo tanto, la descripción se refiere además a métodos para preparar dichos vectores, por ejemplo, transformando las bacterias de manera que la bacteria contenga y opcionalmente comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga. [0006] La descripción también se refiere a las utilizaciones de dichos vectores; por ejemplo, un método para producir un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, tal como un inmunógeno, epítopo o antígeno, heterólogo a las bacterias que comprende cultivar, desarrollar o propagar bacterias transformadas para contener expresar una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica el producto génico bajo condiciones adecuadas para la expresión, y opcionalmente recoger o aislar o separar el producto génico; o, recoger o aislar o separar el producto génico de las bacterias transformadas para expresarlo; o, un método para obtener una respuesta inmunológica o una respuesta inmunogénica contra un producto génico y/o las bacterias o una respuesta inmune protectora con respecto a un patógeno del que deriva o se obtiene el producto génico y/o las bacterias que comprenden administrar a un sujeto, por ejemplo, un animal, tal como un animal susceptible de infección por el patógeno y/o las bacterias, por ejemplo, un animal bovino o un pavo, bacterias transformadas para expresar el producto génico; o un método para preparar una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que comprende mezclar el vector o las bacterias transformadas con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante y/o estabilizante [0007] La descripción también se refiere a dianas para la atenuación de bacterias por ejemplo, secuencias de nucleótidos o genes mutados que codifican las dianas para la atenuación de bacterias, y métodos para dirigir polipéptidos para la atenuación de bacterias y métodos para generar bacterias atenuadas. Las dianas para la atenuación se pueden utilizar como compuestos inmunogénicos, por ejemplo, en composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna, o para generar epítopos para utilizar en composiciones inmunogénicas o de vacuna. De este modo, la descripción se refiere a la utilización de dianas para la atenuación en la preparación en composiciones, por ejemplo, mezclando con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante y/o estabilizante. 2   [0008] La descripción se refiere además a métodos para inducir una respuesta inmunológica o inmunogénica o inmune protectora en un sujeto, por ejemplo, un animal, tal como un animal susceptible de infección por una bacteria gram negativa, tal como una Pasteurella, por ejemplo, un pavo o un animal bovino, que comprende administrar al animal una vacuna o composición inmunogénica de la invención. [0009] Incluso además la descripción se refiere a preparar dichas bacterias atenuadas, por ejemplo, bacterias gram negativas, tales como Pasteurella; por ejemplo, que comprende introducir uno o más elementos transposables en la bacteria y aislar la bacteria que contiene el elemento transposable que no causa mortalidad en una especie diana (y, por tanto, atenuada). Se pueden identificar opcionalmente las mutaciones en las bacterias, permitiendo así medios alternativos para producir las bacterias atenuadas. [0010] La descripción se refiere además a dichos medios alternativos para producir bacterias atenuadas. Dado que las mutaciones se identifican o caracterizan, las mutaciones se pueden introducir en bacterias a través de técnicas diferentes a introducir uno o más elementos transposables en la bacteria, tal como mediante recombinación homóloga, por ejemplo, recombinación homóloga mediante la cual una parte del genoma bacteriano da lugar a por lo menos una adición a la misma (inserción) o una deleción de la misma (también se prevén dos o más adiciones y/o deleciones) o una sustitución (tal como una sustitución de por lo menos un nucleótido por otro). Por consiguiente, la descripción se refiere a un método para producir una bacteria atenuada que contiene una modificación o mutación conocida o identificada previamente, por ejemplo, una modificación o mutación identificada en la presente invención, que comprende introducir una deleción o inserción o sustitución en el genoma bacteriano, de manera ventajosa, a través de la recombinación y opcionalmente la identificación y/o aislamiento de las bacterias que contienen la modificación o mutación. [0011] De este modo, la descripción se refiere además a un mutante de una bacteria gram negativa, donde dicha bacteria tiene por lo menos una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos identificadas como SEC ID No: 2, 6,9,12,16,19,22,25,28, 31,34,37,40,43,46,49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93; dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria. La descripción se refiere a utilizaciones, composiciones y métodos que implican dicha bacteria tal como se ha descrito en la invención. ANTECEDENTES [0012] Está bien establecido que los microorganismos vivos atenuados pueden ser vacunas muy eficaces; las respuestas inmunes obtenidas por dichas vacunas son a menudo de mayor magnitud y de duración más larga que las producidas por inmunógenos no replicantes. Una explicación de esto puede ser que las cepas vivas atenuadas establecen infecciones limitadas en el huésped e imitan las etapas tempranas de la infección natural. Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones muertas o inactivadas, las vacunas vivas son capaces de inducir potentes respuestas mediadas por células que se pueden relacionar con su capacidad para replicarse en células presentadoras antígenos, tales como los macrófagos. [0013] Existe una larga historia del uso de vacunas atenuadas vivas en animales y seres humanos, usando especialmente técnicas de mutagénesis química. Sin embargo, las vacunas empíricamente atenuadas pueden revertir a virulentas. [0014] Las técnicas modernas de la biología molecular, junto con el aumento del conocimiento de la patogénesis bacteriana, han conducido a la identificación de varios genes que están... [Seguir leyendo]

1. Mutante de una bacteria gram negativa, en el que dicha bacteria presenta una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75, dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria, en el que la mutación es una inserción entre los nucleótidos 1072-1087 en la SEC ID No: 75. 2. Mutante según la reivindicación 1, en el que dicho mutante tiene un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75. 3. Mutante según la reivindicación 1 ó 2, en el que la bacteria es una Pasteurellaceae. 4. Mutante según la reivindicación 3, en el que la bacteria se selecciona del grupo de: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae. 5. Mutante según la reivindicación 4, en el que la bacteria es Pasteurella multocida. 6. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica un inmunógeno de un agente patogénico viral, parasítico o bacteriano, para una proteína terapéutica, para un alérgeno, para un factor de crecimiento o para una citoquina. 7. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que presenta una mutación en la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75. 8. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un mutante 9C8 disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3001. 9. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho mutante tiene dos o más mutaciones. 10. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene dos o más de las siguientes secuencias mutadas: SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. 11. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene dos o más de las siguientes secuencias mutadas: SEC ID No: 37, 40, 75, 90, 93. 12. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene dos o más de las siguientes secuencias mutadas: SEC ID No: 37 y 75; SEC ID No: 40 y 75; SEC ID No: 75 y 90; o SEC ID No: 75 y 93. 13. Vacuna que comprende un mutante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 14. Vacuna según la reivindicación 13, que comprende además un adyuvante. 15. Composición inmunogénica que comprende un mutante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 16. Composición inmunogénica según la reivindicación 15, que comprende además un adyuvante. 17. Molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia SEC ID No: 75 con una inserción entre los nucleótidos 1072-1087. 18. Utilización de un mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la producción de una composición inmunogénica atenuada viva o la preparación de una composición de vacuna atenuada viva. 19. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, vacuna según la reivindicaciones 13 ó 14, o una composición inmunogénica según la reivindicación 15 ó 16, para utilizar en la inmunización contra o la prevención de una infección bacteriana en un animal. 20. Utilización de un mutante de una bacteria gram negativa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, una 169   vacuna según la reivindicación 13 ó 14, o una composición inmunogénica según la reivindicación 15 ó 16, en la preparación de un medicamento para la inmunización contra o la prevención de una infección bacteriana en un animal.