Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

AGENTE INDUCTOR DE DIFERENCIACIÓN O REGENERACIÓN PARA LOS ALVEÓLOS.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen: Uso del factor de crecimiento de los hepatocitos para la preparación de un medicamento para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células 5 alveolares.

Solicitante: KRINGLE PHARMA INC.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: JAPON.

Inventor/es: NAKAMURA, TOSHIKAZU, KUBO, HIROSHI, ISHIZAWA,KOTA C/O TOHOKU TECHNOARCH CO.,LTD, SASAKI,HIDETADA.

Fecha de Publicación de la Concesión: 3 de Enero de 2011.

Fecha Solicitud PCT: 7 de Marzo de 2005.

Fecha Concesión Europea: 25 de Agosto de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: A61K38/18D.

Clasificación PCT: A61K38/17 (..que provienen de animales; que provienen de humanos [6]), A61K38/20 (....Interleuquinas [6]).

Clasificación antigua: A61K38/17 (..que provienen de animales; que provienen de humanos [6]), A61K38/20 (....Interleuquinas [6]).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania.

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Descripción:

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso del factor de crecimiento de los hepatocitos como ingrediente activo para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares, y también describe un agente para formar los alvéolos por medio de tal inducción de la diferenciación.

10 Antecedentes de la técnica

El factor de crecimiento de los hepatocitos (en adelante denominado HGF en el presente documento) fue identificado originalmente como un factor de crecimiento para los hepatocitos maduros, y su gen (ADNc) fue clonado en 1989 (véase la literatura no de

15 patente 1 y 2).

Hasta el momento se ha revelado que el HGF ejerce diversas actividades biológicas tales como la proliferación celular, la promoción de la migración celular, la inducción de la morfogénesis, la inhibición de la muerte celular y similares en diferentes células así como

20 en los hepatocitos (véase la literatura no de patente 3 a 6).

Las actividades biológicas del HGF se expresan a través de su receptor, es decir c-Met tirosina cinasa. El HGF tiene diversas actividades biológicas y tiene funciones de reparación y de protección en diversos tejidos de diferentes lesiones.

La actividad promotora de la angiogénesis es una de funciones del HGF de regeneración

o de protección de tejidos. El HGF no sólo promueve la proliferación y la migración de las células del endotelio vascular, sino que también muestra potente actividad inductora de la angiogénesis in vivo (véase la literatura no de patente 7 a 10).

30 Además, el HGF tiene una actividad de inhibición de la muerte celular en las células del endotelio vascular (véase la literatura no de patente 11 a 13).

El pulmón es un órgano compuesto por una gran cantidad de alvéolos. El aire ingresado 35 en el cuerpo por la respiración pasa a través de la tráquea y a continuación entra en los

bronquios. Los bronquios están además ramificados y cada bronquíolo se conecta a un alvéolo. El alvéolo humano es un pequeño saco que tiene un diámetro de aproximadamente 0,2 mm y está rodeado por capilares. El intercambio de gases tiene lugar en los alvéolos, es decir, se toma el oxígeno del gas inspirado que ingresa a través 5 de los bronquios en los alvéolos, y el dióxido de carbono de la sangre se expele en los alvéolos como gas espirado. El enfisema pulmonar es, fisiológicamente, una destrucción progresiva de los alvéolos, por consiguiente el área de superficie alveolar disponible para el intercambio de gases se reduce a medida que progresa la enfermedad. El intercambio inadecuado de gases en los alvéolos provoca una escasez de oxígeno en la sangre. Con 10 el progreso de la enfermedad, la elasticidad del pulmón disminuye, dando como resultado dificultad e insuficiencia respiratoria. Además, puesto que el pulmón del adulto es un órgano que no puede crecer ni regenerarse espontáneamente, se considera que el enfisema pulmonar es una enfermedad progresiva e irreversible. Massaro y col. informaron que el tratamiento con ácido todo-trans retinoico (ATRA) regeneró anatómica 15 y fisiológicamente el pulmón en un modelo animal de enfisema pulmonar (véase la literatura no de patente 14). Además, se sabe que el ATRA activa los genes implicados en el desarrollo del pulmón y promueve la formación de septos alveolares y el crecimiento del pulmón. Sin embargo, los ensayos clínicos que utilizaron ATRA no mostraron mejoras significativas en la estructura del pulmón ni en la función del pulmón en pacientes con enfisema pulmonar (véase la literatura no de patente 15).

Se ha informado que el HGF promueve el crecimiento de las células epiteliales alveolares de tipo II o de las células epiteliales bronquiales, y que el HGF está implicado en la reparación de las células epiteliales alveolares (véase las bibliografías no de patente 1619). También, un estudio sobre el efecto del HGF en lesión aguda de pulmón reveló que el HGF se produce nuevamente en el pulmón después de la lesión y que, cuando se administra HGF a animales con un pulmón lesionado, se estimula la proliferación celular en el tejido pulmonar y se promueve la reparación del pulmón lesionado (véase la literatura de patente 2).

30 Sin embargo, ninguna de las bibliografías mencionadas anteriormente describe que el HGF induzca la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares ni que la regeneración o la formación de alvéolos sean promovidas por tal inducción de la diferenciación.

[Literatura de patente 1] JP-A-89869/1996 [Literatura de patente 2] JP-A-172207/1994 [Literatura no de patente 1] Biochemical and Biophysical Research Communications, 1984, volumen 122, páginas 1450-1459 [Literatura no de patente 2] Nature, 1989, volumen 342, páginas 440-443 [Literatura no de patente 3] The Journal of Cell Biology, 1985, volumen 129, páginas 1177-1185 [Literatura no de patente 4] The Journal of Biochemistry, 1986, volumen 119, páginas 591-600 [Literatura no de patente 5] International Review of Cytology, 1999, volumen 186, páginas 225-260 [Literatura no de patente 6] Kidney International, 2001, volumen 59, páginas 2023-2038 [Literatura no de patente 7] The Journal of Cell Biology, 1992, volumen 119, páginas 629641 [Literatura no de patente 8] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, volumen 90, páginas 1937-1941 [Literatura no de patente 9] Circulation, 1998, volumen 97, páginas 381-390 [Literatura no de patente 10] Hypertension, 1999, volumen 33, páginas 1379-1384 [Literatura no de patente 11] Journal of Hypertension, 2000, volumen 18, páginas 14111420 [Literatura no de patente 12] Hypertension, 2001, volumen 37, páginas 581-586 [Literatura no de patente 13] Diabetes, 2002, volumen 51, páginas 2604-2611 [Literatura no de patente 14] Massaro, G. D., y col, Nature Medicine, 1997, volumen 3, páginas 675-677 [Literatura no de patente 15] Mao, J. T., y col, American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine, 2002, volumen 165, páginas 718-723 [Literatura no de patente 16] Mason R. J., y col., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 1994, volumen 11, páginas 561-567 [Literatura no de patente 17] Shiratori M., y col., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 1995, volumen 12, páginas 171-180 [Literatura no de patente 18] Ohmichi H, y col., The American Journal of Physiology, 1996, volumen 270, páginas L1031-L1039 [Literatura no de patente 19] Sakamaki, Y, y col., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 2002, volumen 26, páginas 525-533.

Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un agente para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares. Otro objeto de la presente invención es utilizar el agente de inducción de la diferenciación anterior como un agente para promover la regeneración de alvéolos dañados o para la formación de alvéolos.

Los inventores presentes han encontrado recientemente que los alvéolos dañados que pueden observarse, por ejemplo, en el enfisema pulmonar son regenerables, los alvéolos regenerados se obtienen por diferenciación de células de la médula ósea, y el HGF induce tal diferenciación. Como resultado de extensos estudios basados en estos hallazgos, los autores de la presente invención han completado la presente invención. A saber, la presente invención se refiere a:

(1) El uso del factor de crecimiento de los hepatocitos para la preparación de un medicamento para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares,

(2) El uso según el punto (1) anterior, en el que las células alveolares son células epiteliales alveolares, y

(3) El uso según los puntos (1) o (2) anteriores, en el que el medicamento es para 25 promover la regeneración o la formación de alvéolos.

También se describe en el presente documento un procedimiento para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares por medio de la administración de HGF a mamíferos. La invención se refiere al uso del HGF para producir 30 medicamentos para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares. Además, en el presente documento se describe un procedimiento para cultivar células de la médula ósea junto con un agente de inducción de la diferenciación que contiene HGF, y para trasplantar las células alveolares diferenciadas a partir de células de la médula ósea a mamíferos, o un procedimiento para cultivar células de la 35 médula ósea, trasplantar las células de la médula ósea proliferadas a los mamíferos,

administrar simultáneamente un agente de inducción de la diferenciación que contiene HGF e inducir la diferenciación de las células de la médula ósea trasplantadas en células alveolares. Además, en el presente documento se describe una terapia génica para la regeneración de alvéolos dañados o para la formación de alvéolos nuevos que

5 comprende la introducción del gen de HGF así como la administración de HGF.

Puesto que el agente de inducción de la diferenciación de la presente invención induce la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares, pueden formarse nuevos alvéolos en enfermedades en las que los alvéolos estén destruidos, tales como el enfisema pulmonar, la fibrosis pulmonar con pulmón en panal de abejas, la linfangiomiomatosis pulmonar (LAM), el pulmón destruido tras la resección pulmonar y similares. Además, cuando las células de la médula ósea se cultivan en presencia de un agente de inducción de la diferenciación según la presente invención, pueden prepararse células alveolares diferenciadas a partir de las células de la médula ósea.

15 Además, las células alveolares diferenciadas a partir de células de la médula ósea obtenidas cultivando células de médula ósea junto con un agente de inducción de la diferenciación según la presente invención pueden utilizarse como células para transplante en el campo de la medicina regenerativa.

Breve explicación de los dibujos

La Figura 1 muestra hallazgos histológicos en el pulmón de ratones receptores de enfisema pulmonar inducido. La Figura 2 muestra una intersección lineal media de alvéolos en ratones receptores de enfisema pulmonar inducido. La Figura 3 muestra una tasa de células alveolares positivas para proteína fluorescente verde (GFP) con relación a las células alveolares en el pulmón de los ratones receptores de enfisema pulmonar inducido.

Mejor modo para llevar a cabo la invención

El HGF utilizado en la presente invención es una sustancia conocida. En la presente invención puede usarse HGF preparado por diversos procedimientos con la condición de que esté suficientemente purificado para usarse como un medicamento. Con respecto a los procesos de producción de HGF, por ejemplo, puede obtenerse HGF cultivando células de cultivo primario o células de una línea celular establecida que produce HGF, aislando el HGF del sobrenadante del cultivo o similar y purificando el HGF aislado. Como alternativa, también puede obtenerse HGF recombinante según una técnica de ingeniería genética integrando un gen que codifica HGF en un vector adecuado, insertando el vector en células huésped apropiadas para la transformación de las mismas y recogiendo el HGF recombinante diana del sobrenadante del cultivo de las células transformadas (véase, por ejemplo, Documento JP-A-111382/1993; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, volumen 163, página 967).

10 Las células huésped mencionadas anteriormente no están particularmente limitadas, y pueden usarse diversos tipos de células huésped convencionalmente utilizadas en las técnicas de ingeniería genética, tales como Escherichia coli, levaduras, células de animales o similares. El HGF obtenido, siempre y cuando tenga sustancialmente la misma acción que el HGF natural, puede incluir la sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos en su secuencia de aminoácidos. De manera similar, el HGF puede incluir la sustitución, deleción y/o adición de cadena(s) de azúcar. En el presente documento “la deleción, sustitución, adición o inserción de uno o más aminoácidos” en la secuencia de aminoácidos significa que pueden delecionarse, sustituirse, añadirse y/o insertarse los aminoácidos en un número que puede presentarse naturalmente (uno a varios aminoácidos) en la secuencia de aminoácidos por medio de procedimientos técnicos conocidos, tales como las técnicas de ingeniería genética, la inducción de mutación específica de sitio y similares. También, “HGF que incluye la sustitución, deleción y/o adición de cadena(s) de azúcar” significa, por ejemplo, (1) HGF deficiente en glicosilación que se obtiene tratando un HGF glicosilado natural con una enzima para eliminar cadena(s) de azúcar, (2) HGF cuya secuencia de aminoácidos está mutada en un sitio de glicosilación para inhibir la glicosilación, o (3) HGF cuya secuencia de aminoácidos está mutada de manera que la glicosilación tenga lugar en un sitio diferente del sitio de glicosilación natural.

Además, el HGF también incluye una proteína que tiene al menos el 60% o más de homología, de preferencia el 80% o más homología, de más preferencia el 90% o más homología, de más preferencia aún el 95% o más homología con la secuencia de 35 aminoácidos del HGF y que también tiene una actividad para inducir la diferenciación de

células de la médula ósea en células alveolares. La “homología” mencionada anteriormente entre las secuencias de aminoácidos significa por lo general el nivel de homología entre los residuos de aminoácidos que constituyen las secuencias de aminoácidos cuando se comparan las estructuras primarias de las proteínas.

El HGF utilizado en la presente invención puede tener un carboxilato (-COO -), una amida (-CONH2) o un éster (-COOR) así como un grupo carboxilo (-COOH) en su extremo C terminal con la condición de que tenga sustancialmente las mismas acciones que el HGF natural. En el presente documento, pueden mencionarse como R en el éster, grupos 10 alquilo inferiores opcionalmente sustituidos (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, ciclopentilo, bencilo, fenetilo, etc.), grupos arilo (por ejemplo, fenilo, α-naftilo, etc.), grupos pivaloiloximetilo que se utilizan generalmente como éster para la administración oral, y similares. Además, el HGF que puede utilizarse en la presente invención puede incluir HGF en el que un grupo amino de un residuo de metionina en el extremo N terminal esté protegido por un grupo protector (por ejemplo, un grupo acilo tal como formilo, acetilo, etc.), HGF en el que un grupo glutamilo producido por el corte de un lado N terminal in vivo ha cambiado a un ácido piroglutámico y similar.

En la presente invención, regeneración o formación de alvéolos significa formación de alvéolos nuevos o regeneración de los alvéolos dañados. Los alvéolos son órganos de intercambio de gases compuestos por células epiteliales alveolares, capilares que comprenden a células endoteliales de los capilares pulmonares, etc. y tejidos conectivos. Además, los alvéolos de la presente invención incluyen las partes ramificadas de los bronquios conectadas a los alvéolos.

25 El agente de inducción de la diferenciación según la presente invención puede aplicarse con el fin de la regeneración o la formación de alvéolos en enfermedades en las que los alvéolos están destruidos, tales como el enfisema pulmonar, la fibrosis pulmonar con pulmón en panal de abejas, la linfangiomiomatosis pulmonar (LAM), el pulmón destruido después de la resección pulmonar y similares en mamíferos (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, perros, gatos) incluidos los seres humanos.

El agente de inducción de la diferenciación de la presente invención puede tomar diversas formas farmacológicas tales como preparaciones líquidas, preparaciones 35 sólidas, cápsulas y similares, sin embargo, se formula generalmente con el HGF solo o

con una combinación de HGF y un vehículo convencional en inyecciones, inhalaciones, supositorios o preparaciones de administración oral. Las inyecciones mencionadas anteriormente pueden ser inyecciones acuosas o inyecciones oleosas. En el caso de las inyecciones acuosas, pueden prepararse de manera que el HGF esté disuelto en, por ejemplo, una disolución preparada añadiendo adecuadamente un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agentes isotónicos (por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol, sorbitol, ácido bórico, bórax, glucosa, propilenglicol, etc.), tampones (por ejemplo, tampón de ácido fosfórico, tampón de ácido acético, tampón de ácido bórico, tampón de ácido carbónico, tampón de ácido cítrico, tampón Tris, tampón de ácido glutámico, tampón de ácido ε-aminocarproico, etc.), conservantes (por ejemplo, p-oxibenzoato de metilo, p-oxibenzoato de etilo, poxibenzoato de propilo, p-oxibenzoato de butilo, clorobutanol, alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, dehidroacetato de sodio, edetato de sodio, ácido bórico, bórax, etc.), espesantes (por ejemplo, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, alcohol polivinílico, polietilenglicol, etc.), estabilizadores (por ejemplo, hidrogenosulfito de sodio, tiosulfato de sodio, edetato de sodio, citrato de sodio, ácido ascórbico, dibutil hidroxi tolueno, etc.), agentes de control del pH (por ejemplo, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, ácido fosfórico, ácido acético, etc.) y similares a un disolvente acuoso (por ejemplo, agua inyectable, agua purificada, etc.), a continuación se filtra la disolución a través de un filtro, etc., se esteriliza y se llena un recipiente estéril según un procedimiento conocido. Además, pueden utilizarse solubilizantes adecuados tales como alcoholes (por ejemplo, etanol, etc.), polialcoholes (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, etc.) o tensioactivos no iónicos (por ejemplo, polisorbato 80, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 50, etc.).

En el caso de las preparaciones oleosas, puede utilizarse como disolvente oleoso aceite de sésamo, aceite de semilla de soja y similares, y como solubilizante puede utilizarse benzoato de bencilo, alcohol bencílico y similares. La disolución inyectable obtenida se 30 utiliza para llenar usualmente una ampolla o un vial. El contenido de HGF en la preparación de la inyección se ajusta habitualmente hasta aproximadamente 0,0002 a 0,2% peso/volumen, de preferencia aproximadamente 0,001 a 0,1% peso/volumen. Resulta de preferencia que las preparaciones líquidas tales como las inyecciones se conserven después de eliminar el agua por congelación o por liofilización. La preparación liofilizada se vuelve a disolver en agua destilada inyectable antes del uso.

En el caso de las preparaciones que pueden administrarse por vía oral, las formas farmacológicas incluyen, por ejemplo, comprimidos, gránulos, gránulos finos, polvos, cápsulas, líquidos, emulsiones, suspensiones, jarabes y similares. Estas preparaciones pueden prepararse por el procedimiento convencional. En el caso de los gránulos o 5 comprimidos, pueden producirse usando aditivos farmacéuticamente aceptables tales como excipientes (por ejemplo, lactosa, azúcar blanco, glucosa, almidón, celulosa cristalina, etc.), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, ácido esteárico, estearato de calcio, etc.), disgregantes (por ejemplo, almidón, carmelosa de sodio, carbonato de calcio, etc.), ligantes (por ejemplo, pasta de almidón, disolución de 10 hidroxipropilcelulosa, disolución de carmelosa, disolución de goma arábiga, disolución de gelatina, disolución de alginato de sodio, etc.), y similares. También, los gránulos o comprimidos pueden recubrirse con un agente de recubrimiento adecuado (por ejemplo gelatina, azúcar blanco, goma arábiga, cera de carnauba, etc.), un agente de recubrimiento entérico (por ejemplo acetato ftalato de celulosa, copolímero del ácido metacrílico, ftalato de hidroxipropil celulosa, carboximetiletil celulosa, etc.) y similares.

En el caso de las cápsulas, pueden seleccionarse adecuadamente los excipientes conocidos tales como estearato de magnesio, estearato de calcio, talco y ácido silícico anhidro ligero para mejorar la fluidez y la lubricación; celulosa cristalina o lactosa para 20 mejorar la fluidez bajo presión; y los disgregantes mencionados anteriormente. El HGF se mezcla de manera homogénea o se granula con el excipiente mencionado anteriormente,

o los gránulos pueden recubrirse con un agente de recubrimiento adecuado y a continuación se utiliza para llenar una cápsula, o los gránulos pueden encapsularse con una base de cápsulas (por ejemplo, gelatina) que está dotada con la adición de glicerol, 25 sorbitol, etc. para tener plasticidad aumentada. Si es necesario, pueden añadirse agentes colorantes o conservantes (por ejemplo, dióxido de azufre, p-oxibenzoato de metilo, poxibenzoato de etilo, p-oxibenzoato de propilo, p-oxibenzoato de butilo, etc.) a la preparación de la cápsula. La preparación de la cápsula puede tomar una forma de cápsula con recubrimiento entérico, cápsula resistente a los ácidos gástricos, cápsula de liberación controlada, o similares, además de las preparaciones de cápsulas convencionales.

En el caso de las preparaciones de cápsulas con recubrimiento entérico, el HGF recubierto con un agente de recubrimiento entérico o el HGF al que se le añaden los 35 excipientes adecuados mencionados anteriormente se utilizan para llenar una cápsula

convencional. Como alternativa, el HGF solo o el HGF al que se añaden los excipientes adecuados mencionados anteriormente pueden encapsularse en una cápsula con recubrimiento entérico o en una cápsula formada de un material base que comprende un polímero entérico.

En el caso de los jarabes, pueden seleccionarse y utilizarse de manera adecuada estabilizantes (por ejemplo, edetato de sodio, etc.), agentes de suspensión (por ejemplo, goma arábiga, carmelosa, etc.), correctores (por ejemplo, jarabe simple, glucosa, etc.), perfumes, y similares.

10 Además, los supositorios pueden prepararse por el procedimiento de formulación convencional usando una base de supositorios convencional (por ejemplo, manteca de cacao, aceites láuricos, glicerogelatina, macrogol, Witepsol, etc.) y similares. Además, las preparaciones para inhalación pueden producirse por el procedimiento de formulación convencional. En la formulación de inhalaciones, puede usarse cualquier aditivo con la condición de que se utilice comúnmente en las preparaciones para inhalación. Por ejemplo, además de los propulsores, se utilizan los excipientes mencionados anteriormente, aglutinantes, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes isotónicos, agentes de control de pH y correctores (por ejemplo, ácido cítrico, mentol, glicirrizato de amonio, glicina, perfume, etc.). Como propulsores, se utilizan propulsores de gas licuado, gas comprimido, y similares. Los propulsores de gas licuado incluyen, por ejemplo, hidrocarburos fluorados tales como clorofluorocarbonos alternativos (por ejemplo, HCFC-22, HCFC-123, HCFC-134a, HCFC-142, etc.), éter de petróleo licuado, éter de dimetilo, y similares. El gas comprimido incluye, por ejemplo, gas soluble (por ejemplo, gas dióxido de carbono, gas óxido nitroso, etc.) y gas inerte (por ejemplo, gas nitrógeno, etc.).

Además, puede formularse el HGF utilizado en la presente invención junto con un polímero biodegradable en una preparación de liberación retardada. En las preparaciones de HGF de liberación retardada, pueden esperarse efectos tales como el mantenimiento del nivel en sangre, la reducción de la frecuencia de administración, el alivio de los efectos adversos, etc. Tales preparaciones de liberación retardada pueden prepararse, por ejemplo, según el procedimiento convencional como está descrito en Drug Delivery System, capítulo 3, 1986 (publicado por CMC, Japón). El polímero biodegradable

utilizado en la presente invención puede seleccionarse adecuadamente de los polímeros biodegradables conocidos, e incluyen, por ejemplo, polisacáridos (por ejemplo, almidón, dextrano, quitosano, etc.), proteínas (por ejemplo, colágeno, gelatina, etc.), poliaminoácidos (por ejemplo, ácido poliglutámico, polilisina, polileucina, polialanina, 5 polimetionina, etc.), poliésteres (por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polímero o copolímero de ácido láctico/ácido glicólico, policaprolactona, ácido poli-βhidroxibutírico, ácido polimálico, anhídrido de poli-ácidos, copolímero de ácido fumáricopolietilenglicol-vinilpirrolidona, etc.), poli (ortoésteres), ácidos polialquilcianoacrílicos (por ejemplo, ácido polimetil-α-cianoacrílico, etc.), policarbonatos (por ejemplo, carbonato de 10 polietileno, carbonato de polipropileno, etc.), entre los que resultan de preferencia los poliésteres y son de más preferencia el ácido poliláctico, los polímeros o copolímeros de ácido láctico/ácido glicólico. Cuando se utiliza un polímero o copolímero de ácido poliláctico/ácido glicólico, su relación de componentes (% en moles) de ácido láctico/ácido glicólico es de aproximadamente 100/0 a 50/50 en el caso del tiempo de 15 liberación retardada de dos semanas a tres meses, de preferencia dos semanas a un mes, aunque tal relación depende del tiempo de liberación retardada. El peso molecular promedio de tal polímero o copolímero de ácido poliláctico/ácido glicólico es por lo general de 5.000 a 20.000. El homopolímero o copolímero de ácido poliláctico/ácido glicólico puede preparase según el procedimiento conocido, por ejemplo, el procedimiento según está descrito en el documento JP-A-28521/1986. Aunque no hay limitación con respecto a la relación de mezcla del HGF con el polímero biodegradable, el HGF se utiliza generalmente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % p/p a 30 % p/p en relación al polímero biodegradable. El contenido de HGF en las preparaciones anteriores puede ajustarse adecuadamente dependiendo de la forma farmacéutica, las indicaciones, el grado de la enfermedad, la edad, etc.

El agente de inducción de la diferenciación según la presente invención puede contener adecuadamente otros ingredientes activos farmacéuticos, con la condición de que no sean contrarios a la finalidad de la presente invención. Ejemplos de tales ingredientes activos incluyen, por ejemplo, agentes anticolinérgicos (por ejemplo, bromuro de ipratropio, bromuro de flutropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, etc.), estimulantes β2 por inhalación (por ejemplo, fenoterol, sabutamol, formoterol, salmeterol, etc.), esteroides por inhalación (por ejemplo, beclometasona, fluticasona, budesonida,

etc.), antiasmáticos (por ejemplo, teofilina, procaterol, ketotifeno, azelastina, etc.), antialérgicos (por ejemplo, ketotifeno, terfenadina, azelastina, epinastina, etc.), agentes antiinflamatorios (por ejemplo, diclofenaco sódico, ibuprofeno, indometacina, etc.), antibióticos (por ejemplo, cefmenoxima, cefdinir, ofloxacina, tosfloxacina, norfloxacina, 5 etc.), antimicóticos (por ejemplo, fluconazol, itraconazol, etc.) y similares. Además, una preparación que contiene esos ingredientes activos farmacéuticos puede utilizarse en combinación con una preparación de la presente invención. No hay limitación en los ingredientes activos farmacéuticos con la condición de que puedan lograrse los fines de la presente invención, y es posible usar tales ingredientes activos apropiadamente en una relación de mezcla o una relación de combinación adecuada.

El agente de inducción de la diferenciación según la presente invención puede administrarse a través de una vía de administración adecuada dependiendo de su forma farmacéutica. Por ejemplo, las inyecciones pueden administrarse por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea o intramuscular y similares. La dosis de inyección es usualmente de 0,001 mg a 1000 mg en base al HGF, de preferencia de 0,01 mg a 100 mg, que se administra adecuadamente una vez al día o varias veces al día en forma dividida, aunque puede ajustarse adecuadamente dependiendo de la afección, la edad, el peso corporal de los pacientes, etc.

El agente de inducción de la diferenciación según la presente invención puede utilizarse para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares. Como células de la médula ósea, puede usarse cualquier célula de la médula ósea de mamíferos, incluido el ser humano, aunque resulta de preferencia el uso de células 25 médula ósea flotantes. Por ejemplo, se recogen las células de la médula ósea humana por el procedimiento conocido, se suspenden en un líquido de cultivo celular, se siembran en una placa de petri de plástico y se cultivan para recoger solamente las células flotantes de la misma. Posteriormente, las células de la médula ósea flotantes se cultivan junto con un agente de inducción de la diferenciación de la presente invención. Como 30 líquido de cultivo celular, puede usarse un líquido de cultivo convencional tal como DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, etc. Aunque pueden añadirse los aditivos que son de uso general en el cultivo celular, tales como el suero de ternera fetal, al líquido de cultivo celular anterior, es preferibles usar un líquido de cultivo celular sin suero debido a la inmunología del transplante. La concentración de HGF en el agente de inducción de la 35 diferenciación es de aproximadamente 1 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. Las condiciones de cultivo son las que se utilizan en el cultivo celular habitual, por ejemplo, aproximadamente a 35 ºC ±2 ºC en presencia de dióxido de carbono al 5% y similares. Las células de la médula ósea cultivadas de ese modo se cultivan durante una a cinco semanas, dando como resultado la diferenciación en células alveolares. Las células alveolares inducidas para diferenciación derivadas de las células de médula ósea 5 obtenidas como se describió anteriormente están disponibles como células para el transplante de órganos. Para ser más específico, por medio de la inyección intravenosa de las células alveolares diferenciadas y proliferadas a partir de células de la médula ósea de un paciente con enfisema pulmonar al paciente, puede conseguirse el transplante en el pulmón. Según este procedimiento, es posible obtener una gran cantidad de células alveolares necesarias para el transplante en pacientes con enfisema pulmonar, a partir de células de la médula ósea de los mismos pacientes.

Además, puede haber otra forma de realización que comprende cultivar células de la médula ósea, utilizar las células proliferadas no diferenciadas resultantes de la médula 15 ósea como células para el transplante, y administrar un agente de inducción de la diferenciación de la presente invención a un receptor. Según la presente invención, la inducción de la diferenciación de las células trasplantadas de la médula ósea a células alveolares tienen lugar con eficacia en el cuerpo, porque se cultivan y proliferan una pequeña cantidad de células recogidas de la médula ósea de un paciente con enfisema pulmonar y se devuelve una gran cantidad de las células de la médula ósea resultantes al paciente al mismo tiempo que se administra un agente de inducción de la diferenciación de la presente invención.

Con respecto a las células de la médula ósea a utilizar en la transferencia adoptiva 25 mencionada anteriormente, de preferencia se recogen del mismo individuo a trasplantar, debido a la inmunología del transplante.

En los últimos años, se han informado terapias génicas que utilizan el gen de HGF (véase Circulation, 1997, volumen 96, Nº 3459; Nature Medicine, 1999, volumen 5, páginas 22630 230; Circulation, 1999, volumen 100, Nº 1672; Gene Therapy, 2000, volumen 7, páginas 417-427), y tales terapias génicas se han establecido tecnológicamente. La presente invención incluye un agente de terapia génica que comprende la introducción del gen de HGF para la regeneración o la formación alveolar y para la inducción de la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares, así como la administración del HGF 35 como se mencionó anteriormente. A continuación, en el presente documento se

describirá detalladamente la terapia génica de HGF.

Como se utiliza en el presente documento, “gen de HGF” significa un gen capaz de expresar HGF. Para ser más específico, se da de ejemplo un gen en el que el ADNc de 5 HGF está integrado en un vector de expresión adecuado (vector no viral, vector viral) como se describe en la bibliografía no de patente 2; patente japonesa Nº 2.777.678; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, volumen 163, página 967; o Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, volumen 172, página 321. Aquí, la secuencia de bases del ADNc que codifica HGF está descrita en las bibliografías anteriores, y también está registrada 10 en bases de datos tales como Genebank. Basándose en los datos de secuencia anteriores, es por consiguiente posible realizar, por ejemplo, RT-PCR al ARNm del hígado, etc., por medio del uso de un segmento de ADN adecuado como cebador de PCR, por el que se realiza la clonación del ADNc de HGF. Tal clonación puede ser realizada fácilmente por los expertos en la técnica según libros de texto fundamentales tales como Molecular Cloning 2ª edición, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Además, el gen de HGF utilizado en la presente invención no está limitado a los genes mencionados anteriormente, y puede usarse cualquier gen de HGF como el gen de HGF 20 de la presente invención con la condición de que exprese una proteína que tenga sustancialmente la misma actividad que la del HGF. Es decir, entre los ADN que puedan hibridar con el ADNc mencionado anteriormente bajo condiciones rigurosas y los ADN que codifiquen una proteína en la que de uno a una pluralidad de aminoácidos (de preferencia varios aminoácidos) en la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc 25 mencionado anteriormente estén sustituidos, delecionados, añadidos y/o insertados, cualquier ADN que codifique una proteína que tenga una actividad de HGF está incluido en el alcance del gen de HGF utilizado en la presente invención. Tales ADN pueden obtenerse fácilmente por medio de procedimientos de hibridación comunes, procedimientos de PCR y similares, específicamente por referencia a los libros de texto fundamentales tales como Molecular Cloning mencionado anteriormente.

Los genes de HGF utilizados en la presente invención pueden aplicarse para la regeneración o formación de células alveolares y para la inducción de la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares, de la misma manera que la proteína HGF anteriormente mencionada.

Cuando se administra a un paciente un agente de terapia génica que comprende el gen de HGF como ingrediente activo, tal administración puede llevarse a cabo de la manera convencional descrita en, por ejemplo, Basic Technology of Gene Therapy, Separate Volume of Experimental Medicine publicado por Yodosha, Japón, 1996; Gene Introduction and Expression Analysis Methos, Separate Volume of Experimental Medicine, publicado por Yodosha, Japón, 1997; Gene Therapy Development Research Handbook, editado por NTS, Japón , 1999.

La forma farmacéutica puede incluir una diversidad de formas conocidas adecuadas para cada forma de administración mencionada anteriormente. El contenido de ADN en la preparación puede controlarse apropiadamente, dependiendo de la enfermedad diana, la edad y el peso corporal de los pacientes, etc., y usualmente el contenido de ADN de acuerdo con la presente invención va de 0,0001 a 100 mg, de preferencia de 0,001 a 10 mg.

15 Además, el gen de HGF y el HGF pueden utilizarse cada uno independientemente o en combinación.

La presente invención se ilustrará por medio de los siguientes Ejemplos, pero no está limitada a los mismos. El porcentaje (%) significa % en masa a menos que se indique de otra manera.

Ejemplo Reconstitución de la médula ósea:

Se establecieron ratones transgénicos para la proteína fluorescente verde (GFP) potenciada de la cepa C57BL/6 en la universidad de Osaka, Japón. Se transplantaron las células del hígado de hígados fetales recogidas de embriones GFP de 13,5 días a los 30 ratones machos C57BL/6 que fueron irradiados usando dosis de 12 Gy antes del transplante, según el procedimiento descrito por Morishita, y col. en Hypertension, 1999, volumen 33, páginas 1379-1384. Los ratones en los que más del 95% de los glóbulos blancos circulantes (leucocitos periféricos) habían sido reemplazados totalmente con las células de la médula ósea procedentes del ratón GFP tres semanas después del transplante sirvieron como ratones receptores en el experimento.

Inducción de enfisema pulmonar y tratamiento

El enfisema pulmonar experimental se indujo por la instilación intranasal de elastasa pancreática porcina en los ratones receptores. Tres semanas después de la instilación de 5 la elastasa, los ratones receptores presentaron cambios enfisematosos en los pulmones. En este punto, los ratones receptores con enfisema pulmonar inducido se separaron aleatoriamente en dos grupos, es decir un grupo con administración de vehículo y un grupo con administración de HGF, a los que se les inyectó por vía intraperitoneal una dieta equilibrada y HGF respectivamente, en una dosis de 1 mg/kg una vez al día durante 12 días.

Anatomía histológica

Los pulmones de los ratones receptores se fijaron con paraformaldehído al 4%-PBS (solución salina tamponada de fosfato) a una presión de 20 cm H20, y se prepararon secciones de parafina según el procedimiento convencional. Las secciones de parafina se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE). La GFP se detectó usando el anticuerpo anti-GFP (Abcam, Cambridge, RU) y se visualizó con 3,3'-diaminobencidina. Se contó la cantidad de células positivas para GFP en 200 alvéolos separados de cada ratón (n de cada grupo = 5). La extensión de las lesiones enfisematosas se evaluó midiendo la intersección lineal media (a continuación abreviada como Lm) de los septos alveolares según el método de Thurlbeck (véase Ono, M. y col., Circulation 2002, volumen 106, páginas 1264-1269). Es decir, se midió la Lm de la célula alveolar en 20 campos visuales tomados aleatoriamente en dos portaobjetos de cada ratón con un aumento de 400x. La distancia total dividida por el número de intersecciones alveolares dio la Lm. Las evaluaciones histológicas cegadas fueron realizadas por tres observadores (K.I., T.S. y H.K.).

Se realizó la tinción de inmunofluorescencia de las secciones congeladas para identificar el fenotipo de las células positivas para GFP. El anticuerpo anti-citoqueratina 5 y 8 se adquirió de Chemicon (Temecula, CA, EEUU) y los anticuerpos anti-CD34 y anti-CD45 de Pharmingen (San Diego, CA, EEUU).

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como la media ± error estándar. Las comparaciones se realizaron por el análisis de varianza y, cuando se identificaron diferencias globales, se 5 usaron contrastes múltiples con un ajuste de Bonferroni para identificar cuáles eran los grupos significativamente diferentes. La significancia estadística se definió como p< 0,5.

Resultados En las observaciones de secciones de tejido usando un microscopio óptico, los alvéolos de los ratones receptores con enfisema pulmonar inducido por elastasa estaban destruidos, y cada alvéolo estaba aumentado aproximadamente de 3 a 5 veces en comparación con los que no habían sido tratados con elastasa. Por otra parte, el alvéolo en el grupo con administración de HGF fue casi igual al del grupo sin tratamiento con elastasa (véase Figura 1). La intersección lineal media en los ratones receptores con enfisema pulmonar inducido se muestra en la Figura 2. La intersección lineal media en los ratones receptores con enfisema pulmonar inducido por elastasa aumentó aproximadamente 1,7 veces y la del grupo con administración de HGF fue prácticamente la misma, en comparación con la del grupo sin tratamiento con elastasa.

20 En la Figura 3 se muestra la tasa de alvéolos positivos para GFP con relación a los alvéolos totales en los pulmones de los ratones receptores. La tasa de células positivas para GFP fue de aproximadamente el 1% en los ratones receptores que no recibieron el tratamiento con elastasa. La tasa de células positivas para GFP aumentó aproximadamente al 10% en los ratones receptores con enfisema pulmonar inducido por elastasa, mientras que en el grupo con administración de HGF aumentó aproximadamente al 17,5%. Además, los resultados de la observación histológica por la tinción de inmunofluorescencia revelaron que tales células positivas para GFP se habían diferenciado en células epiteliales alveolares y células endoteliales de los capilares pulmonares a partir de las células de la médula ósea procedentes de ratones GFP. Estos resultados muestran que el HGF promueve la inducción de la diferenciación de las células de la médula ósea en alvéolos (células epiteliales alveolares y células endoteliales de los capilares pulmonares, etc.). Aplicabilidad industrial

El agente de inducción de la diferenciación de la presente invención induce la diferenciación de células de la médula ósea en células alveolares y es útil como agente para la regeneración de alvéolos destruidos a causa del enfisema pulmonar, etc. También, las células alveolares inducidas a la diferenciación a partir de células de la médula ósea pueden utilizarse como células para transplante en el campo de la medicina regenerativa.




Reivindicaciones:

1. Uso del factor de crecimiento de los hepatocitos para la preparación de un

medicamento para inducir la diferenciación de células de la médula ósea en células 5 alveolares.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que las células alveolares son células epiteliales alveolares.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el medicamento es para promover la regeneración/formación alveolar.






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