Microorganismos recombinantes para una mayor producción de ácidos orgánicos.

Una cepa recombinante de un microorganismo productor de ácido succínico,

habiendo sido transformado dicho microorganismo con al menos un polinucleótido que codifica una enzima Zwf y que está ligado operativamente a una secuencia de promotor, en la que la secuencia de ARNr 16S del microorganismo tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de ARNr 16S de Actinobacillus succinogenes.

Microorganismos recombinantes para una mayor producción de ácidos orgánicos Declaración respecto al apoyo del Gobierno de Estados Unidos La presente invención se llevó a cabo con el apoyo del Gobierno de Estados Unidos a tenor del Acuerdo de Cooperación Nº. DE-FC36-02GO12001 otorgado por el Departamento de Energía. El Gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos sobre la presente invención.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica beneficio a tenor de 35 U.S.C. § 119 (e) de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº. 60/647.141, presentada el 26 de enero de 2005; y de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº. 60/639.443, presentada el 22 de diciembre de 2004.

Antecedentes Se podrían producir muchas sustancias químicas que actualmente proceden de materiales petroquímicos a partir de carbohidratos de origen natural. En particular, ácido succínico, un ácido dicarboxílico de cuatro carbonos, tiene el potencial de convertirse en una sustancia química de mercancía de elevado volumen que se podría usar como material de partida para procesos comerciales que producen un intermedio importante y sustancias químicas de especialidad para las industrias de productos para consumo y que actualmente se basan en materiales de partida procedentes de materias químicas no renovables. Por ejemplo, como sustancia química de mercancía, el ácido succínico podría sustituir a materiales de partida petroquímicos usados en la producción de compuestos de 1, 4-butanodiol (BDO) y tetrahidrofurano (THF) , que son útiles como disolventes y materiales de partida para muchas industrias. Por ejemplo, los compuesto de BDO y THF son útiles para producir resinas para cuerpos de automóvil, termoplásticos para su uso en electrodomésticos, y polímeros elásticos tales como Lycra™ en la industria textil. Además, los compuestos de BDO y THF también tiene muchos usos de especialidad en las industrias agroquímica y farmacéutica. Notablemente, cabe esperar un aumento del consumo mundial de BDO a una tasa anual tan elevada como un 4 %.

Las sustancias petroquímicas actualmente usadas para producir BDO y THF incluyen acetileno, formaldehído, butano, butadieno y óxido de propileno. Todos estos tienen diversas propiedades peligrosas, tales como inflamabilidad extrema, inestabilidad química y toxicidad. Además, debido a que estos materiales proceden de petróleo, agotan un recurso no renovable, y tras eliminación o destrucción, finalmente liberan carbono (en forma de dióxido de carbono) a la atmósfera. De este modo, el desarrollo de ácido succínico como sustitutivo de materiales de procedencia petroquímica, reduciría la manipulación y almacenamiento de materiales peligrosos, mejoraría la seguridad industrial y comunitaria, reduciría la contaminación y los costes ambientales y reduciría la dependencia del petróleo.

La producción de ácido succínico y otros compuestos orgánicos por medio de fermentación de azúcares resulta económicamente viable. Se ha usado un número de microorganismos para producir ácido succínico usando azúcares de maíz como fuente de carbono. Como tal, el desarrollo de ácido succínico como sustitutivo de materiales de partida petroquímicos ampliaría los mercados para productos de maíz y otros productos agrícolas y/o biomasa que pueden proporcionar azúcares aptos para fermentación.

Formalmente, el mecanismo bioquímico para la producción de ácido succínico añade una molécula de dióxido de carbono al compuesto de tres carbonos de fosfoenolpiruvato (PEP) , para producir el compuesto de cuatro carbonos de oxaloacetato (OAA) . Las siguientes etapas en el mecanismo de ácido succínico son parte del ciclo de ácido tricarboxílico inverso (ciclo TCA) e incluyen dos etapas de reducción obligadas. En el proceso bioquímico que conduce desde OAA hasta succinato, OAA debe primero reducirse para producir L-malato. Posteriormente, se deshidrata el L-malato para producir fumarato y agua. A continuación, se reduce el fumarato para proporcionar ácido succínico. En las técnicas químicas, "reducción" se refiere a la adición de hidrógeno molecular a un compuesto.

Generalmente, no se encuentra hidrógeno molecular libre en los sistemas biológicos intracelulares. En lugar de ello, se lleva a cabo la reducción a través del uso de co-enzimas que funcionan como equivalentes bioquímicos de hidrógeno (es decir, como vehículos de hidrógeno molecular) y se denominan "equivalentes reductores". Los equivalentes reductores incluyen los coenzimas nicotinamida adenina dinucleótido hidrógeno ("NADH") , nicotinamida adenina dinucleótido fosfato hidrógeno ("NADPH") , flavina adenina dinucleótido hidrógeno ("FADH2" y flavina mononucleótido hidrógeno ("FMNH") . Generalmente, NADH y NADPH pueden interconvertirse en un intervalo de microorganismos por medio de la enzima piridina dinucleótido transhidrogenasa.

Los equivalentes reductores requeridos para transformar OAA en succinato se proporcionan por medio de NAD (P) H2, FADH2 u otros co-factores. Resulta esencial que una cantidad suficiente de equivalentes reductores se encuentre disponible para la transformación de OAA en succinato. Si no se encuentran disponibles suficientes equivalentes reductores, el mecanismo bioquímico no funciona de manera eficaz, y únicamente una parte de OAA se transforma en el succinato deseado.

Se pueden producir los equivalentes reductores en un número de procesos biológicos que se encuentra de forma común en el metabolismo celular. Por ejemplo, se pueden generar los equivalentes reductores en el ciclo de pentosa fosfato (PPC) . En el PPC, se convierte la glucosa-6-fosfato en D-6-fosfo-glucono-δ-lactona por medio de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que también se conoce como enzima de Zwischenferment o Zwf. Como parte de la presente conversión, se convierte NADP en NADPH como aceptor de equivalentes reductores.

Se han descrito pocos microorganismos que produzcan suficientes concentraciones de ácido succínico para la producción comercial. Un de los citados microorganismos es Actinobacillus succinogenes, un organismo anaerobio facultativo que se aisló a partir de rumen bovino. Este organismo produce una elevada concentración de ácido succínico y tolera una eleva concentración de azúcar. Actinobacillus succinogenes es uno de los productos mejores conocidos de ácido succínico, pero los rendimientos fermentados de esta cepa pueden estar limitados por la ausencia de equivalentes reductores. El documento WO 2004/003175 se refiere a la sobre-expresión del gen zwf de E. coli para producir amino ácidos. Además, el presente documento no está relacionado con el desarrollo de microorganismos para producir ácido succínico. De hecho, aunque el documento WO 2004/003175 muestra la transformación de E. coli con el gen zwf, el presente documento únicamente muestra que daría como resultado una mayor proliferación celular. No existen consideraciones algunas acerca de la sobre-expresión del gen zwf en otros microorganismos o sobre la producción aumentada de ácido succínico en el documento WO 2004/003175. KIM PIL ET AL: "Construcción de un vector de lanzadera para la sobre-expresión de proteínas recombinantes en Actino-bacillo succinogenes." PLASMID, vol. 51, nº. 2, Marzo 2004 (2004-03) , páginas 108-115, XP009109260 ISSN: 0147-619X divulga una cepa recombinante de A. succinogenes, que sobre-expresa proteínas recombinantes bajo el control del promotor de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa de A. succinogenes. De nuevo, no existen consideraciones algunas en el presente documento con respecto a la sobre-expresión del gen zwf y una mayor producción de ácido succínico.

Sumario Se divulgan microorganismos recombinantes para producir ácidos orgánicos El microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo productor de ácido succínico, habiéndose transformado dicho microorganismo con al menos un polinucleótido que codifica una enzima zwf y que está ligado de forma operativa a una secuencia de promotor, en el que la secuencia de ARNr 16S del microorganismo tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr 16 S de Actino-bacilo succinogenes.

Normalmente, el microorganismo recombinante es capaz de producir uno o ácido succínico en un nivel apropiado para producción comercial. El microorganismo recombinante es un microorganismo productor de ácido succínico. Por ejemplo, los microorganismos pueden producir ácido succínico en una concentración apropiada para la producción comercial. Una concentración apropiada para producción comercial puede ser de al menos aproximadamente 20 g/l, 40 g/l, 60 g/l, 80 g/l, 100 g/l, 120 g/l, y/o 140 g/l. De manera deseable, el microorganismo... [Seguir leyendo]

1. Una cepa recombinante de un microorganismo productor de ácido succínico, habiendo sido transformado dicho microorganismo con al menos un polinucleótido que codifica una enzima Zwf y que está ligado operativamente a una secuencia de promotor, en la que la secuencia de ARNr 16S del microorganismo tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de ARNr 16S de Actinobacillus succinogenes.

2. Una cepa recombinante de la reivindicación 1, en la que dicho microorganismo está seleccionado entre Actinobacillus succinogenes, Taxón de Bisgaard 6 y Taxón de Bisgaard 10.

3. Una cepa recombinante de la reivindicación 1 o 2, en la que el polinucleótido comprende al menos un 10 polinucleótido de Escherichia coli que codifica dicha enzima zwf.

4. Una cepa recombinante de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho polinucleótido comprende al menos un polinucleótido de Actinobacillus succinogenes que codifica dicha enzima zwf.

5. Una cepa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha secuencia de promotor

comprende al menos un promotor de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa ligado operativamente a dicho 15 polinucleótido que codifica dicha enzima zwf.

6. Una cepa recombinante de la reivindicación 1 o 5, en la que dicho promotor es un promotor de Actinobacillus succinogenes.

7. Una cepa recombinante de la reivindicación 1 o 5, en la que dicho promotor es un promotor de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa de Actinobacillus succinogenes.

8. Una cepa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el polinucleótido que codifica la enzima zwf tiene al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ. NO ID: 1.

9. Una cepa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la enzima zwf tiene al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ. NO. ID:3.

10. Una cepa recombinante de Actinobacillus succinogenes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones

1-9, en la que el polinucleótido comprende un promotor que tiene al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ. NO. ID: 4 y está ligado operativamente a un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ. NO. ID: 1.

11. Una cepa recombinante de la reivindicación 1, en la que dicho microorganismo es Actinobacillus succinogenes depositado con el Número de Acceso ATCC PTA-6255.

12. Un procedimiento para producir ácido succínico, que comprende someter a cultivo el microorganismo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en condiciones suficientes para producir ácido succínico.

Figura 1. Análisis de flujo metabólico de la fermentación por lotes de la variante FZ45 de A. succinogenes usando glucosa.

ent glucosa ent

en sorbitol, manitol ent glucosa-6-P 3.33H R5P xilosa, arabinosa

CO2 PEP glicerol entrada

piruvato salida etanol salida

en tra OAA citrato acetil-coA acetato a-cetoglutarato salida

malato fumarato succinato salida

Figura 2. Análisis de flujo metabólico de la fermentación por lotes de FZ45/pJR762.73 de A. succinogenes FZ45/pJR762.73 usando glucosa.

Figura 3. Actividades enzimáticas Zwf en extractos celulares de cepas transformadas.

Actividad específica [umol / min mg]