Biomarcador en suero bioquímico.

Método para detectar la presencia y/o concentración de la proteína BAG3 soluble en una muestra biológica desconocida,

que comprende las etapas de:

a. determinar la presencia o valores de concentración de BAG3 soluble en una muestra biológica obtenida anteriormente, que consiste en suero o plasma;

b. comparar los valores obtenidos de la muestra con valores de referencia o con los valores obtenidos de muestras biológicas de referencia,

c. opcionalmente, determinar agrupaciones adicionales de valores similares o división en grupos con valores medios estadísticamente diferentes,

d. asociar la presencia y/o el nivel de BAG3 soluble con un estado patológico seleccionado del grupo que consiste en cardiopatía o cáncer pancreático.

Biomarcador en suero bioquímico Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo técnico de los marcadores en suero de diagnóstico.

Estado de la técnica

BAG3 (Seo. de ref.: NP_4272; ID del gen 9531) es una protelna citoplasmática de 74 kDa concentrada particularmente en el retículo endoplasmático rugoso. Recientemente se ha descrito una forma citoplasmática de 4 kD que está asociada con sinaptosomas (Brown et al., 28). Además, se expresaron una forma recombinante y algunos mutantes de deleción en E. coli (Rose et al 27 (a)).

En seres humanos, la expresión del gen bag3 es constitutiva en miocitos, en algunos otros tipos de células normales así como en algunos cánceres (leucemias y linfomas, mieloma, cáncer pancreático y tiroideo, melanoma, osteosarcoma, etc.) (Romano et al, 23; Homma et al. 26; Chiappetta et al., 27, Rosati et al., 27) y se induce en diversos tipos de células en respuesta a diferentes factores de estrés: líneas de cáncer pancreático expuestas a altas temperaturas (Liao et al. 21), células HeLa incubadas con metales pesados o sometidas a altas temperaturas (Pagliuca et al., 23), leucocitos tratados con maleato de dietilo, un agente inductor de estrés oxidativo (Bonelli et al., 24), células de la retina murinas dañadas por la luz (Chen et al., 24), células Molt-4 (células T leucémicas humanas) tratadas con ultrasonidos a baja intensidad (Tabuchi et al., 26), células de la microglía humanas expuestas a virus VIH-1 (Rosati et al., 27 a). Estos hallazgos indican que la regulación de la expresión de BAG3 es un componente importante en la respuesta celular al estrés y concuerda con la presencia de elementos que responden al factor de transcripción HSF (factor de choque térmico) 1, activado en diversas formas de estrés celular, en el promotor del gen bag3. La modulación de la actividad de HSF1 conduce a una reducción significativa de los niveles celulares de proteína BAG3, indicando que este regulador desempeña un papel importante en la expresión de bag3 (Franceschelli et al., 28). EGR1 es otro factor de transcripción implicado en la regulación de la expresión de bag3 (Gentilella et al., 28).

La primera evidencia de que BAG3 afecta a la supervivencia de células de cáncer primarias apareció a partir de estudios en células leucémicas primarias de 24 pacientes con leucemia linfoide crónica de células B (B-CLL) y 11 niños con leucemia linfoblástica aguda (ALL): la disminución de los niveles de BAG3 mediante el uso de oligodesoxinucleótidos antisentido específicos dio como resultado un aumento de más del 1% de cuerpos apoptóticos (p <,1) tal como también se describe en los documentos en EP 1465927 A1 y U.S. 7.537.76 B2. Por tanto, el porcentaje de apoptosis en estas células aumentó significativamente en comparación tanto con células no tratadas como con células tratadas con los mismos fármacos quimioterápico (Leone y Turco, 21, Romano et al., 23a, 23b). En leucocitos normales, se probó que la sobreexpresión del gen reducía significativamente la respuesta apoptótica (Bonelli et al., 24). Posteriormente, un análisis de tejido tiroideo de ser humano mostró que el tejido normal y muestras de bocio dieron resultados negativos en pruebas para determinar la expresión de BAG3, mientras que muestras de cáncer dieron resultados de las pruebas claramente positivos, y se observó una expresión más alta de BAG3 en tumores anaplásicos.

En otros tumores, tales como células de osteosarcoma y melanoma, ARNip específico de bag3 provoca una reducción de la supervivencia de células básales, lo que muestra un efecto notablemente sinérgico con agentes quimioterápicos; el silenciamiento de BAG3 en células de melanoma humanas implantadas en ratones redujo significativamente el crecimiento tumoral, con mejora de la supervivencia de animales (Ammirante et al., en impresión). Por otro lado, la sobreexpresión de bag3 da como resultado una disminución de la apoptosis de células de cáncer tratadas con fármacos quimioterápicos o expuestas a otros estímulos proapoptóticos (Rose et al., 27 (b)).

El documento WO211/67377 da a conocer métodos para detectar proteína BAG-3 en muestras biológicas basándose en secuencias de nucleótidos y proteínas de BAG-3 y métodos que asocian la presencia de proteína BAG-3 con estados patológicos, en particular leucemias y enfermedades que implican apoptosis.

Aunque se ha detectado la presencia de BAG-3 citoplasmática en diferentes sistemas de células y se ha encontrado asociada con tumores, por ejemplo leucemia o cánceres tiroideos, así como más generalmente a supervivencia celular, hasta la fecha nunca se había descrito una forma soluble de BAG3, y su presencia en el suero nunca se había asociado con estados de molestias cardiacas.

Por tanto, la presente invención soluciona el problema de la identificación de una nueva forma soluble secretada de la proteína BAG-3 y de su producción en seres humanos y otros mamíferos, que está asociada con estados patológicos específicos de manera sorprendentemente específica y sensible.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para detectar la presencia y/o concentración de proteína BAG3 soluble

en una muestra biológica desconocida, que comprende las siguientes etapas:

a. determinar la presencia o concentración de BAG3 soluble en una muestra biológica obtenida anteriormente,

b. comparar los valores obtenidos de una muestra con valores de referencia o con valores obtenidos de muestras biológicas de referencia,

c. opcionalmente, determinar grupos adicionales de valores similares (y posiblemente su división adicional en grupos con valores medios estadísticamente diferentes),

d. asociar la presencia y/o el nivel de BAG3 soluble a un estado patológico, en el que el estado es una cardiopatía o cáncer pancreático.

Preferiblemente, la etapa de dosificación (b) se realiza mediante ELISA con anticuerpos, preferiblemente monoclonales. Alternativamente, la proteína soluble puede aislarse del suero de pacientes.

El método de ensayo propuesto permite una separación estadísticamente significativa del grupo de pacientes con problemas cardiacos del grupo de gente sana, preferiblemente en grupos de edad comparable. También puede estratificar tales pacientes con cardiopatía en subgrupos de pacientes con un aumento del riesgo (Insuficiencia cardiaca, IC).

Descripción de las figuras

Figura 1. Sección ¡nmunohistoquímica que muestra la expresión de la proteína BAG3 en tejido cardiaco normal y tras la inducción de infarto en ratas.

Figura 2. Inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos anti-BAG3 realizada en lisado y sobrenadantes de cardiomiocitos.

Figura 3. Análisis de inmunotransferencia de tipo Western, con anticuerpos anti-BAG3, de la proteína soluble purificada a partir del suero de un paciente con cardiopatía isquémica crónica.

Figura 4. Curva de calibración de ELISA para la detección de BAG3.

Figura 5. Representación gráfica de concentraciones en suero de BAG3 en donantes sanos y según grupos de edad.

Figura 6. Representación gráfica de concentraciones en suero de BAG3 en donantes sanos divididos en grupos de edad y en pacientes.

Figura 7. Curva ROC de la prueba ELISA para la detección de la proteína BAG3 en pacientes con insuficiencia cardiaca.

Figura 8. Representación gráfica de concentraciones en suero de BAG3 en pacientes con diagnóstico de insuficiencia cardiaca en comparación con pacientes con cardiopatía no descompensada.

Figura 9. a) Producción de proteína ¡NOS (óxido nítrico slntasa ¡nduclble) y de una proteína control para comparación (GAPDH) en macrófagos murinos (J774) estimulados con dosis crecientes de BAG-3 recombinante soluble en presencia o ausencia de LPS, b) determinación de nitrito con reactivo de Grless en el mismo tipo de célula.

Figura 1. Análisis de microscopía confocal de la unión de proteína rBAG3 a la superficie de células J774. Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se basa en el hallazgo de una forma soluble de la proteína BAG3 con una actividad biológica Inesperada en comparación con la función descrita anteriormente para la forma ¡ntracelular (regulación del ciclo celular y apoptosis): por ejemplo tal forma, secretada de forma activa por las células, puede activar monocltos/macrófagos.

Se encontró que la forma soluble también es un marcador bioquímico en suero que es altamente específico para determinadas condiciones patológicas, especialmente cardiopatía y cáncer pancreático. Por tanto, el objeto de la presente Invención es la forma soluble de la proteína... [Seguir leyendo]