USO DE SUERO POLICLONAL DE CABRA ANTI-VIH COMO AGENTE TERAPÉUTICO.

El uso de un anticuerpo policlonal de cabra anti-AHL de clase II en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un ser humano que implica una respuesta inmune proliferativa

, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una lesión axonal o nerviosa, y en el que el anticuerpo policlonal de cabra anti-AHL de clase II se induce después de la exposición al VIH

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2002/003037.

Solicitante: AIMSCO LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: 4A GILDREDGE ROAD, EASTBOURNE EAST SUSSEX BN21 4RL REINO UNIDO.

Inventor/es: WHITE,STANLEY D. T, DALGLEISH,ANGUS G, HEENEY,JONATHAN, CADOGAN,MARTIN.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 2 de Julio de 2002.

Fecha Concesión Europea: 25 de Agosto de 2010.

Clasificación PCT:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)

Clasificación antigua:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

google+ twitter facebook

Descripción:

La presente invención se refiere, en particular pero no exclusivamente, a un agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades que implican una respuesta inmune proliferativa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El documento WO 97/02839 se refiere a Supresión Viral, Tratamiento y Prevención de Infecciones Virales. Este, proporciona un procedimiento para producir anticuerpos neutralizantes para el tratamiento de una infección viral en un paciente, que comprende las etapas de:

a. exponer a un mamífero a un virus, de tal manera, que dicho mamífero produzca anticuerpos neutralizantes contra dicho virus y

b. recoger los anticuerpos neutralizantes de dicho mamífero. En los ejemplos, se obtiene una vacuna contra el VIH, denominada AAV2, mezclando virus VIH con anticuerpos neutralizantes del VIH obtenidos de una cabra.

El documento WO 01/60156 se refiere a Anticuerpos Neutralizantes y a Composiciones de Potenciación Inmunomoduladora. Este, proporciona una composición inmunomoduladora que comprende:

anticuerpos heterólogos específicos para un antígeno; y

un antígeno, en el que los anticuerpos heterólogos forman un complejo con el antígeno por

combinación con un vehículo farmacéutico.

Los ejemplos son similares a los del documento WO 97/02839, y de nuevo, se obtiene una vacuna contra el VIH, denominada AAV2, mezclando virus VIH con anticuerpos neutralizantes del VIH obtenidos de una cabra.

El documento WO 96/20215 describe el uso de anticuerpos anti-CMH de clase II, que interfieren en la interacción entre lipopolisacáridos (LPS) y su molécula transductora. Se dice que esto es beneficioso en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos inflamatorios. La publicación describe resultados experimentales obtenidos de sistemas in vitro y de tratamiento in vivo de ratones a los que se inyectó LPS y previamente tratados con anticuerpos de ratón anti-ALH de clase II.

El documento WO 98/13066 describe el uso de anticuerpos anti-CMH de clase II para inhibir la función de células B independientes de linfocitos T para prevenir o reducir el rechazo de xenoinjerto.

El documento WO 02/07760 está relacionado con un agente terapéutico. Este, proporciona un procedimiento de prevención de infección por VIH o un tratamiento de un individuo infectado por el VIH, que comprende las etapas de

(1) exposición del sistema inmune de cabra al VIH;

(2) purificación del anticuerpo de la cabra después de la exposición al VIH; y

(3) tratamiento de un individuo con el anticuerpo obtenido en la etapa 2 anterior.

En ensayos clínicos preliminares, basados en el producto del anticuerpo del documento WO 02/07760, se han tratado con éxito pacientes con VIH usando suero de una cabra después de la exposición al VIH.

Preferentemente, el tratamiento emplea una composición sérica que puede obtenerse mediante un procedimiento que implica inducir anticuerpos eficaces en una cabra, extraer sangre de la cabra, demostrar la capacidad neutralizante del VIH en la sangre extraída, retirar sólidos de la sangre, precipitar los sólidos usando sulfato de amonio u otro agente de precipitación adecuado supersaturado, separar el precipitado, disolver el precipitado en un medio acuoso adecuado y dializar la solución con un límite de 5 a 50.000 Daltons, preferentemente de 7 a 30.000 Daltons, más preferentemente de 8500 a 15.000 Daltons, en especial, aproximadamente 10.000 Daltons. El procedimiento de inmunización de la cabra puede ser por administración intramuscular pero también pueden usarse otras técnicas convencionales tales como la administración subcutánea o intradérmica. El procedimiento de purificación también puede completarse mediante otros procedimientos de acción de fraccionamiento comúnmente usados (ácido caprílico por ejemplo) siempre que se use el residuo total.

Más particularmente, el tratamiento emplea típicamente un suero de cabra obtenido de la siguiente manera. Ejemplo de Producción de Suero de Cabra

Por inyección intramuscular, se inoculó en una cabra virus VIH-3b lisados, suspendidos en un sobrenadante comercial normal, usando una inyección intramuscular de VIH-3b a una concentración de 109 partículas virales por ml. Previamente, el virus se destruyó por calor a 60ºC durante 30 minutos. Después de un intervalo apropiado, tal como dos semanas, se extrajeron muestras de sangre para una valoración inicial. En el procedimiento optimizado, la cabra recibió una inyección semanal durante cuatro semanas, seis semanas después se extrajo sangre del animal para obtener el reactivo.

Se extrajeron aproximadamente 400 cc de sangre de la cabra mediante técnicas estériles. El área de extracción con aguja se rasuró y se preparó con betadina. Se usó una aguja del calibre 18 para extraer aproximadamente 400 cc de sangre del animal. Cabe destacar, que el animal puede tolerar una extracción de sangre de aproximadamente 400 cc sin que el animal sufra ningún efecto adverso. El animal no tiene que sacrificarse. Después, puede extraerse sangre del animal en aproximadamente 10 a 14 días, después de que éste

recupere su volumen de sangre.

Se confirmó la presencia de anticuerpos posiblemente útiles. Después, una vez confirmada la presencia de dichos reactivos, a las 4-6 semanas se extrajo sangre de la cabra y se centrifugó para separar el suero. Después, para retirar coágulos grandes y materia particulada, se filtraron 300 ml de suero. Después, el suero se trató con sulfato de amonio supersaturado (solución al 45% a temperatura ambiente) para la precipitación de anticuerpos y otros materiales. La solución resultante se centrifugó a 5000 rpm durante cinco minutos, después de los cuales, se retiró el líquido sobrenadante. La inmunoglobulina precipitada se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (‘tampón PBS', véase Sambrook y col. ‘Molecular cloning, A Laboratory Manual', 1989) lo suficiente para redisolver el precipitado.

Después la solución se dializó a través de una membrana con un límite de peso molecular de 10.000 Daltons. La diálisis se realizó en tampón PBS, cambiado cada cuatro horas durante un período de 24 horas. La diálisis se realizó a 4ºC.

Después de 24 horas de diálisis, los contenidos de la bolsa de diálisis se vaciaron en un vaso de precipitado estéril. La solución se ajustó de manera que la masa por unidad de volumen = 10 mg por ml. La dilución se realizó usando PBS. Después, la solución resultante se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros en un recipiente estéril. Después de la filtración, la solución se dividió en alícuotas, en dosis individuales de 1 ml y se conservaron a -22ºC antes de su uso.

El reactivo está, por tanto, preparado para su uso.

En este procedimiento pueden realizarse cambios, tales como, por ejemplo, variando la concentración del sulfato de amonio o cambiándolo por otros reactivos. De manera similar, no es necesario que el peso molecular límite de la diálisis sea de 10.000 Daltons. LA INVENCIÓN

Como parte de los tratamientos que usan el suero de cabra, se observó que había otros resultados beneficiosos.

Los hallazgos de una mejora clínica significativa, en pacientes infectados por VIH, así como en los pacientes con diversas afecciones, tales como esclerosis múltiple y algunos cánceres tienen la posible interconexión de que todas estas enfermedades están en estados inflamatorios crónicos.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de un anticuerpo policlonal de cabra anti-ALH de clase II, como se describe en la reivindicación 1.

Para sorpresa de los inventores, éstos pudieron demostrar fácilmente que las cabras inmunizadas con VIH producen suero que puede desactivar el ensayo de respuesta de linfocitos mixtos, que es uno de los ensayos de activación clásicos usados in vitro. Pensando que esto podría ser alguna propiedad inherente del suero de cabra, los inventores quedaron impresionados cuando los sueros de cabras, que no habían recibido inyección, no tuvieron ninguna actividad en estos ensayos.

Los inventores también demostraron que esta actividad está estrechamente asociada con la actividad contra anticuerpos de ALH de clase II. Los inventores desconocen si esto representa una respuesta de mimetismo molecular o si la cabra detecta el ALH de clase II que lleva el virus cuando aparece y se desprende de las células infectadas, o que dicho ALH (moléculas del CMH) se desprende por separado del virus pero se co-purifica de manera que también se producen anticuerpos contra dichos componentes de la membrana celular. De hecho, no ha pasado desapercibido para los inventores que en la preparación e inducción de respuestas de anticuerpo que están modulando el efecto terapéutico beneficioso también pueden estar otras moléculas de la membrana celular, tales como receptores de quimiocinas y moléculas relacionadas. Sin embargo, si esto es así, parece que la respuesta anti-ALH II es muy dominante y los inventores piensan que puede desempeñar un papel significativo, pero no necesariamente aislado, con respecto a la inducción de las respuestas anti-inflamatorias observadas.

Con las elevadas titulaciones de anticuerpos contra el ALH, tanto de clase II como de clase I en los sueros, los que tienen los mayores niveles de anticuerpos son los que mejor desactivan las respuestas de linfocitos mixtos y parecen tener la mejor eficacia en la situación clínica.

Los inventores observaron, con sorpresa, que los anticuerpos contra FAS, un ligando principal de apoptosis, tenían un nivel extremadamente alto. De hecho se correlacionaron con los anticuerpos del CMH de clase II. Sin desear quedar ligado a teoría alguna; los inventores crearon la hipótesis de que anticuerpos con titulación elevada contra FAS podrían conducir a apoptosis inmediata a escasos minutos de la adhesión del anticuerpo al antígeno FAS y las células podrían destruirse. Esto podría conducir a la inhibición de las quimiocinas tóxicas, que se piensa que están implicadas en la discapacidad de la EM.

El uso principal de la presente invención es el uso de un anticuerpo policlonal de cabra anti-ALH de clase II, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades con niveles inadecuadamente altos de ALH. Éstas son esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes y lesión axonal o nerviosa.

Las mejoras observadas en la función nerviosa en las personas con lesiones traumáticas en nervios sugieren una propiedad del factor de crecimiento neuronal y por lo tanto éste puede usarse para traumatismos, lesiones post-infecciosas, por ejemplo, guillian-barre, lesiones de malignidad, etc., neuropatías asociadas con diabetes, alcoholismo, envenenamiento con metales u otras toxinas, etc.

Empleando como inmunógeno una selección de antígenos, preferentemente un cóctel de antígenos, pueden inducirse anticuerpos adecuados. Es posible que el uso de una serie de antígenos diferentes den lugar a anticuerpos que reconozcan estructuras comunes de los antígenos proporcionando una fuerte respuesta en el paciente. Los inventores crearon la hipótesis de que una selección de aislados del VIH proporcionará epítopes con pequeñas variaciones en la estructura, y dará como resultado un pan-anticuerpo.

Por lo tanto, para generar el suero, se prefiere emplear un cóctel de diferentes virus VIH, producidos principalmente en las CMSP, en lugar de usar sólo linfocitos T. El cóctel contiene adecuadamente 2, 3, 4, 5, 6 o más de estos virus. Los virus están preferentemente en forma de lisados. Los ejemplos de lisados preferidos incluyen los siguientes aislados de VIH-I: 91US056, 92HT593, 92US723, 92US657, 92US660 y 92US714. Preferentemente el cóctel incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5 o los 6 de estos aislados particulares.

La activación de las células, por ejemplo con Concanavalina A, puede ofrecer ventajas y, por ejemplo, pueden conseguirse mayores niveles de actividad anti-dopamina usando Con

A. SHULA (no activado) no tuvo un aumento significativo en los niveles de anti-R dopamina por encima de los niveles basales en D.O. Sin embargo, el VIH 3B (promedio de 12 cabras y conejos) sí. También hubo un aumento en los niveles del R de Dopamina entre las células CMSP activadas con Con A en el cóctel.

Dichos anticuerpos también pueden obtenerse usando proteínas que contienen los péptidos aislados de lisados del VIH, péptidos sintéticos. Pueden obtenerse y ensayarse anticuerpos para lisar.

Quedar ligado a la teoría actual de los inventores, parece que el anticuerpo de la presente invención actúa suprimiendo la proliferación celular del tipo que necesita VIH u otras condiciones que dependen de dicha respuesta inmune. Por lo tanto, la presente invención encuentra aplicación, por ejemplo, en el tratamiento de esclerosis múltiple.

Conociendo ahora el significado de la actividad anti-ALH II del anticuerpo del suero de cabra, ahora es posible evaluar la probable utilidad de una serie de dichos sueros de cabra. Un ensayo simple puede evaluar la presencia de actividad anti-ALH II y permitir la identificación de un suero candidato apropiado para la administración en pacientes.

Basándose en la capacidad del suero para inhibir drásticamente la RLM, se sugiere que este suero pueda actuar como un fuerte agente anti-inflamatorio. Existen diversos mecanismos mediante los cuales esto podría efectuarse y la inhibición del reconocimiento del ALH es uno de los más probables.

Otro mecanismo de acción bien puede deberse al hecho de que el complemento esté implicado en la actividad de este plasma de cabra, ya que esta es la única actividad que se sabe que se previene por tratamiento térmico. El complemento bien puede permitir que estén activos los mecanismos defectores debilitados de los pacientes. Por ejemplo; tanto la destrucción de células tumorales y de virus a los que se dirigen anticuerpos como la destrucción dirigida por anticuerpos mediada por células requieren el complemento y existe una total ausencia de efecto o mecanismo en ausencia de complemento.

En general, la inyección en seres humanos, de anticuerpos derivados de un huésped no humano está contraindicada. Normalmente se crea una fuerte respuesta inmune contra los mismos anticuerpos extraños. Sin embargo, de manera sorprendente, se ha descubierto que el uso de extracto de suero de cabra no provoca las reacciones inmunes que se preveían con otras proteínas animales extrañas. Los pacientes inmunosuprimidos y los individuos normales toleran la inyección de extracto de suero de cabra.

Un virus destruido se inyecta en una cabra específicamente identificada, por inyección intramuscular y se deja incubar, posteriormente se extrae una cantidad medida de sangre y se modifica de manera conveniente.

El suero se ensaya opcionalmente para determinar la actividad del anticuerpo deseado y, opcionalmente una o más de capacidad anti-fusión, neutralización del virus del SIDA, su capacidad para potenciar la fagocitosis y su aceptabilidad en el cuerpo humano.

Después de inocular el virus VIH a una cabra seleccionada, se detectó una respuesta inmune después de exponerse a un antígeno proteico extraño, de acuerdo con estudios anteriores. Después, el suero extraído se modificó adicionalmente para prepararlo para su uso en seres humanos.

Aproximadamente doscientas personas de 10 años de edad y mayores, de ambos sexos, se han tratado satisfactoriamente con la medicación, y ninguna de ellas ha mostrado recaídas o ha sufrido efectos secundarios.

El tratamiento se proporciona por medio de una inyección subcutánea, en cantidades que varían entre 1/10 y 10 cc y se diseña para suministrar la medicación lo más rápidamente posible al sistema linfático. Habitualmente, la dosis preferida para un paciente con VIH, es de 1 ml por semana o según se requiera, proporcionada como una dosis dividida en los dos brazos. La administración cada 2 ó 3 semanas es típica, después cada 3 meses. Para pacientes que padecen cáncer, parece mejor 0,3 ml por semana.

En la mayoría de los casos, el tratamiento se ha realizado una vez cada cuatro semanas durante un período de tres meses. A continuación se indican observaciones generales de los mismos:

1. En menos de sesenta minutos, después de la inyección, se invirtió una depresión de moderada a severa.

2. Generalmente, en las dos horas siguientes a la inyección, los pacientes recuperaron su apetito y buscaron activamente alimento.

3. Aproximadamente a las dos semanas del primer tratamiento los pacientes comenzaron a ganar peso.

4. Informes independientes de laboratorio confirmaron que, de 4 a 6 semanas después del primer tratamiento, las cargas virales y los valores de P24 disminuyeron sustancialmente y que las células CD4 y CD8 aumentaron drásticamente.

5. No se observaron efectos secundarios.

Es importante tener en cuenta que, a diferencia de los tratamientos actuales, la presente medicación no requiere que el paciente mantenga un régimen horario o diario estricto y depende de una simple inyección que se administra semanal o mensualmente.

Preferentemente, la composición se purifica y esencialmente solo consiste en un extracto de suero purificado. En una variación adicional, los anticuerpos también pueden purificarse en su totalidad o seleccionarse y agruparse de acuerdo con una necesidad específica de la enfermedad a partir de la mezcla compleja de suero o plasma mediante un procedimiento convencional o cualquier otro adecuado, incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, precipitación salina, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por tamaño, cromatografía de afinidad, en combinación según sea apropiado o se desee.

Normalmente, se emplea una dosis de ensayo para observar si la persona desarrolla una reacción alérgica contra el suero de cabra hiper-inmune. Después de una inyección intradérmica, se esperan 30 minutos para observar si existe una reacción intermedia que se manifiesta como edema, eritema y picor. Si esta reacción es negativa, se supone entonces que lo más probable es que se produzca una reacción de sensibilidad inmediata. Sin embargo, una reacción alérgica no excluye a la persona de recibir un tratamiento que podría salvarle la vida debido a una posible reacción alérgica.

La administración de la composición de la invención puede ser por cualquier procedimiento adecuado tal como por infusión intravenosa, subcutáneamente, inyección intramuscular, preparación oral, administración intraperitoneal e intravenosa. La dosificación correcta variará de acuerdo con la formulación particular, el modo y el sitio de aplicación particular, el huésped y la afección a tratar. Se tendrán en cuenta otros factores como la edad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, afección del huésped, combinaciones de fármacos, sensibilidad frente a la reacción y la gravedad de la enfermedad. La administración puede realizarse continua o periódicamente dentro de la dosis máxima tolerada.

A diferencia de la mayoría del resto de tratamientos, este producto no necesita que el paciente mantenga un régimen horario o diario estricto para tomar la pastilla y depende de la administración de una simple inyección periódica. El sistema inmune de los pacientes que se trataron hace más de dos años y que habían permanecido en el proyecto, parece haberse estabilizado y haber vuelto a niveles operativos normales.

A diferencia de los fármacos existentes, que a menudo necesitan tomar diariamente los pacientes durante el resto de su vida, un tratamiento típico depende de una simple inyección que administrará un médico semanal o mensualmente. Un programa de tratamiento normal es de tres meses de duración, con un procedimiento de continuación previsto a los seis meses, doce meses y dos años o según sea necesario si el virus reaparece.

La composición de la presente invención puede usarse con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o proporcionarse como una composición individual para la administración al mismo tiempo.

Preferentemente, la composición de la presente invención se trata mediante uno o todos de los siguientes: precipitación con sulfato de amonio al 45%, congelación a -70ºC durante 24 horas o microfiltración.

La recuperación observada en la mayoría de los pacientes con EM, junto con el estado de ánimo elevado indicado a la hora de recibir el tratamiento, ha impulsado también a los inventores a investigar la actividad contra receptores en el SNC que puedan estar implicados en estimulación nerviosa y posible regeneración. Los inventores han explorado diversos sueros para determinar la actividad contra una serie de antígenos y han observado actividad contra el receptor de dopamina, el receptor de serotonina, el receptor del factor del crecimiento nervioso p75 y la quimiocina CXCL 10 (IP10).

Conociendo ahora el significado de la actividad del anticuerpo del suero de cabra contra el receptor de dopamina, el receptor de serotonina, el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 o la quimiocina CXCL10, es posible ahora evaluar la probable utilidad de una serie de dichos sueros de cabra. Un ensayo simple puede evaluar la presencia dicha actividad y permitir la identificación del suero candidato conveniente para administrar a pacientes. En particular, la combinación de anticuerpos anti-FAS y/o anti-ALH puede ser importante, junto con anticuerpos contra uno o más de receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor del factor de crecimiento nervioso p75 o quimiocina CXCL10 y por lo tanto, para garantizar su presencia en el producto, podrían dirigirse ensayos contra diversas actividades de anticuerpos.

FIGURAS

Las figuras 1 a 9 se refieren a la determinación de la presencia de anticuerpos anti-ALH de

clase II;

las figuras 10 a 16 se refieren a estudios de RLM;

las figuras 7 a 19 se refieren a la determinación de la presencia de anticuerpos anti-FAS;

las figuras 20 a 29 se refieren a la determinación de la presencia de anticuerpos

adicionales; y

la figura 30 proporciona perfiles para sueros de cabras inmunizadas con diferentes

inmunógenos. EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Los siguientes detalles representan el procedimiento actual de los inventores para la preparación del producto de anticuerpo. Ejemplo de Producción de Suero de Cabra

Por inyección intramuscular se inoculó a una cabra un cóctel viral del VIH lisado y formulado con adyuvante de Freund. Previamente el virus se destruyó por calor a 60ºC durante 30 minutos. Después de un intervalo apropiado, se extrajeron muestras de sangre, tal como dos semanas, para una valoración inicial. En el procedimiento optimizado, la cabra recibió una inyección semanal durante cuatro semanas, seis semanas después se extrajo de nuevo sangre del animal para obtener el reactivo.

Mediante técnicas estériles, se extrajeron, aproximadamente, 400 cc de sangre de la cabra. Para la extracción con aguja, se rasuró el área y se preparó con betadine. Se usó una aguja de calibre 18 para extraer aproximadamente 400 cc de sangre del animal. Cabe destacar que el animal puede tolerar una extracción de sangre de aproximadamente 400 cc sin que el animal sufra ningún efecto adverso. El animal no tiene que sacrificarse. Después, se puede volver a extraer sangre del animal, aproximadamente en 10 a 14 días, después de que este recupere su volumen de sangre.

Se confirmó la presencia de anticuerpos posiblemente útiles, teniendo en cuenta la actividad del anticuerpo deseado. Una vez confirmada la presencia de dichos reactivos, entonces se extrajo sangre de la cabra a las 4-6 semanas aproximadamente.

Después, para crear el reactivo, el producto basado, en sangre se centrifugó para separar el suero. A continuación, se filtraron 300 ml de suero para eliminar coágulos grandes y materia particulada. Después el suero se trató con sulfato de amonio supersaturado (solución al 45% a temperatura ambiente), para precipitar anticuerpos y otro material. La solución resultante se centrifugó a 5000 rpm durante cinco minutos, después de los cuales se retiró el líquido sobrenadante. La inmunoglobulina resultante se re-suspendió en suficiente solución

salina tamponada con fosfato (‘tampón PBS', véase Sambrook y col. ‘Molecular cloning, A Laboratory Manual', 1989) para re-disolver el precipitado. Después la solución se dializó a través de una membrana con un límite de peso molecular de 10.000 Daltons. La diálisis se realizó en tampón PBS, se cambió cada cuatro 5 horas durante un período de 24 horas. La diálisis se realizó a 4ºC.

Después de 24 horas de diálisis los contenidos de la bolsa de diálisis se vaciaron en un vaso de precipitado estéril. La solución se ajustó de manera que la masa por unidad de volumen = 10 mg por ml. La dilución se realizó usando PBS. Después, la solución resultante se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros en un recipiente estéril. Después de la filtración, la solución se dividió en alícuotas, en dosis individuales de 1 ml y se conservaron a -22ºC antes de su uso.

De esta manera el reactivo está preparado para su uso. Conversión de Plasma a Suero: Materiales:

Reactivo Fórmula Calidad Cantidad Necesaria por litro de agua Cloruro de sodio NaCl USP/EP/BP 8,76 g Ortofosfato di-ácido de sodio NaH2PO4 USP/EP/BP 0,2 g Ortofosfato ácido de disodio Na2HPO4 USP/EP/BP 1,55 g Sulfato de dextrano Sal de sodio, peso molecular 500.000 100 g Agua para irrigación N/D Baxter 1 litro Duran esterilizado 1 x 150 ml N/D N/D N/D Duran esterilizado 2 x 2 litros N/D N/D N/D Placa agitadora magnética y pulga magnética esterilizada N/D N/D N/D 1 filtro Sartolab o Midisart N/D 0,2 µm N/D 6 bolsas Stedim de 1 l 1 bolsa estéril de 100 ml N/D N/D N/D

15 Preparación de 100 mg/ml de solución de sulfato de dextrano

En 1 litro de agua, se disuelve la cantidad necesaria de cloruro de sodio, ortofosfato di-

ácido de sodio y ortofosfato de ácido de di-sodio, para fabricar 1 litro de solución salina

tamponada con fosfato (PBS).

20 Cuando está completamente disuelta se rocían lentamente 10 g de sulfato de dextrano

en 100 ml de PBS agitando magnéticamente. Para la solubilización completa, se mezcla durante al menos 10 minutos. Se filtra a 0,2 µm en un envase estéril (por ejemplo una bolsa de 100 ml) y, si no se necesita para su uso inmediato, se conserva a temperatura ambiente. Esta es la solución madre de sulfato de dextrano.

5 Conversión de plasma en suero Se pesa el volumen de plasma necesario para tratarse usando un factor de conversión de 1,0275, es decir 1000 ml pesan 1027,5 g. A cada 1000 ml de plasma (concentración final de 1 mg/ml), se añaden 10 ml de la solución madre de sulfato de dextrano. 10 Se agita magnéticamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se transfiere a bolsas Stedim de 1 litro. Se centrifuga a 4000 – 4200 rpm (fuerza centrífuga relativa = 4910 g) durante un mínimo de 30 minutos a 22ºC. El sobrenadante se aspira cuidadosamente dentro de una bolsa Stedim de 1 l y se

15 desecha el precipitado. Se tara el número necesario de bolsas Stedim de 1 l. Se filtra el sobrenadante a 0,2 µm dentro de bolsas Stedim de 1 l. Cada bolsa contiene

aproximadamente 500 ml del sobrenadante filtrado. En cada bolsa se registra el volumen de suero. Cada bolsa se numera y se identifica.

20 Si el suero no va a procesare inmediatamente se conserva enfriado a 4 – 8ºC durante periodos de hasta 7 días o a -20ºC para periodos más largos. Preparación de Sulfato de Sodio al 36% en p/v Materiales:

Reactivo Fórmula Calidad Cantidad Necesaria por litro de agua Sulfato de sodio anhidro USP/EP/BP 360 g Agua para irrigación N/D Baxter 1,5 litros Duran esterilizado 1 x 2 litros N/D N/D N/D Placa agitadora magnética y pulga magnética esterilizada N/D N/D N/D 1 filtro Sartolab o Midisart N/D 0,2 µm N/D 2 bolsas Stedim 1 l N/D N/D N/D

Se pesan 1,5 litros de agua (se supone que 1 ml = 1 gramo) dentro del Duran esterilizado

de 2 l.

Se calienta agua a 30-35ºC colocando el Duran en una incubadora pre-calentada durante

al menos 1 hora. Se introduce una pulga magnética estéril y se coloca en el agitador magnético. Lentamente, agitando, se añaden los 360 g de sulfato de sodio.

5 La agitación se mantiene hasta que la sal esté completamente disuelta y la solución sea transparente. Si la solución no está lo suficientemente caliente o se deja enfriar, la sal comenzará a cristalizar la solución. La sal se puede volver a re-solubilizar calentado la solución a 50ºC. Se filtra 1 litro de la solución de sulfato de sodio al 36% p/v a 0,2 µm en una bolsa Stedim 10 de 1 litro. Se etiqueta la bolsa de manera conveniente. Se filtran los 500 ml restantes dentro de una bolsa Stedim distinta. Se añaden 500 ml más

de agua para inyección por filtración y se etiqueta esta bolsa como sulfato de sodio al 18% p/v. Precipitación de Inmunoglobulinas de Suero usando Sulfato de Sodio. Observación. Antes del tratamiento con sulfato de sodio, el plasma debe desfibrinarse por

15 el procedimiento de sulfato de dextrano.

Materiales:

Reactivo Fórmula Calidad Cantidad Suero filtrado 1 litro Solución de sulfato de sodio al 36% N/D 1,5 litros Solución de sulfato de sodio al 18% N/D 1 litro Solución salina tamponada con fosfato N/D 2 litros Agua para irrigación N/D Baxter N/D Filtro de profundidad N/D N/D N/D Filtro de 0,2 µm N/D 0,2 µm N/D Bolsa Stedim para diafiltración N/D N/D N/D

Se calienta el suero filtrado en las bolsas Stedim usando la incubadora ajustada a 3020 35ºC. Se toman 2 x 5 ml muestras. Al suero en las bolsas, se le añade un volumen equivalente de la solución de sulfato de sodio al 36% calentada, por ejemplo 500 ml de solución salina: 500 ml de suero. La mezcla de sal : suero (solución blanca de color crema), se mezcla cuidadosamente agitando las bolsas manualmente o colocándolas en una placa basculante. Se mezcla durante 25 30 minutos. Las bolsas se pesan y se equilibran y se centrifugan a 4000 – 4200 rpm durante un

mínimo de 30 minutos a 25-30ºC.

Cuidadosamente se aspira el sobrenadante para desecharlo. Debe tratarse de no alterar el precipitado. Se toma una muestra del sobrenadante 1 x 5 ml.

A cada bolsa de precipitado se le añade un volumen suficiente de sulfato de sodio al 18% p/v para hacer que el peso de cada bolsa sea aproximadamente de 1000 g.

Manualmente o mediante una placa basculante, se mezcla durante un mínimo de 10 minutos, para retirar por lavado la albúmina atrapada en el precipitado de inmunoglobulina.

Las bolsas se transfieren a la centrífuga y se repite la centrifugación como se ha indicado anteriormente.

Cuidadosamente se aspira el sobrenadante para desecharlo. Debe tratarse de no alterar el precipitado.

A cada bolsa de precipitado, se le añade un volumen suficiente de la solución salina tamponada con fosfato, para hacer que el peso de cada bolsa sea aproximadamente de 1000

g. Manualmente o mediante una placa basculante, se mezcla durante un mínimo de 10 minutos y las bolsas se transfieren a refrigeración para conservar durante una noche. Las bolsas se retiran de la conservación y se comprueba que el precipitado se ha re

solubilizado.

Se filtra a 0,2 um dentro de una bolsa de diafiltración del tamaño adecuado.

Se toman muestras de 2 x 5 ml. Formulación a Granel de la Solución de Inmunoglobulina

El dispositivo de ultrafiltración (UF) se prepara con al menos una membrana de un LPM de 30.000 de 0,1 m2

El sistema se desinfecta por recirculación de una solución de hidróxido de sodio 0,5 M – 1 M durante un mínimo de 30 minutos.

El sistema de la solución de hidróxido de sodio se drena y se lava abundantemente con agua para irrigación hasta que el pH del agua sea neutro.

La bolsa de diafiltración, que contiene la solución de inmunoglobulina, se conecta al UF.

A la bolsa de diafiltración, se la conecta una bolsa que contiene PBS (10 x el volumen de la solución de inmunoglobulina) mediante una bomba peristáltica.

A la bolsa de diafiltración se conecta la línea de material retenido.

A la bolsa residual se conecta la línea de material diafiltrado.

Se procesa lentamente el producto a través del dispositivo de ultrafiltración, ajustando

las presiones de entrada y de salida a 2,0 bar de entrada y 0,5 bar de salida, usando los ajustes de velocidad y válvula de la bomba.

Se concentra la solución de inmunoglobulina a aproximadamente 50 g/l. Esto se calcula teniendo en cuenta la concentración de partida y midiendo la cantidad de líquido eliminado. Por ejemplo:

La solución de partida es de 2 litros a 25 g/l = 50 g. El volumen de solución eliminada en el diafiltrado es de 1 litro. Por lo tanto la concentración es 50/1 = 50 g/l.

El caudal de diafiltrado se mide y, para igualar este caudal, se ajusta la velocidad de la bomba de la bolsa que contiene el PBS.

La diafiltración continúa hasta haber intercambiado 10 volúmenes de tampón, es decir, 1 litro de solución de IgG necesita 10 litros de PBS.

El sistema de la solución de IgG diafiltrada concentrada se drena dentro de la bolsa de diafiltración. La bolsa se desconecta y la bolsa de PBS, que contiene al menos 1 litro de PBS, se conecta directamente al sistema.

Se vuelve a hacer circular la solución de aclarado de PBS y este aclarado se recupera dentro de la bolsa que contiene la solución de IgG.

La solución de IgG, formulada a granel, se filtra a 0,2 µm dentro de una bolsa Stedim previamente pesada.

Cuando se ha terminado, se toma una muestra de 1 ml de la solución filtrada y se evalúa para determinar la concentración de proteína.

La bolsa se pesa y se calcula el volumen de la solución de IgG.

Usando la concentración de proteína y el volumen de IgG se calcula el volumen de PBS necesario para diluir la solución a una concentración final de 10 mg/ml, por ejemplo:

Volumen de IgG = 1300 ml. Concentración de proteína = 30 mg/ml

Cantidad total de IgG = 39.000 mg

Requisito = concentración final 10 mg/ml

Por lo tanto, volumen final necesario = 39.000/10 = 3900 ml. El volumen actual es de 1300 ml. Por lo tanto el volumen de PBS que se necesita añadir es 3900 -1300 = 2600 ml.

Para conseguir el volumen necesario final a 10 mg/ml., el PBS se filtra dentro de la bolsa que contiene la solución de IgG formulada a granel.

El reactivo está preparado para su uso y puede conservarse enfriado hasta 1 semana,

o congelado a -20ºC para necesidades de conservación superiores.

En esos procedimientos pueden realizarse cambios, tales como, por ejemplo, variar la concentración del sulfato de sodio o cambiar sus reactivos. De manera similar, no es necesario que el límite de la diálisis sea de 10.000 Daltons. Modo de Actividad Introducción

Observaciones confidenciales indican que los pacientes con suero infectado con SIDA procedente de cabras inmunizadas con el VIH parecen mejorar, aparentemente de forma drástica en algunos casos, y los inventores investigan un posible mecanismo. Aunque el VIH se inyectó en las cabras y se piensa que la respuesta inmune es muy específica, esta base no explica el beneficio observado para los pacientes con esclerosis múltiple. Bases Científicas del Estudio

Aunque Dalgleish y colegas habían descubierto, hace varios años, el receptor de CD4 como el portal de entrada del VIH, la interpretación clásica de que células CD4 destruyen el VIH, lo que disminuye sensiblemente según progresa la infección hacia el SIDA, no era una explicación adecuada de la patogénesis. Las principales observaciones que no encajan bien con esta interpretación incluyen:

(1) El largo periodo de tiempo desde la infección hasta la aparición del SIDA (aproximadamente una década)

(2) La ausencia de enfermedad en casi todos los chimpancés y en aproximadamente el 5% de personas infectadas por el VIH. Los chimpancés tienen los mismos receptores y coreceptores que los seres humanos y el virus puede detectarse fácilmente en chimpancés infectados cuyo recuento de CD4 no disminuye.

Basándose en estas observaciones, los investigadores han pretendido definir las diferencias entre los individuos que desarrollan la enfermedad después de la infección y los que no. El principal pronóstico de la enfermedad es el grado de activación inmune después de la infección inicial y el nivel al cual este persiste. En otras palabras, a mayor activación inmune, menor tiempo para desarrollar la enfermedad. Un grado de activación moderado podría conducir a un tiempo más prolongado antes de desarrollar el SIDA y una ausencia de activación inmune, incluso con replicación del virus, que es la norma en chimpancés y raro en personas.

Es importante indicar esto, ya que el término “activación inmune”, en este contexto, significa activación pan inmune, es decir, todos los aspectos del sistema inmune están activados, lo que incluye todos los subgrupos de linfocitos T así como de células B. Sólo existen tres causas reconocidas de activación pan-inmune.

La primera de éstas es la hiper-variabilidad en el antígeno que presenta claramente el VIH, sin embargo la hiper-variabilidad se detecta en personas y en chimpancés infectados que no progresan.

La segunda posibilidad es un súper antígeno, que desvía el mecanismo específico de antígenos y causa activación de todo el sistema inmune. A pesar de un entusiasmo inicial hace una década, no se ha observado ningún súper antígeno convincente, asociado al VIH, que explique estos hallazgos. Westby y Dalgleish mostraron que la variabilidad del repertorio de linfocitos T, que había sugerido la posibilidad de un súper antígeno, era exclusivamente como un resultado de la disminución en la población de CD4 y las diferencias podrían explicarse por destrucción al azar de CD4.

La única otra explicación es que el cuerpo ha detectado una célula u órgano extraño y ha creado una respuesta crónica contra este. Clínicamente esto ocurre con frecuencia después de un trasplante y en particular en trasplantes de médula ósea y se conoce como enfermedad crónica de injerto contra huésped (ICH). En este caso, incluso la supervivencia de algunas células extrañas es suficiente para activar todo el sistema inmune conduciendo a respuestas auto-inmunes agresivas similares a las observadas en pacientes infectados por el VIH. Las características clínicas de esta enfermedad son tan extraordinariamente similares a las del SIDA que antes del descubrimiento del virus, un destacado inmunólogo de Estados Unidos, Gene Shearer del NIH (Estados Unidos), sugirió que la enfermedad podría inducirse por células extrañas transmitidas por transfusiones sanguíneas o relaciones sexuales. El descubrimiento del virus, a los pocos meses y la transmisión por el Factor VIII (un producto acelular) condujo a ignorar la importancia de esta observación.

La ausencia de otra explicación para la pan-activación condujo a Dalgleish y Habeshaw a buscar pruebas de que el virus podría imitar al ALH de Clase I o de Clase II (que son las moléculas que determinan antígenos propios y presentes). Aunque ya se habían publicado algunas secuencias de GP120 con menor homología con ALH, los inventores pudieron identificar una región principal de la envuelta del VIH (GP120) que tenía marcada homología estructural con el ALH de Clase I y II. Elizabeth Hounsell (MRC) pudo crear un modelo de GP120 basándose en las moléculas del ALH cuya estructura se conocía con detalle. Basándose en estas moléculas y secuencias, Habeshaw y Hounsell predijeron que el virus podía detectarse como "extraño" por personas con ALH-B8 y también como “propio” por personas con ALH-B27. Actualmente es una cuestión de hechos publicados que las únicas diferencias significativas del ALH en un estudio de marcador de ALH pan-VIH realizado en el RU por el MRC son que las personas con ALH-B8 desarrollan la enfermedad a un ritmo mucho más rápido que el resto de la población y que los que no progresan a largo plazo o que progresan de manera extremadamente lenta son ALH-B27.

Trabajos posteriores han demostrado que:

(1) Los linfocitos T citolíticos creados como respuesta a una exposición a células extrañas (es decir diferentes tipos de ALH) también destruirán células propias infectadas por el VIH.

(2) Que la envuelta viral del VIH conocida como GP120 (que según los inventores tiene homología estructural con las moléculas del ALH que se determinan lo propio), puede

unirse a péptidos de una manera muy similar al ALH. Además, linfocitos T inducidos contra los péptidos y el ALH que imitan a la GP120 también responderán a la GP120 con el péptido pero no a la GP120 sin el péptido lo que sugiere que la capacidad de unirse a péptidos puede ser muy importante en esta confirmación y por lo tanto la capacidad para producir activación inmune crónica en sujetos susceptibles.

(3) Más recientemente los inventores han demostrado que la región en la que los péptidos se unen al ALH está presente en la GP120 y que, si se elimina esta parte de la molécula, como amablemente realizó el Profesor Sodroski en el Dana Faber en Boston, los péptidos ya no se unirán.

El impacto de las observaciones anteriores sugiere que la activación inmune del sistema podría, en teoría, cambiarse y que por lo tanto la enfermedad podría no progresar. En este sentido existen dos observaciones principales, una de las cuales fue un estudio clínico como resultado de esta ciencia en la que pacientes que ya no podían tomar AZT, debido a una insuficiencia medular, tomaron esteroides, un agente anti-inflamatorio clásico muy impactante que no puede tomarse durante largos periodos sin efectos secundarios significativos. Los inventores pudieron observar una notable mejoría de pacientes muy enfermos, con características clásicas muy parecidas a la enfermedad del ICH, con esteroides y pudieron demostrar que la dosis necesaria para ejercer este efecto era extremadamente alta y no una propuesta práctica a largo plazo. Más recientemente un grupo de la Universidad de Duke (Estados Unidos) había demostrado que la carga viral descendía en pacientes a los que se administró esteroides para el VIH lo que actualmente se está realizando cada vez más para combatir lo que se considera como autoinmunidad (una característica clásica de la enfermedad crónica de injerto contra huésped). Resumiendo, existe una base científica de que un agente inflamatorio que actúa particularmente sobre las rutas inducidas por el ALH de clase I y de clase II podía ser beneficioso en la infección por el VIH. Ensayos y Resultados

Para observar si los sueros de cabra tenían cualquiera de las propiedades inflamatorias, los inventores añadieron estos a las reacciones formadas mezclando las células de dos individuos diferentes con diferentes fondos genéticos. Para la sorpresa de los inventores esto fue extremadamente eficaz inhibiendo esta reacción. Usando una gran cantidad de anticuerpos moleculares, los inventores pudieron observar que el único anticuerpo que estuvo cerca de la reactividad de la cabra era un anti ALH de clase II. Los anticuerpos anticlase I redujeron sólo parcialmente esta reacción. De mayor interés es que los anticuerpos contra el bucle V3 del VIH, considerados por la mayoría de la comunidad científica como la diana principal para una vacuna, en realidad hacen que esta pan-activación empeore. Este descubrimiento podría encajar con la teoría de activación inmune, ya que la respuesta inmune contra el virus proporciona en realidad crecimiento y estímulo para que el virus “salga” y esto podría explicar por qué las vacunas dirigidas a esta región son tan ineficaces.

Teniendo en cuenta que a menudo se han atribuido propiedades mágicas a las cabras y que los sueros de otros animales pueden tener actividad inesperada en ensayos específicos, los inventores obtuvieron sueros de cabras no vacunadas que no tenían nada de actividad. Después, los inventores obtuvieron adicionalmente suero de diferentes cabras con diferentes programas de vacunación. Para la sorpresa de los inventores se pudo demostrar que estos sueros sólo detectaban envuelta del VIH y ALH de clase II. De hecho, partes más pequeñas del virus, que se sabe que tienen homología significativa para ALH, no se detectan por el suero.

Por lo tanto los inventores se sorprendieron extremadamente al observar una diferencia principal entre la inyección del cóctel y la inyección de un aislado, ya que el repertorio de regiones de HLA conservadas en la GP120 se reconoce activamente por el suero de la cabra a la cual se inyecta el cóctel.

La interpretación de estos datos se resume por el hecho de que cabras a las que se inyecta el VIH producen una fuerte respuesta de tipo anti-CMH de clase II que puede ampliarse usando diferentes aislados. A continuación se indica la posible interpretación de cómo sucede esto:

(1) La envuelta del VIH es tan similar al ALH de clase II que se reconoce por el sistema inmune de cabra que tiene un repertorio de ALH completamente diferente.

(2) La segunda posibilidad es que en el inmunógeno, es decir la preparación viral, se está recogiendo el ALH que se sitúa en la superficie de las células a través de las cuales brota el virus y que la respuesta inmune no es contra el virus sino contra el ALH co-asociado.

(3) La tercera explicación implica una combinación de las dos explicaciones anteriores. Es posible que el virus que brota se haya fusionado con el ALH según se prepara y que esta combinación se detecte fuertemente por los sueros de cabra. Una reciente publicación demuestra que, a menos que el virus brote a través de una célula con ALH e incorpore el ALH en la membrana, el virus sigue siendo no infeccioso. Esto significa que debe haber algún ALH derivado de la célula huésped para activar el mecanismo de entrada en la célula.

En este documento, los inventores han demostrado que las cabras en las que se inyectan preparaciones del VIH, producen una fuerte respuesta de anticuerpos contra la molécula de ALH de clase II. Se sabe que varias enfermedades producen lesiones inflamatorias destructoras debido simplemente a que las células implicadas sobre-expresan el ALH de clase II. Aunque muchos tipos de enfermedades autoinmunes comparten esta propiedad, uno de los ejemplos que mejor se conoce es el de la esclerosis múltiple. Por lo tanto, puede ocurrir que la respuesta inmune de la cabra rompa la tolerancia a estas moléculas y que este procedimiento pueda permitir que se produzca un fuerte proceso anti-inflamatorio in vivo que podría estar asociado con un beneficio clínico. Habrá ventajas obvias si esto ocurre durante el uso de esteroides a dosis elevadas a largo plazo cuando la administración crónica del suero de cabra no tiene efectos secundarios significativos.

La respuesta anti-VIH, que es fuertemente anti-AHL de clase II, bien puede proporcionar una conexión vital en cuanto a la verdadera necesidad de una vacuna anti-SIDA y la intención de los inventores es analizar esta respuesta para producir una vacuna candidata contra el VIH. Sueros de Cabra inmunizada con VIH-1 y propiedades anti-inflamatorias. Introducción

Se proporcionaron sueros de cabra a partir de animales inmunizados con lisado viral VIH-3B o un cóctel viral de NIH de 6 aislados diferentes de VIH-1. Algunos de los sueros se han usado previamente como parte de regímenes de tratamiento experimentales con buenos resultados, sin embargo se desconoce el mecanismo mediante el cual actúan. Para determinar un mecanismo de acción, los inventores exploraron el suero en placas ELISA contra la gp120 del VIH-1, el ALH-DR1 y péptidos seleccionados de diferentes regiones de la glicoproteína de la superficie del virus, algunos llevando homología de secuencia con respecto al ALH. Materiales y Procedimientos Suero y anticuerpos

Se proporcionaron muestras de los sueros de cabra inmunizada con el VIH-3B original que se habían usado para el tratamiento de pacientes, junto con muestras de varias cabras inmunizadas con lisado viral de VIH-3B (animales nº 0125, nº 0126, nº 0127, nº 0128, nº 0129 inmunizados el 14 de septiembre de 1999, el 21 de septiembre de 1999 y de nuevo el 29 de septiembre y el 7 de noviembre de 2000) así como información relacionada con datos de extracción de sangre e inmunización. Para el ELISA, los inventores eligieron simplemente explorar muestras de sueros tomadas de extracciones de producción en las últimas etapas (30 de noviembre de 2000 y 1 de diciembre de 2003). El animal nº 378 se inmunizó con un cóctel viral de NIH que consistía en los siguientes aislados del VIH (92HT593, 92US657, 92US660, 92US714, 92US723, 91US056). Las inmunizaciones se realizaron el 7 y el 28 de noviembre. Los sueros tomados de una extracción de producción del 25 enero de 2001 se usaron para la exploración ELISA. También se proporcionaron sueros de cabra de Control. Junto con los sueros, los inventores incluyeron ALH-DR anti-humano y ALH-DR anti-humano, DP y DQ

(Pharmingen) tanto en el estudio ELISA como en los estudios de reacción de linfocitos mixtos e IgG anti-gp 120 de ratón (EVA3047) específica para el dominio V3 del VIH-i-IIJb (IRIQRGPGR) obtenida del Dr. J Laman a través del Dr Harvey Holmes (MRC AIDS reagents programme, National Institute for Biological Standards and Control, Potter's Bar, UK) durante el estudio de RLM. Péptidos y Proteínas

Se produjo la gp120 del VIH-i IIIB recombinante en células de ovario de hámster chino y proporcionadas por el Dr. J Raina mediante el Dr Harvey Holmes en el programa de reactivos del SIDA del MRC. El ALH-DR1 recombinante era la misma proteína proporcionada por el Prof. Don C. Wiley usada durante los experimentos de unión a péptidos. En la tabla 1 se indican los péptidos del VIH-1 usados en el estudio. Los péptidos ARP7022, ARP7 10, ARP740-23, -28, 42, -44, -45, -46 y -47 se obtuvieron del Dr Harvey Holmes del programa de reactivos del SIDA del MRC. El péptido de control P12 representa una secuencia desorganizada de la región CS de la gp120 del VIH-1 y se obtuvo a través del Prof. E. F. Hoursell, School of Biological and Chemical Sciences, Birkbeck College London, UK. Los péptidos se conservaron en alícuotas a -20ºC hasta su uso. ELISA

Se realizaron ELISA siguiendo un protocolo similar al descrito por Brown y col. (J. Immunological methods 1997, 200: 79-88). Los péptidos y las proteínas se mezclaron con tampón de unión de Carbonato/Bicarbonato 0,05 M pH 9,6 a 16 µg/ml y1 µg/ml respectivamente y se aplicaron por duplicado sobre placas de Microtitulación de unión alta Immulon 4 LIBX ( Dynex Technologies, INC. 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, VA 20151-1683, USA) durante una noche a 40ºC. Los pocillos se bloquearon usando 5 mg/ml de caseína en PBS y se dejaron durante una noche a 40°C. Los sueros de cabra se diluyeron 1/500 y 1/1000 veces en PBS/Caseína al 0,25% mientras que los anticuerpos purificados se diluyeron 1/1000 y 1/3000 veces respectivamente y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS/ Tween 20 al 0,05% usando un aparato Wellwash 4 (Denley).

Los anticuerpos de cabra inmovilizados se detectaron usando IgG monoclonal de ratón Anti-Cabra/Oveja conjugada con peroxidasa, clon GT-34 (Sigma) diluida 1/1000 en PBS/Caseína al 0,25%/Tween 20 al 0,01% y anticuerpos anti-ALH detectados usando un conjugado de Peroxidasa con IgG de Cabra anti-ratón (Sigma) incubado durante 1 h a 37ºC. Después de otra ronda de lavados, en los pocillos se incubó sustrato de diclorhidrato de Ofenilendiamina recién preparado (OPD; SIGMA), a temperatura ambiente en la oscuridad y las reacciones se detuvieron a los 15 minutos, añadiendo 50 µl/pocillo de H2SO4 2,5 M. Los valores de DO se midieron a 492 nm usando un Lector de Microplaca.

Tabla 1. Péptidos Usados durante los ensayos

ARP7022: (DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC) péptido de 24 restos de una región conservada de gp41 del VHI (593-616) reconocida por la mayoría de los sueros positivos europeos y africanos del VIH. Péptido de control.

ARP710: (VKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR) péptido de 23 restos derivado del dominio C-terminal (CS) conservado de gp120 del VIH (486508) que conduce al sitio de escisión de gp120/41. Contiene homología estructural con el ALH.

ARP740/23: (RPWSTQLLLNGSLAEEEVV) péptido de 20 restos derivado de la región C2 de gp120 (252-271). Contiene homología de secuencia con la cadena β del ALH DR4.

ARP740/28: (NTRKRIRIQRGPGRAFVTIG) (302-321) péptido de 20 restos derivado del bucle V3 de gp120 del VIH

ARP740/42: (GQIRCSSNITGLLLTRDGGNS) (438-458) Contiene homología con la cadena β1 de DR.

ARP740/44: (NNESEIFRLGGGDMRDNWRS) (459-478) Contiene homología de secuencia con el ALH-A2

ARP740/45: (GQDMRDMWRSELYKYKWKI) (469-488) Secuencia reconocida por M38, un anticuerpo que reacciona en cruzado con la región del ALHC y C5.

ARP740/46: (ELYKYKWKIEPLGVAPTKA) (469-478)

péptido de 20 restos derivado del extremo C-5 de gp120. Contiene los primeros 3 restos de homología en el extremo C.

ARP740/47: (EPLGVAPTKAKRRVVQREKR) (479-498) péptido de 20 restos derivados de la región C5 de gp120. Contiene homología estructural con

el ALH.

P12. (RAKTVERKVERRK) Secuencia desorganizada del dominio CS de gp120 del VIH proporcionada por E. Hounsell. No reconocida por sueros WV positivos. Secuencia de control.

Ensayos de Inhibición de la Reacción de Linfocitos Mixtos

Donantes de Sangre

Se proporcionaron muestras de sangre no correspondientes con el ALH de Clase II, con consentimiento de los donantes, a través de Liz Buckland del servició de transfusión de Sangre South Thames, Tooting, Londres. Preparación de CMSP

Se diluyó sangre venosa recién extraída en Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS; SIGMA), se aplicó cuidadosamente sobre una Histopaque (SIGMA) y se centrifugó a 800 g durante 25 minutos a 20ºC. Las CMSP se recogieron de la interfaz de densidad con una pipeta Pasteur, se lavó 3 veces en HBSS y se realizó el recuento usando un contador Beckman Coulter. Ensayos de Inhibición de Linfocitos Mixtos

Para una RLM determinada, se resuspendieron las CMSP de dos individuos incompatibles con el ALH de clase II en medio RPMI 1640, que contenía suero AB humano termo-inactivado al 10% (SIGMA), L-glutamina 4 nM, Penicilina (1000 U/ml) y Estreptomicina (100 µg/ml) (SIGMA) y se diseñaron células estimuladoras o respondedoras. Las células se sembraron en placa por triplicado con estimuladoras a 1 x células/pocillo y respondedoras a 1 x 10 ∼ células/pocillo para proporcionar una relación Respondedora-Estimuladora de 10:1. Para determinar cualquier efecto inhibidor sobre la proliferación celular ejercido por el suero de cabra y diversos anticuerpos, se añadieron 3 µl de suero de cabra no diluido o 1 µl de anticuerpo purificado, a los pocillos que contenían los cultivos de células mezcladas y se incubó a 37ºC en CO2 al 5% durante 6 días. Los cultivos se sometieron a pulsos de 1 µCi de metil-timidina tritiada (3H-Thd; Amerhsam) el día 5, 18 horas antes de la recogida de las células. Las células se recogieron usando un colector de células Tomtec Harvester 96 Mach III sobre mallas de filtro de fibra de vidrio y la incorporación de la 3H-Thd se midió usando un contador de escintilación líquido Wallac 1450 microbeta. Los resultados se muestran como recuentos promedio por minuto (rpm). Resultados

Anticuerpos anti-ALH de clase II presentes en sueros de cabra

Los inventores investigaron hasta qué punto los diferentes sueros de cabra podrían reconocer péptidos de gp120 del VIH tomados de diferentes regiones a través de la gp120 del VIH-1, muchos llevando homología de secuencia y estructural con ALH (Tabla 1). En estos ensayos, los inventores también incluyeron la gp120 del VIH-1 soluble y ALH-DR1. Los resultados se muestran en las figuras 1 a 9. Nf representa los niveles de fondo. Se tomó, como resultado positivo, un nivel de DO superior a 0,1 dada la ausencia de reactividad contra cualquiera de los antígenos observados con el suero preinmunizado.

Los diferentes sueros proporcionaron diversos resultados pero generalmente dirigidos hacia una tendencia para reaccionar con el ALH-DR1. Los sueros pre-inmunizados no reaccionaron con ninguno de los péptidos o proteínas explorados y los sueros nº 0125 y nº 0126 tampoco mostraron ninguna gran reactividad. Sin embargo, los otros sueros demostraron elevados niveles de reactividad contra el ALH-DR1, en particular el nº 0127 y el nº 0128 que tuvieron una reactividad muy alta. Para aclarar, en la figura 9 se compara la reactividad contra el ALH-DR1 junto al AHL-DR anti-humano y ALH DR, DQ y DP anti-humano.

La actividad anti-ALH es interesante por la razón de que representa más probablemente actividad contra las moléculas del ALH de las mismas células del virus que se cultivaron antes de la inmunización. Como el VIH tiende a arrastrar más moléculas del ALH en su envuelta en comparación con las moléculas de gp120 que expresa, particularmente moléculas de ALH de clase II que regula positivamente en las células, las actividades anti-gp 120 y anti-ALH de clase II combinadas pueden ser lo que representa una buena respuesta protectora frente al VIH. Éste puede ser el caso de determinados sueros, particularmente el nº 0127 y nº 0128, en los que se indujo una fuerte “allo”-respuesta en estas cabras mediante la inmunización con virus que llevaba niveles altos de moléculas de Clase II en su superficie.

El suero nº 0378 de la cabra inmunizada con el cóctel Viral del NIH demostró la mejor reactividad cruzada en todas las rondas con respecto a péptidos VIH-i múltiples con niveles anti-ALH DR1 aproximadamente iguales a los del suero de cabra anti-LILV-3B original, lo que sugiere que este suero podría actuar mejor en conjunto contra el VIH. Este suero reacciona muy bien con una serie de péptidos del VIH-1 que llevan homología con el ALH. Ninguno de los sueros reaccionó con la secuencia de control desorganizada P12, demostrando que la reactividad era específica para los péptidos LIIV. Los sueros nº 0127 y nº 0128 representan los mejores sueros en términos de unión a la gp120 del VIH-i, aunque contienen cantidades muy elevadas de actividad anti-ALH DR. Inhibición de la RLM por Suero de Cabra

Con las RLM de las figuras 10 y 11, los inventores usaron células de individuos

incompatibles aleatorios. Aunque esto no produjo necesariamente la mayor proliferación (en ese momento hubo problemas con los medios), la tendencia parecía demostrar inhibición de la proliferación durante las RLM por el suero de cabra (suero inmunizado con VIH-3B original usado en cada caso). Posteriormente, los inventores comenzaron a usar células incompatibles de ALH-clase II (figura 12) que produjeron mejor proliferación. Al igual que el anticuerpo anti-ALH DR, el suero de cabra inhibe satisfactoriamente la proliferación celular y podría parecer que tiene actividad antiinflamatoria.

De acuerdo con lo que los inventores han observado a partir de los resultados del ELISA, es muy probable que los anticuerpos anti-ALH DR sean responsables de los efectos inhibidores. Los inventores destacan la función del anti-ALH DR en lugar de la del anti-clase II, ya que, en su conjunto, parece ser que la amplia variedad de anticuerpos no inhibe la proliferación en ningún sitio con una eficacia similar al anti-ALH DR en solitario. Por qué podría suceder esto es un misterio, sin embargo podría ser que el ALH-DR represente el antígeno principal de clase II implicado en la actividad inflamatoria y anticuerpos contra éste podrían dar como resultado la señalización dentro de las células para inhibir la replicación. Por lo tanto, podría parecer que el suero de cabra actúa como un agente anti-inflamatorio, suprimiendo la proliferación celular. Esto podría predecir un resultado positivo en el caso de infección por VIH1 en el que la activación celular inducida por virus es esencial para la replicación viral. Aunque en la superficie esto puede parecer contraproducente, la introducción de un agente inmunosupresor leve podría actuar para inhibir la replicación viral y controlar la enfermedad ya que el VIH, a diferencia los retrovirus relacionados HTLV-1 o HTLV-2, no inmortaliza a las células y causa cáncer, así que es totalmente dependiente de la activación celular para la proliferación.

Hasta ahora no se ha identificado ningún súper antígeno de linfocito T conocido para el VIH que conduzca al punto de cómo un virus, que parece relativamente mal equipado para activar las células que infecta, puede lograr causar enfermedades. Los inventores están investigando la teoría de que aloactivación inducida por virus está en la raíz, ya sea asociada con las moléculas de ALH asociadas al virus o con el mimetismo molecular observado entre VIH y el ALH. El suero de cabra posiblemente contribuye al bienestar del paciente simplemente limitando esta pan-activación. Se han realizado observaciones siguiendo líneas similares en un artículo de Saifuddin M y col. (Clin. Exp. Immunology 2000, 221: 324-331), quienes demostraron la importancia de las moléculas del ALH de clase II, en particular ALH-DR, en la replicación viral. Indicaron que anticuerpos contra las moléculas del ALH de clase II inhibían la expresión del virus en células que expresaban la clase II y sugirieron la implicación del transactivador inducible del CMH de clase II (CIITA) en la potenciación de la transcripción del VIH-1. Efectivamente, se podrían estar observando estos efectos en el caso de los sueros de cabra. Esto se compara con el anticuerpo anti-bucle V3, que causa proliferación aumentada y por lo tanto podría ser contraproducente en el esquema global de las cosas. La región del bucle V3 altamente variable de la gp120 no sólo permite mutantes de escape virales, sino que también actúa como un señuelo para el sistema inmune para rondas de activación adicionales. Desgraciadamente, la preocupación con esta región es finalmente beneficiosa para el virus y mantiene la respuesta inmune lejos de regiones más conservadas, contra cuya actividad podría ser más útil.

Si los efectos anti-inflamatorios son, en efecto, el principal modo de actividad de los sueros, esto podría ser útil para otras afecciones diversas en las que la hiperactividad y la proliferación celular están en la raíz de los síntomas de la enfermedad, por ejemplo la esclerosis múltiple. Para futuros experimentos es importante repetir los ELISA en todos los sueros para confirmar el grado de actividad anti-ALH y gp120. En este caso, los inventores están muy interesados en el suero nº 0378 del animal inmunizado con el cóctel viral del NIH ya que reacciona eficazmente con muchos de los péptidos del VIH que llevan homología con antígenos del ALH así como ALH-DR1. Experimentos Adicionales que no forman parte de la invención

Los siguientes datos proceden de experimentos similares a los realizados anteriormente, en los que los inventores identificaron anticuerpos anti-ALH en los sueros de cabra que se han usado como una forma de tratamiento para voluntarios que padecen esclerosis múltiple y SIDA, cuando la terapia convencional ya no era adecuada. Los trabajos de los inventores implican investigar un mecanismo de acción anti-inflamatorio, propuesto para el suero de cabra, en la recuperación de estos pacientes después del tratamiento. Esto se propuso previamente cuando se conocieron los anticuerpos anti-ALH. Sin embargo, los inventores añaden ahora una función para los anticuerpos anti-FAS presentes en los sueros de cabra, dada su capacidad para inducir la apoptosis en cuestión de horas a las células que expresan el receptor del FAS.

El FAS/APO-1 (CD95) está marcadamente presente a elevadas cantidades en linfocitos activos, señalización mediante la cual puede inducir a la célula a cometer suicidio después del entrecruzamiento con el ligando FAS o con un anticuerpo anti-FAS. La función de estas moléculas es extremadamente importante, no solamente en la respuesta inmune citotóxica para destruir células infectadas, sino también en la regulación negativa de la respuesta inmune después de que el antígeno haya desaparecido para prevenir la constante proliferación de células que podría ser perjudicial para el huésped. Por lo tanto se considera que esta ruta es vital para el mantenimiento de una respuesta inmune equilibrada.

En el caso de infección por VIH, se observa que el sistema inmune es anómalamente activo proporcionando mucho espacio para la replicación viral ya que requiere células activadas para este proceso. En los pacientes con esclerosis múltiple, células muy activadas atraviesan la barrera hematoencefálica y son responsables de lesiones en la vaina de mielina, dando como resultado la formación de placas y pérdida de función neuronal.

El mecanismo anti-inflamatorio mediado a través de la actividad de anticuerpos anti-ALH (anti-ALH DR al menos) presentes en suero de cabra, podría ser el mecanismo detrás de la recuperación del paciente. Los inventores han descubierto ahora anticuerpos anti-FAS presentes en el suero de cabra, en mayor o menor medida, y proponen combinar las funciones de los anticuerpos anti-ALH y anti-FAS en este mecanismo anti-inflamatorio propuesto para el modo de actividad tanto en pacientes con esclerosis múltiple como en pacientes con SIDA. Los inventores proponen que estos anticuerpos se están dirigiendo a las células más altamente activas dando como resultado su muerte mientras que los anticuerpos anti-ALH suprimen cualquier actividad inmune. Esto se podría continuar después por una reducción drástica de la producción de citocinas y quimiocinas dando como resultado la terminación del ataque inmune sobre la mielina en el caso de esclerosis múltiple o la reducción de la carga viral en el caso de pacientes infectados por el VIH, dada la ausencia de células activadas y la muerte de las células que secretan o están a punto de secretar virus. Trabajo Experimental

Los inventores comenzaron a buscar anticuerpos anti-FAS dadas las observaciones de que los sueros de cabra de los respondedores dañaban a las células cuando se añadían en reacciones de linfocitos mixtos (RLM). Las RLM son el resultado de linfocitos de 2 personas diferentes con diferentes tipos de ALH que reaccionan de una manera no específica, dando como resultado la proliferación de linfocitos y una mayor renovación. Los inventores consideran que éste es un buen sistema para ensayar anticuerpos anti-inflamatorios ya que las reacciones autoinmunes tienen por objeto la expresión inapropiada de auto-péptidos en moléculas de ALH de clase II.

Las Figuras 13 a 16 son fotografías tomadas de algunas RLM recientes, con y sin suero.

La Figura 13 es una fotografía de una reacción de linfocitos mixtos después de 72 horas.

La Figura 14 es una RLM mezclada con suero Pre-inmunizado después de 72 horas.

En ninguno los casos hubo cambios significativos con respecto a lo observado con la propia RLM. De hecho, los sueros pre-inmunes promueven la RLM.

La figura 15 es una RLM con suero nº 025 añadido. Este suero procede de una cabra que se consideró insensible a la inmunización en la que estaba presente una cantidad reducida

o insignificante de anticuerpos ALH y/o FAS, algo que se correlaciona con los resultados del ELISA anteriores cuando los inventores identificaron anti-ALH DR en los respondedores.

La figura 16 es una RLM con suero nº 0127 añadido, que ha demostrado ser un respondedor muy bueno. Existe una destrucción celular significativa de muchas de las CMSP en la RLM. Este resultado es similar para todos los respondedores fuertes junto con la preparación de suero que actualmente se está usando para el tratamiento.

Los inventores decidieron buscar un anticuerpo capaz de inducir la destrucción de células muy activas, como podría ser el caso de una RLM. Por lo tanto los inventores buscaron la presencia de un anticuerpo contra FAS que pudiera ser capaz de reaccionar de forma cruzada con el receptor FAS e inducir las señales necesarias para que se produzca la apoptosis. Por lo tanto, los inventores realizaron un ELISA contra FAS que demostró la presencia de dichos anticuerpos en los sueros de cabras que se consideraron los mejores respondedores y que complementaron los resultados previos con los anticuerpos anti-ALH .

Estos resultados, junto con los datos anteriores de los inventores, se correlacionan bien con lo observado en los resultados de la RLM de los inventores, debiéndose la proliferación celular reducida a la destrucción celular.

A partir de resultados de ELISA recientes, los inventores llevaron a cabo la identificación de posibles componentes activos adicionales en los sueros de cabra que se habían usado como una forma de tratamiento en voluntarios que padecían esclerosis múltiple (EM) y SIDA en los que la terapia convencional ya no era adecuada.

A continuación se indican los resultados de una exploración ELISA a una dilución de 1 en 1000 de los sueros pre-inmunizados. Los antígenos explorados fueron Ovoalbúmina, ALHDR1 (DR1) Fas, el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (rFCN), el receptor de serotonina (R Ser), el receptor de Dopamina (R Dop), CXCL 10 y Monoquina inducida por interferón gamma (MIG).

Ya es evidente que el anticuerpo contra el receptor de dopamina está presente a concentraciones elevadas en los sueros mientras que no existe actividad contra ninguno de los otros de antígenos. Sin embargo existe actividad contra muchos de estos antígenos en el suero 3B original, que previamente se había usado para el tratamiento, y en el suero 0127 producido a partir de una cabra inmunizada con VIH IIIb producido en una línea de linfocitos T, que incluye actividad contra el rFCN, el receptor de dopamina y CXCL10.

La actividad contra el ALH y FAS es de nuevo evidente y está de acuerdo con el mecanismo anti-inflamatorio ya propuesto por los inventores. De acuerdo con este tema, ahora puede añadirse actividad contra el CXCL10 y el receptor del factor del crecimiento nervioso p75 (R FCN p75). El antisuero contra CXCL10 ha demostrado recientemente ser beneficioso reduciendo enormemente la gravedad de la enfermedad en el modelo murino de esclerosis múltiple, a través de la reducción de linfocitos T CD4+ y invasión de macrófagos del SNC, disminuyendo la expresión de la citocina TH1 IFN-γ y aumentando la remielinización. Esto es interesante dado que células locales en lesiones inflamatorias comúnmente producen CXCL 10 que se une a las paredes, atrayendo a células TH1 inflamatorias mediante el receptor CXCR3. Por lo tanto, la neutralización de esta quimiocina o el bloqueo de su receptor por anticuerpos en el suero de cabra, bien podría formar parte del mecanismo de acción anti-inflamatorio propuesto por los inventores para el suero de cabra.

Por otro lado, anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento nervioso R FCN p75 de baja afinidad se asocian con la muerte celular en monocitos y macrófagos infectados por el VIH impidiendo que el FCN alcance el receptor, que de nuevo representa otro mecanismo inflamatorio. De manera interesante, los inventores han descubierto que los niveles más fuertes de anticuerpos contra estos receptores están presentes en los sueros 0378 producidos a través de la inmunización de cabras con un cóctel de 6 virus VIH diferentes producidos principalmente en CMSP en lugar de sólo linfocitos T. La actividad permanece muy alta incluso con una dilución de 1 en 4000.

Por lo tanto, los inventores añadieron la actividad contra estos antígenos de acuerdo con el mecanismo de acción anti-inflamatorio propuesto para los sueros en el caso de ambas enfermedades. Los inventores también añadieron actividad contra los receptores de dopamina y serotonina que son responsables de la sensación de bienestar asociada con el tratamiento.

Los inventores exploraron muchas cabras nuevas (707-718) que se habían vacunado recientemente con el VIH junto con el suero pre-inmune de estas cabras. Aunque ninguna de ellas mostró anticuerpos contra el receptor de dopamina, como los sueros pre-inmunes originales mostrados anteriormente, algunas de estas cabras tenían, por término medio, un nivel superior de dichos anticuerpos por comparación con las cabras procedentes de Wales que nunca se habían vacunado contra la Rabia. Los mayores niveles observados en la muestra pre-inmune original podían deberse con la exposición a algún factor ambiental en algún momento en el pasado seguido por una fuerte respuesta.


 


Reivindicaciones:

1. El uso de un anticuerpo policlonal de cabra anti-AHL de clase II en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un ser humano que implica una respuesta inmune proliferativa, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una lesión axonal o nerviosa, y en el que el anticuerpo policlonal de cabra anti-AHL de clase II se induce después de la exposición al VIH.

10 2. El uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene actividad anti-ALH de clase II y anti-VIH.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad es esclerosis múltiple.

15 4. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad es artritis reumatoide.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad es neuritis.