Células del epitelio pigmentario de la retina derivadas de células madre.

Un método para producir células del epitelio pigmentario de la retina (RPE),

comprendiendo el método:

a. cultivar células madre pluripotentes hu 5 manas en un medio suplementado con nicotinamida para generar células en diferenciación; y

b. cultivar dichas células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante β (TGF β) y nicotinamida, produciendo de este modo células RPE.

Células del epitelio pigmentario de la retina derivadas de células madre

La presente Invención se refiere a un método para producir células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) de acuerdo con la reivindicación 1.

Lo siguiente es una lista de referencias que se consideran pertinentes para describir el estado de la técnica en el campo de la invención.

(1) Strauss O., The retinal pigment epithelium in visual function; Physiol. Rev. 85: 845-881, 2005.

(2) Lund RD. et al., Cell transplantation as a treatment for retinal disease; Prog Retin Eye Res 20: 415-449, 2001.

(3) Haruta M., Embryonic stem cells: potential source for ocular repair; Semin Oftalmol. 20(1): 17-23, 2005.

(4) Haruta M. et al., In vitro and in vivo characterization of pigment epithelial cells differentiated from primate embryonic stem cells; Invest Oftalmol Vis Sci 45:1020-1024, 2004.

(5) Aoki H. et al., Embryonic stem cells that differentiate into RPE cell precursors in vitro develop into RPE cell monolayers in vivo; Exp Eye Res. 82(2):265-274, 2006.

(6) Klimanskaya I. et al., Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics; Cloning Stem Cells 6(3):217-245, 2004.

(7) Lund RD. et al., Human embryonic stem cell-derlved cells rescue visual function ¡n dystrophlc RCS rats; Cloning Stem Cells 8(3): 189-199, 2006.

(8) Publicación de solicitud PCT N°WO 06/070370.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La disfunción, lesión, y pérdida de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) son características prominentes de ciertas enfermedades y trastornos oculares, tales como degeneración macular relacionada con la edad (AMD), degeneraciones maculares hereditarias Incluyendo enfermedad de Best (la forma aparición prematura de distrofia macular viteliforme), y subtipos de retinitis pigmentosa (RP). Un tratamiento potencial para dichas enfermedades es el trasplante de RPE (y fotorreceptores) en la retina de los afectados con las enfermedades. Se cree que la reposición de células RPE mediante su trasplante puede retardar, detener o revertir la degeneración, mejorar la función retlnlana y prevenir la ceguera derivada de dichas afecciones.

La mácula, la parte central de la retina, es responsable de los detalles visuales finos y la percepción del color, y es crucial para muchas de nuestras tareas visuales diarias tales como el reconocimiento facial y la lectura. La mácula a menudo se ve afectada como parte de los procesos patológicos en degeneraciones retinianas generalizadas tales como retinitis pigmentosa (RP), así como en diferentes enfermedades que abordan más específicamente la región macular tales como degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y enfermedad de Best. En muchas de estas enfermedades, la disfunción o fallo primario sucede en las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) que subyacen a los fotorreceptores.

Las células RPE altamente especializadas desempeñan una tarea principal en el soporte de la función fotorreceptora: transportan activamente nutrientes desde los vasos coroideos, participan en el reciclaje de la vitamina A, que es necesaria para los cromóforos en los fotorreceptores, y captan y reciclan los segmentos externos deprendidos de los fotorreceptores como parte del proceso normal de renovación de estas células1

En subtipos de RP, enfermedad de Best, y AMD, el fallo del RPE finalmente conduce a pérdida visual y ceguera. El remplazo de estas células es una posible intervención terapéutica2, pero obtener dichas células de donantes o embriones humanos es difícil. Las células madre embrionarias humanas (hESC) pueden servir como fuente donante ilimitada potencial para células RPE, si puede dilucidarse el medio para dirigir su diferenciación en células RPE funcionales3. Los métodos para dirigir la diferenciación de hESC en cultivos altamente enriquecidos para células precursoras neurales (NP) se han descrito previamente (Reubinoff BE. et al., Neural progenitors from human embryonic stem cells; Nat Biotechnol 19: 1134-1140, 2001; Itsykson P. et al., Derivation of neural precursors from human embryonic stem cells in the presence of noggin; Mol Cell Neurosci. 30(1):24-36, 2005). Además, se ha demostrado el potencial de las hESC para dar lugar a células retinianas tanto in vitro como in vivo después de trasplante al espacio subretiniano en roedores (Banin E. et al., Retinal Incorporation and Differentiation of Neural Precursors Derived from Human Embryonic Stem Cells; Stem Cells 24(2):246-257, 2006).

Se ha demostrado el potencial de ESC de ratón y primate no humano de diferenciarse en células RPE, y de sobrevivir y atenuar la degeneración de la retina después de trasplante4,5 Se demostró la diferenciación espontánea de hESC en células RPE, sin embargo, la eficacia del proceso de diferenciación fue bajo, se requería un tiempo sustancial de diferenciación y se obtuvo un porcentaje solamente bajo (< 1%) de grupos que contenían células RPE después de 4-8 semanas de diferenciación. Además, aunque se observó función mejorada de la retina en ratas RCS después de trasplante subretiniano de estas células RPE, no se demostró la función de las células trasplantadas como células RPE maduras auténticas y este efecto podría estar potencialmente relacionado con un efecto trófico no específico de RPE6,7,9,10

Recientemente se demostró que las hESC pueden dirigirse para diferenciarse de forma reproducible en células RPE, en que sucedía direccionamiento en lugar de diferenciación espontánea de hESC hacia un destino RPE en presencia de Nicotinamida (NA)8.

El método para producir células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) de la presente invención se define en la reivindicación 1.

La presente invención proporciona un método para producir células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), comprendiendo el método:

a. cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio suplementado con nicotinamida para generar células en diferenciación; y

b. cultivar dichas células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante (3 (TGF p) y nicotinamida, produciendo de este modo células RPE.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para comprender la invención y mostrar el modo en que puede realizarse en la práctica, se describirá ahora una realización preferida, a modo de ejemplo no limitante solamente, con referencia a los dibujos adjuntos, en que:

Figuras 1A-1E: PCR a tiempo real, que analiza la expresión de marcadores de RPE en presencia de NA. Se indujo la diferenciación de hESC cultivándolas como grupos de flotación libre. A las 6 semanas de diferenciación, el nivel de expresión de los marcadores de RPE MiTF-A (Fig. 1 A) y RPE65 (Fig. 1B) estaba significativamente potenciado en presencia de NA. El análisis por PCR a tiempo real en momentos puntuales secuenciales demostró el aumento progresivo en los niveles de expresión de MiTF-A (Fig. 1C) y RPE65 (Fig. 1D) a lo largo del tiempo en presencia de NA. Se demostró la expresión de transcritos adicionales de marcadores de RPE incluyendo Bestrofina, CRALBP y Mertk por análisis de RT-PCR de grupos pigmentados sembrados en placa (Fig. 1E). +/- indica presencia o ausencia, respectivamente, de transcriptasa inversa.

Figuras 2A-2F: El efecto inductivo de diferenciación de RPE de NA no es dependiente de una composición específica de medio. Micrografías de campo oscuro de grupos hESC que se diferencian 12 semanas en medio KO (Fig. 2A) o en medio Neurobasal suplementado con N2, que se sustituye después de 1 semana con DMEM/F12 suplementado con B27 (medio NN) (Fig. 2C). En ambos medios la NA aumentó la diferenciación hacia células pigmentadas (Fig. 2B, D) aunque el tamaño de los grupos de hESC diferenciadas y sus cantidad total fue más pequeña con medio NN (las flechas blancas marcan áreas pigmentadas dentro de los grupos en diferenciación). A nivel de ARN, en ambos medios, la suplementación con NA potenció el nivel de expresión de MiTF-A y RPE65 (Fig. 2E, y F; respectivamente).

Figuras 3A-3L: Células que expresan melanina dentro de grupos de flotación libre de hESC son células RPE putativas. Micrografía de campo oscuro de grupos de flotación libre de hESC en diferenciación con áreas definidas altamente enriquecidas para células pigmentadas (Fig. 3A). Imágenes de fluorescencia (Fig. 3B) y contraste de fase (Fig. 3C) de células pigmentadas después de disociación y siembra en placa que son inmunorreactivas con anti Otx2 y MiTF. Se muestra una micrografía de campo oscuro de grupos en diferenciación después de siembra en placa que ilustra... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), comprendiendo el método:

a. cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio suplementado con nicotinamida para generar

células en diferenciación; y

b. cultivar dichas células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGF P) y nicotinamida, produciendo de este modo células RPE.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho cultivo de células madre pluripotentes humanas en un medio

suplementado con nicotinamida en la etapa (a) se realiza durante al menos dos días.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho miembro de la superfamilia de TGFp es TGFpi, TGFp3 o activina A.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente preparar las células RPE en una forma de dosificación adecuada para trasplante intraocular en un sujeto.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas células madre pluripotentes humanas 20 son células madre embrionarias humanas.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente recoger las células RPE.