Nuevo procedimiento para aislar Trichinella u otros parásitos a partir de tejido orgánico.

Procedimiento para detectar parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas esencialmenteintactos en la carne,

que comprende macerar la carne con una disolución de digestión básica, que contieneproteasas activas en medio básico, teniendo la disolución de digestión un valor de pH de entre pH 7,3 y 10.

Nuevo procedimiento para aislar Trichinella u otros parásitos a partir de tejido orgánico La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas esencialmente intactos en la carne, que comprende macerar la carne con una disolución de digestión básica, que contiene proteasas activas en medio básico, siendo éstas preferiblemente una endopeptidasa, en particular una serina endopeptidasa, y teniendo la disolución de digestión un valor de pH de entre pH 7, 3 y 10. Por lo demás, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas esencialmente intactos en la carne, que comprende macerar la carne con una disolución de digestión básica, que contiene por ejemplo una serina endopeptidasa, como por ejemplo Alcalase®, que comprende opcionalmente las etapas de (a) triturar mecánicamente la carne que va a examinarse; (b) macerar la carne que va a examinarse mediante la adición de una disolución de digestión; (c) macerar con movimiento simultáneo de la mezcla de base de digestión y/o tratamiento por ultrasonidos simultáneo; (d) inactivar la maceración; (e) filtrar el macerado; y (f) controlar, detectar, diagnosticar y/o tipificar una infestación por parásitos. Por lo demás se incluyen usos de enzimas de digestión activas en medio básico, por ejemplo de una serina endopeptidasa en un procedimiento para detectar parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas esencialmente intactos en la carne. La presente invención proporciona también serina endopeptidasas en el uso en un procedimiento de diagnóstico para detectar parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas esencialmente intactos en la carne. Finalmente también se da a conocer un kit, que comprende las enzimas activas en medio básico y/o una disolución de digestión básica. También se describe el uso de las enzimas activas en medio básico y/o de las disoluciones de digestión básicas en procedimientos de diagnóstico de infecciones con parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas intactos.

Las triquinas (Trichinella) son un género de nematodos del filo Nematoda con un modo de vida parasitario. Los mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces y seres humanos sirven como huésped intermedio y final. Los principales transmisores a los seres humanos son los animales cuya carne está infectada por triquinas o su carne cruda o cocida insuficientemente, en particular de cerdos, caballos y animales de caza. Mediante cocción o mucho frío pueden destruirse las triquinas.

Las triquinas están extendidas por todo el mundo por varias especies. Hay ocho especies, siendo las más importantes que existen en Europa Trichinella spiralis, Trichinella britovi, Trichinella pseudospiralis y Trichinella nativa. Otras especies son Trichinella murrelli (que existen en particular en regiones neoárticas) , Trichinella nelsoni (que existe en particular en Etiopía) , Trichinella papuae (que existe en particular en Papúa Nueva Guinea) y Trichinella zimbabwensis (que existe en particular en Zimbabue) . Trichinella spiralis, Trichinella britovi, Trichinella murrelli, Trichinella nelsoni y Trichinella nativa tienen mamíferos como huésped. Trichinella pseudospiralis tiene mamíferos y aves como huésped. Trichinella papuae y Trichinella zimbabwensis tienen mamíferos y reptiles como huésped. El nematodo parasitario Trichinella spp. puede infectar muchas especies diferentes, entre ellas seres humanos, cerdos, ratas, osos, caballos y aves. En los países del oeste de Europa las triquinas aparecen principalmente en el “ciclo selvático”, en el que los zorros y roedores propagan los gusanos al ingerir animales infectados. En zonas del norte también pueden servir como huésped intermedio osos, perros de trineo y focas. Un “ciclo urbano” está igualmente extendido; en éste los agentes patógenos se propagan principalmente mediante ratas y cerdos.

Las triquinelas adultas alcanzan una longitud de hasta 4 mm (hembras) o 1, 5 mm (machos) . Puede reconocerse claramente el extremo posterior engrosado que alberga el intestino. Las larvas se enquistan en el tejido muscular y forman en el mismo un “complejo nutritivo de células nodriza”, una cápsula, que se abastece en abundancia con vasos sanguíneos y de este modo mantiene la larva con vida. Alcanza un tamaño de aproximadamente un milímetro y es altamente infecciosa. Sin embargo, existen también variantes que no forman una cápsula, tal como por ejemplo Trichinella pseudospiralis.

Los quistes musculares ingeridos se disgregan en el intestino delgado y así se liberan las larvas. Las larvas penetran en el epitelio del intestino delgado y se desarrollan en el plazo de 30 horas dando un animal adulto; después tiene lugar el apareamiento. En el intestino delgado, las hembras dan a luz de manera vivípara hasta 1500 larvas. Las larvas penetran a continuación a través del intestino delgado y alcanzan así la linfa o el torrente sanguíneo. Son llevadas por el cuerpo y se asientan sobre todo en el tejido muscular estriado transversalmente con buen riego sanguíneo. Un tejido preferiblemente infestado es el diafragma, los músculos de la masticación y la lengua. Allí comienza la formación del “complejo nutritivo de células nodriza”, que sigue siendo infeccioso mientras vive el parásito. A partir del quinto mes se producen en el tejido humano una calcificación, continuando siendo viables las triquinas musculares enquistadas presumiblemente todavía de 5 a 10 años. Con un tiempo de incubación de desde 8 hasta 15 días se desarrollan a partir de las larvas que se encuentran en primer lugar en el intestino delgado gusanos adultos. A este respecto, además de evoluciones de la enfermedad a menudo asintomáticas también aparecen debilidad general, dolores de estómago, náuseas, vómitos y diarrea; tras de 1 a 3 semanas entonces fiebre, dolor muscular y edemas en la zona de los ojos. Estos síntomas duran en la mayoría de los casos hasta un año y desaparecen después sin consecuencias permanentes. Como complicación puede infestarse el músculo cardiaco, con lo que la infección por gusanos puede seguir una evolución mortal. El cuadro clínico provocado por

triquinas se denomina triquinosis. Las infecciones están sujetas en la Unión Europea a obligación de declaración y es obligatorio declararse en Alemana según la Ley alemana de protección contra las infecciones.

La medida preventiva más importante es el reconocimiento triquinoscópico prescrito por ley, que también se denomina examen triquinoscópico. Por esto se entiende el examen microscópico de carne para determinar la presencia de triquinas tras la matanza, pudiendo reconocerse de manera selectiva las cápsulas de las larvas o las larvas. A este respecto, para el consumo por parte de seres humanos, determinada carne de cerdos, équidos, jabalíes, osos, zorros, nutrias y tejones, así como todos los demás animales que pueden ser portadores de triquinas, está sujeta a la obligación de examen (animales de matanza con obligación de examen) .

Se diferencian esencialmente dos métodos para detectar Trichinella spp. en animales. El primer método se denomina triquinoscopia o examen triquinoscópico. En este método de detección directo se comprime el tejido de las muestras de triquinas, que se toma de los pilares principales del diafragma y de la musculatura de las patas delanteras para el examen, en un denominado compresor (es decir compresor de vidrio compuesto por dos plaquetas de vidrio) y a continuación se examina microscópicamente. Este método es poco sensible y requiere mucho trabajo. Además, con este método no pueden identificarse triquinas sin cápsulas (no formadoras de cápsulas) . El segundo método es un método de digestión artificial con asistencia mecánica. A este respecto, el tejido muscular que rodea las larvas se digiere artificialmente por medio de imitación de la digestión natural añadiendo pepsina en medio ácido, para liberar a este respecto las larvas. A continuación se examinan las larvas microscópicamente. El reconocimiento triquinoscópico está regulado por el “Reglamento (CE) n.º 2075/2005 de la Comisión de 5 de diciembre de 2005 por el que se establecen normas específicas para los controles oficiales de la presencia de triquinas en la carne”. El procedimiento usado en el estado de la técnica, en el que se imita la digestión natural añadiendo enzima pepsina, una aspartato endopeptidasa, y se realiza la digestión en medio ácido, usa la forma de pepsina disponible comercialmente, que se obtiene del estómago del cerdo.

Los procedimientos usados en el estado de la técnica están regulados,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para detectar parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas esencialmente intactos en la carne, que comprende macerar la carne con una disolución de digestión básica, que contiene proteasas activas en medio básico, teniendo la disolución de digestión un valor de pH de entre pH 7, 3 y 10.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima de digestión es una serina endopeptidasa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende las etapas de:

(a) triturar mecánicamente la carne que va a examinarse;

(b) macerar la carne que va a examinarse mediante la adición de una disolución de digestión;

(c) inactivar la maceración; 10 (d) filtrar el macerado; y

(e) controlar, detectar, diagnosticar y/o tipificar una infestación por parásitos.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la razón de carne/disolución de digestión es preferiblemente de 1:5, 1:10 ó 1:20.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la serina endopeptidasa es 15 preferiblemente una enzima del grupo de enzimas de las subtilisinas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la subtilisina se produce de manera recombinante o no recombinante y/o se selecciona del grupo que consiste en: Alcalase® (subtilisina Carlsberg) y Alcalase 2, 5L®.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la disolución de digestión contiene NaCl 20 y/o contiene opcionalmente emulsionantes de grasa, tensioactivos y/o adyuvantes.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el emulsionante de grasa es Supralan UF®.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que los adyuvantes se seleccionan del grupo que consiste en coenzimas, sustratos enzimáticos y catalizadores.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la maceración se realiza con tratamiento

por ultrasonidos simultáneo, con movimiento simultáneo y/o agitación simultánea con un agitador magnético y/o a una temperatura de entre 55ºC y 65ºC.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la inactivación de la maceración se termina mediante filtración de la reacción o mediante enfriamiento de la reacción.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en la filtración del macerado se adapta el 30 tamaño de malla de los filtros usados al tamaño de los organismos que deben detectarse.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el control, la detección, el diagnóstico y/o la tipificación de una infestación por parásitos tienen lugar visualmente.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas pertenecen al filo Nematoda (nematodos) y/o al género Trichinella (triquinas) .

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la especie de Trichinella se selecciona del grupo que consiste en Trichinella spiralis, Trichinella britovi, Trichinella pseudospiralis, Trichinella nativa, Trichinella murrelli, Trichinella nelsoni, Trichinella papuae y Trichinella zimbabwensis.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la carne que va a examinarse se selecciona del grupo que consiste en animales de matanza, animales domésticos, animales salvajes y 40 animales para taxidermia.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la carne que va a examinarse de animales de matanza, animales domésticos, animales salvajes o de los animales para taxidermia se selecciona de carne de cerdo, jabalí, oso, corzo, ciervo, gamuza, alce, caballo, zorro, nutria, perro mapache, tejón, avestruz y cocodrilo.

18. Uso de una proteasa activa en medio básico en uno de los procedimientos según una de las 45 reivindicaciones 1 a 17.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que la proteasa activa en medio básico es una endopeptidasa,

preferiblemente una serina endopeptidasa.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que la serina endopeptidasa es una enzima del grupo de enzimas de las subtilisinas.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que la subtilisina se selecciona del grupo que consiste en: Alcalase® (subtilisina Carlsberg) y Alcalase 2, 5L®.

22. Uso de un kit para detectar parásitos formadores de cápsulas o no formadores de cápsulas esencialmente intactos en la carne, que comprende una disolución de digestión básica y una proteasa activa en medio básico, teniendo la disolución de digestión un valor de pH de entre pH 7, 3 y 10.