Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células.

Un medio de cultivo celular exento de proteínas animales, que comprende putrescina e hidrolizado de soja,

en el que la putrescina está presente en el medio de cultivo en una concentración que varía entre 0,5 y 10 mg/L y elhidrolizado de soja está presente en una concentración que varía desde el 0,05 % (p/v) hasta el 1 % (p/v).

Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que comprendeuna poliamina y un hidrolizado derivado de vegetales y/o de levaduras. La invención también se refiere a procesosde cultivo exentos de proteínas animales, en los que las células pueden ser cultivadas, propagadas y pasadas sin añadir proteínas animales complementarias al medio de cultivo. Estos procesos son útiles para cultivar células, talescomo células recombinantes o células infectadas con un virus, y para producir productos biológicos medianteprocesos de cultivo celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Para el cultivo de células, particularmente de células eucariotas, y más específicamente células demamífero, existe una necesidad constante de usar medios de cultivo especiales que hacen disponibles las sustancias nutrientes de crecimiento que son necesarias para un crecimiento eficaz de las células y para laproducción de las proteínas o de los virus que se desean. Para la producción eficaz de productos biológicos, talescomo virus o proteínas recombinantes, es importante que se alcance una densidad celular óptima, así como que seaumente la propia expresión de proteínas para obtener un rendimiento máximo del producto.

Las formulaciones de medios de cultivos celulares se han complementado con diversos aditivos, que incluyen componentes no definidos tales como suero bovino fetal (fetal calf serum, FCS) , diversas proteínas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteínas de origen bovino.

En general, el suero o las sustancias derivadas del suero, tales como la albúmina, la transferrina o lainsulina, pueden contener agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos celulares y los productosbiológicos obtenidos a partir de los mismos. Adicionalmente, los aditivos derivados de suero humano deben serensayados para comprobar todos los virus conocidos, incluyendo hepatitis y VIH, que pueden ser transmitidos por elsuero. Además, el suero bovino y los productos derivados del mismo son portadores de un riesgo de contaminaciónpor EEB. Además, todos los productos derivados de suero pueden estar contaminados por constituyentesdesconocidos. En el caso del suero o de aditivos proteicos que derivan de seres humanos o de otras fuentesanimales en cultivos celulares, existen numerosos problemas (por ejemplo, la calidad variable de la composición delos diferentes lotes y el riesgo de contaminación por micoplasma, virus o EEB) , particularmente si las células se usan para la producción de fármacos o de vacunas para su administración a seres humanos.

Por lo tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar sistemas hospedadores y condiciones decultivo eficaces que no requieran suero ni otros compuestos proteicos animales. El medio simple exento de sueroincluye típicamente medio basal, vitaminas, aminoácidos o sales orgánicas o inorgánicas, y opcionalmente componentes adicionales para hacer el medio nutricionalmente complejo.

Se sabe que los hidrolizados de soja son útiles para los procesos de fermentación y pueden mejorar elcrecimiento de muchos organismos de cultivo difícil, levaduras y hongos. El documento WO 96/26266 describe quelos digeridos papaicos de harina de soja son una fuente de carbohidratos y de nitrógeno y muchos de los componentes pueden usarse en un cultivo tisular. Franek y col. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688 – 692) describen los efectos promotores del crecimiento y de la productividad de fracciones peptídicas definidas delhidrolizado de soja.

El documento WO 96/15231 desvela un medio exento de suero formado por medio sintético mínimoesencial y extracto de levadura para la propagación de células de vertebrados y procesos de producción de virus. Enel documento WO 98/15614 se desvela una formulación de medio compuesta por medio de un cultivo de célulasbasal que comprende un péptido de arroz y un extracto de levadura, y la digestión enzimática de los mismos, y/o unlípido vegetal para el crecimiento. En el documento WO 01/23527 se desvela un medio que comprende un hidrolizado de soja purificado para el cultivo de células recombinantes. El documento WO 00/03000 desvela un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero también requiere la presencia deformas recombinantes de proteínas animales, tales como factores de crecimiento.

El documento WO2004/005493 describe un medio de cultivo celular exento de proteínas animales quecomprende una combinación de péptidos no derivados de animales procedentes de hidrolizado de soja e hidrolizadode levadura. El documento WO01/11021 se refiere a un clon celular recombinante estable que es estable en unmedio que no contiene suero y proteínas durante al menos 40 generaciones. El documento FR72.29396 describe unmedio de cultivo para la selección de bacterias en el que el medio está exento de proteínas animales. El documentoWO02/24876 se refiere a un proceso para aislar virus procedentes de varias fuentes y para producir vacunasantigripales de virus vivos atenuados en un cultivo celular Vero exento de suero en unas condiciones en las que seminimizan o se evitan alteraciones en los antígenos de superficie del virus debido a la selección adaptativa.

El documento EP-A-0 481 791 describe un medio de cultivo bioquímicamente definido para cultivar célulasCHO modificadas genéticamente que está exento de proteínas, lípidos y carbohidratos aislados a partir de una fuente animal, que comprende además una insulina recombinante o un análogo de insulina, del 1 % al 0, 025 % p/vde digerido de papaína de peptona de soja y putrescina. El documento WO 98/08934 describe un cultivo celular eucariota exento de suero que comprende péptidos de hidrolizado de soja (1 – 1000 mg/L) , de 0, 01 a 1 mg/L deputrescina y varios componentes derivados de animales, incluyendo albúmina, fetuína, varias hormonas y otrasproteínas. En este contexto, también debería mencionarse que también se sabe que la putrescina está contenida enmedios estándar tales como DMEM/Ham's F12 a una concentración de 0, 08 mg/L.

Sin embargo, los medios conocidos en el estado de la técnica son a menudo nutricionalmente insuficientesy/o deben ser complementados con complementos proteicos derivados de animales o versiones recombinantes deproteínas, tales como insulina, factor de crecimiento insulinoide u otros factores de crecimiento.

Por lo tanto, existe una necesidad actual de aumentar el rendimiento de la proteína recombinanteexpresada o de cualquier otro producto de expresión, y de la tasa de crecimiento específica de las células, y deproporcionar un medio de cultivo celular óptimo completamente exento de proteínas animales para la producción deproductos biológicos, tales como los usados como productos farmacéuticos o como vacunas en seres humanos.

Sobre la base de extractos de peptona de soja (también denominados "hidrolizados de soja") se handesarrollado medios que no contienen proteínas animales. Sin embargo, la calidad de los lotes disponibles comercialmente de hidrolizados de soja varía extremadamente y, como resultado, existen amplias variaciones en laproducción de proteínas recombinantes o de productos víricos (una variación de hasta en un factor de 3) en funciónde los lotes de hidrolizados de soja usados ("variación interlote") . Este inconveniente afecta a la proliferación de lascélulas, así como a la expresión proteica de cada célula.

Por lo tanto, hay una necesidad de un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que estécompletamente exento de proteínas animales y supere al menos uno de los problemas mencionados anteriormente.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención es proporcionar un medio de cultivo celular exento de proteínasanimales que no contenga ninguna proteína complementaria añadida derivada de una fuente animal ni/o proteínasanimales recombinantes, que permita un crecimiento celular eficaz y en particular la producción proteica, con unacalidad continua con respecto a la cantidad de expresión por célula. Un objeto adicional de la presente invención esproporcionar un procedimiento para cultivar células y un procedimiento para la expresión eficaz de proteínas recombinantes que están exentas de proteínas animales.

Otro objeto de la presente invención es reducir el hidrolizado derivado de vegetales y/o de levaduras conobjeto de superar los efectos inhibidores que influirían negativamente en el rendimiento de la producción de unproducto recombinante o vírico deseado. Sorprendentemente se encontró que los hidrolizados eran la causa de lasvariaciones interlote en la producción.... [Seguir leyendo]

1. Un medio de cultivo celular exento de proteínas animales, que comprende putrescina e hidrolizado de soja, en el que la putrescina está presente en el medio de cultivo en una concentración que varía entre 0, 5 y 10 mg/L y elhidrolizado de soja está presente en una concentración que varía desde el 0, 05 % (p/v) hasta el 1 % (p/v) .

2. El medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1, en el que la putrescinase origina a partir de una fuente distinta de un hidrolizado de soja.

3. Un procedimiento para cultivar células, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1, y

(b) propagar las células en el medio para formar un cultivo celular.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que las células se eligen del grupo formado por células demamífero, células de insecto, células de ave, células bacterianas y células de levadura.

5. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que las células se cultivan mediante un procedimientoelegido del grupo formado por cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado, cultivo por perfusión y cultivoquimioestático.

6. Un procedimiento para expresar una proteína objetivo, que comprende las etapas de:

a) hacer crecer un cultivo de células en un medio de cultivo celular exento de proteínas animales según lareivindicación 1; b) introducir en las células una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para

la proteína objetivo; c) seleccionar las células portadoras de la secuencia de ácidos nucleicos; e d) inducir selectivamente la expresión de la proteína objetivo en las células.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que las células se eligen del grupo formado por células demamífero, células de insecto, células de ave, células bacterianas y células de levadura.

8. El procedimiento según la reivindicación 6 en el que la combinación de célula / proteína objetivo se elige del grupo formado por células CHO / factor de coagulación VIII, células BHK / eritropoyetina, virus de Epstein Barr transformado, linfocitos B humanos inmortalizados / anticuerpos humanos.

9. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que las células se cultivan mediante un procedimientoelegido del grupo formado por cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado, cultivo por perfusión y cultivoquimioestático.

10. Un procedimiento para producir un virus, que comprende las etapas de:

a) hacer crecer un cultivo de células en un medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1; b) infectar las células con el virus; c) seleccionar las células infectadas por el virus; e d) incubar las células para propagar el virus.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que las células se eligen del grupo formado por células demamífero, células de insecto, células de ave, células bacterianas y células de levadura.

12. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la combinación de célula / virus se elige del grupoformado por célula Vero / vacuna atenuada, célula Vero / vacuna, célula Vero / hepatitis A, célula Vero / virus de lagripe, célula Vero / virus del Nilo occidental, célula Vero / virus del SARS y células embrionarias de pollo / virus de laFSME.

13. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que las células se cultivan mediante un procedimiento elegido del grupo formado por cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado, cultivo por perfusión y cultivoquimioestático.