Medios y métodos para mediar en la interferencia de proteínas.

Una molécula que no se encuentra en la naturaleza capaz de regular por disminución la función de una proteína,

que comprende al menos una región de agregación-ß expuesta al entorno y procedente de dicha proteína que setiene que regular por disminución, en la que dicha región de agregación-ß se fusiona a un resto que evita laagregación de dicha región de agregación-ß, para uso como un medicamento, en el que dicha molécula se puedeobtener proporcionando:

- parte A que comprende una región, tal como un péptido, dominio proteico, proteína o perla de agarosa que evita laagregación de la parte B y

- parte B que comprende al menos 1 región de agregación-ß y en la que dicha región procede de dicha proteína quese tiene que regular por disminución.

Medios y métodos para mediar en la interferencia de proteínas Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la proteómica funcional y más en particular al campo de la agregación de proteínas. La invención desvela un método para interferir con la función de una proteína diana y usa una molécula diseñada por el usuario, no natural, designada como interferón, que tiene una especificidad para una proteína diana y que induce agregación en el contacto con dicha proteína diana. La presente invención también desvela tales moléculas de interferón y su uso en aplicaciones terapéuticas.

Antecedentes de la invención La biología está entrando en una apasionante era ocasionada por el aumento de información de todo el genoma. A medida que la secuenciación del genoma y las propuestas genómicas funcionales de alto rendimiento generan más y más datos, los investigadores necesitan nuevas maneras de sacar información relevante biológica con cuidado. La genómica funcional en particular está haciendo un rápido progreso en la asignación de significado biológico a los datos genómicos. La información codificada en el genoma comprende genes, los productos proteínicos de los cuales media la mayoría de las funciones en los organismos y elementos de control. Se pensaba que las proteínas eran los efectores más importantes en las células, aunque recientemente también se han identificado los ARN no codificadores como piezas clave importantes en los procedimientos reguladores.

Son centrales diversas cuestiones biológicas clave para continuar los proyectos del genoma y son relevantes para cualquier organismo celular, desde las bacterias a los seres humanos. Un reto es entender cómo actúan e interaccionan los genes que están codificados en un genoma para producir un sistema de vida complejo. Un reto relacionado es determinar la función de todos los elementos de la secuencia en el genoma. El conjunto de herramientas de la genómica funcional ha permitido diversas propuestas sistemáticas que pueden proporcionar las respuestas a unas pocas cuestiones básicas para la mayoría de los genes en un genoma, incluyendo cuándo se expresa un gen, donde se localiza su producto, con qué otros productos génicos interactúa y qué fenotipo resulta si muta un gen. El análisis fenotípico de los mutantes ha sido una propuesta poderosa para determinar la función de los genes. La función de los genes se puede modificar por deleciones de genes, mutagénesis insercional e interferencia de ARN (ARNi) . El ARNi es un desarrollo relativamente reciente para reducir la expresión de los genes. Siguen informes de silenciamiento de genes en plantas y otros organismos modelo y se basa en la observación de C. elegans que añadiendo ARN bicatenario (ARNbc) a las células con frecuencia se interfiere con la función de los genes de una manera específica de la secuencia. En muchos casos, el nivel de reducción funcional no se puede controlar de manera adecuada, es incompleto, el nivel de especificidad no es completamente predecible y en algunos organismos el ARNi no actúa (por ejemplo en el Candida albicans de levadura) .

Es obvio que la genómica funcional ha cambiado la manera en que se hace biología y aún el campo está todavía en mantillas en términos de detallar la complejidad que subyace a los sistemas biológicos, tal como la compleja red de la regulación genética, las interacciones de proteínas y las reacciones bioquímicas que hacen una célula. Claramente hay una necesidad de desarrollar tecnologías innovadoras, especialmente en el campo de la proteómica funcional, para acelerar descubrimientos y maximizar el potencial ofrecido por métodos complementarios en genómica funcional. Sería deseable poseer una tecnología flexible que pueda fijar como objetivo directamente la función biológica de una proteína extracelular o intracelular particular en vez de fijar como objetivo el ARNm que la traduce o manipular el gen que la codifica.

Se cree que la conversión de proteínas normalmente solubles en proteínas insolubles modificadas de manera conformacional es un proceso causativo en una variedad de enfermedades tales como por ejemplo la existencia de péptido beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer y angiopatía amiloide cerebral, depósitos de alfa-sinucleína en cuerpos de Lewy de la enfermedad de Parkinson, priones en la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, superóxido dismutasa en esclerosis lateral amiotrófica y tau en ovillos neurofibrilares en demencia frontotemporal y enfermedad de Pick. Hasta ahora, la agregación de proteínas ha sido estudiada principalmente como un fenómeno causante de enfermedad, no deseado y es ampliamente aceptado que la agregación mediada por beta cruzada es el mecanismo de agregación2 que se produce lo más frecuentemente y biológicamente relevante. La agregación beta cruzada es el término usado para indicar que la agregación es nucleada vía la formación de láminas beta intermoleculares a las que cada molécula en el agregado contribuye una hebra idéntica que comprende típicamente al menos tres aminoácidos contiguos. Ahora hay datos abundantes para demostrar que las hebras individuales interactúan para formar una lámina beta intermolecular y que esta estructura forma la cadena principal del agregado3, 4. Las regiones de autoasociación en proteínas diana se pueden determinar por programas informáticos, tales como TANGO6, que se desarrolló prediciendo la propensión a la agregación de péptidos y proteínas. Una forma específica de agregación, es decir la fibra amiloide altamente ordenada, ya se está explorando en la técnica para uso potencial en las ciencias5 materiales. Además, la patente internacional WO 03102187 (Scegen, Pty Ltd) desvela un método para mejorar la actividad de una molécula por fusión de dicha molécula con una secuencia de traslocación de membrana,

según lo cual la molécula quimérica resultante se autoensambla en un agregado de mayor peso molecular. La patente de EE.UU. 20050026165 (Areté Associates) desvela el uso de péptidos conformacionales, capaces de interactuar con la conformación de láminas beta de proteínas insolubles tales como priones, como una herramienta de diagnóstico para enfermedades por priones. La técnica anterior también describe mutaciones de proteínas antimórficas o negativas dominantes. La inhibición de la función de la proteína por tales mutaciones también se ha descrito para fines terapéuticos. La patente de EE.UU. 2003/0064384 sugiere bloqueo de la acción de la betacatenina por mutantes dominantes negativos de esta proteína que se puede usar para el tratamiento del cáncer. La patente europea EP1325930 desvela antagonismo de la acción de la prolactina por mutantes N-terminales del receptor de prolactina, que se puede usar para tratamiento de tumores. Sellman et al., describen el tratamiento de patógenos por mutantes dominantes negativos, es decir del envenenamiento por toxina ántrax causado por Bacillus anthracis. Los cuatro mutantes inhibidores identificados son mutantes en 3 puntos y un mutante de deleción (Sellman et al., Science 292: 695-697 (2.001) ) .

Sumario de la invención La presente invención se refiere a una tecnología para la agregación de proteínas controlada e inducible de proteínas diana específicas. La invención también proporciona moléculas designadas de novo, designadas en la presente memoria como moléculas de interferón, que comprenden al menos una región de agregación de la que dicha región de agregación procede de una proteína diana. En una realización preferida, la molécula de interferón comprende al menos una región de autoasociación que se fusiona a un resto que evita la agregación de dicha región de autoasociación. En el contacto entre una proteína diana elegida y una molécula de interferón diseñada específicamente, tiene lugar una coagregación específica entre la diana y el interferón que da como resultado una inhibición funcional o una regulación por disminución de la función biológica para dicha proteína diana. Esta supresión de la proteína está condicionada por la presencia de agregados, que son inducidos por la presencia de la molécula de interferón. Una ventaja adicional es que la intensidad de la interferencia de la proteína se puede controlar de manera experimental por variación del número de regiones de agregación en la molécula de interferón. La invención no sólo proporciona una herramienta eficaz para regular por disminución la función biológica de una proteína extra o intracelular específica sino que también tiene aplicaciones terapéuticas, agrícolas y de diagnóstico importantes.

Leyendas de la figura Figura 1: Interferencia de proteínas en E. coli usando la expresión recombinante de 4 construcciones de interferón... [Seguir leyendo]

1. Una molécula que no se encuentra en la naturaleza capaz de regular por disminución la función de una proteína, que comprende al menos una región de agregación-β expuesta al entorno y procedente de dicha proteína que se tiene que regular por disminución, en la que dicha región de agregación-β se fusiona a un resto que evita la agregación de dicha región de agregación-β, para uso como un medicamento, en el que dicha molécula se puede obtener proporcionando:

-parte A que comprende una región, tal como un péptido, dominio proteico, proteína o perla de agarosa que evita la agregación de la parte B y

-parte B que comprende al menos 1 región de agregación-β y en la que dicha región procede de dicha proteína que se tiene que regular por disminución.

2. La molécula para uso según la reivindicación 1, en la que dicho resto es un péptido, un dominio proteico o una perla de agarosa.

3. La molécula para uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha región de agregación-β consiste en al menos 5 aminoácidos contiguos.

4. La molécula para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que un ligador está presente entre dicha región de agregación-β y dicho resto.

5. La molécula para uso según la reivindicación 4, en la que dicho ligador es un polipéptido o es de naturaleza no polipeptídica.

6. La molécula para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha molécula es un polipéptido y está codificada por una secuencia de nucleótidos presente en un vector recombinante y que, en la transformación a una célula u organismo, produce dicho polipéptido en dicha célula u organismo.

7. La molécula para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de cáncer.

8. La molécula para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de infección con un patógeno.

9. Una molécula que no se encuentra en la naturaleza que comprende al menos una región de agregación-β aislada de un dominio proteico capaz de ser soluble en agua en el que dicha región de agregación-β está expuesta al entorno y fusionada a un resto que evita la agregación de dicha región de agregación-beta, en la que dicha molécula se puede obtener proporcionando:

-parte A que comprende una región, tal como un péptido, dominio proteico, proteína o perla de agarosa que evita la agregación de parte B y

-parte B que comprende al menos 1 región de agregación-β y en la que dicha región procede de una proteína con cuya función se tiene que interferir.

10. Una molécula según la reivindicación 9, en la que dicho resto es un péptido, un dominio proteico o una perla de agarosa.

11. Una molécula según la reivindicación 9 ó 10, en la que la región de agregación-β y el resto que evita la agregación son de otra proteína o son de la misma proteína pero no inmediatamente adyacentes en esa proteína.

12. Un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Una molécula o vector según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para uso como medicamento.

14. Un método para aislar una proteína de una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con una molécula que comprende al menos una región de agregación-β expuesta al entorno y aislada de dicha proteína, en el que dicha región de agregación-β se fusiona a un resto que evita la agregación de dicha región de agregación-β y aislar el complejo molécula co-agregada-proteína resultante de dicha muestra, en el que dicha molécula se puede obtener proporcionando:

-parte A que comprende una región, tal como un péptido, dominio proteico, proteína o perla de agarosa que evita la agregación de parte B y

-parte B que comprende al menos 1 región de agregación-β y en la que dicha región procede de dicha proteína que se tiene que aislar.

15. Un método según la reivindicación 14, en el que dicho resto es un péptido, un dominio proteico o una perla de agarosa.

16. Un método según la reivindicación 14 ó 15, que comprende además la detección de una proteína en dicha muestra. 10

17. Un método para la regulación por disminución de la función biológica de una proteína que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula que no se encuentra en la naturaleza que comprende al menos una región de agregación-β expuesta al entorno, presente en dicha proteína y fusionada a un resto que evita la agregación de dicha región de agregación-beta, en el que el método no se realiza en seres humanos o animales, en el que dicha molécula se puede obtener proporcionando:

-parte A que comprende una región, tal como un péptido, dominio proteico, proteína o perla de agarosa que evita la agregación de parte B y

-parte B que comprende al menos 1 región de agregación-β y en la que dicha región procede de dicha proteína que se tiene que regular por disminución.