Ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido que comprende un polipéptido de neublastina y un péptido señal seleccionado del grupo que consiste en un péptido señal de albúmina y un péptido señal de hormona de crecimiento,

en el que el polipéptido carece de la pro-región de neublastina y el polipéptido de neublastina es distinto de NBN104 (SEQ ID NO. 19)

Secreción mejorada de neublastina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para producir un polipéptido de neublastina así como a la liberación local de neublastina a regiones específicas del sistema nervioso incluyendo el sistema nervioso central y el ojo, por ejemplo, mediante terapia génica. La invención incluye la liberación de neublastina a partir de células transducidas o transfectadas encapsuladas dentro de una macrocápsula con una membrana semipermeable. La invención se refiere adicionalmente a células de mamífero que pueden producir neublastina en cantidades aumentadas.

Antecedentes de la invención

Las células tienen formas para dirigir las proteínas sintetizadas de novo a diversos compartimentos de las células y al espacio extracelular. Los péptidos señal se encuentran en la parte codificante del ADN cromosómico y se sintetizan como parte de la proteína mediante el aparato ribosómico. Los péptidos señal constituyen el extremo N-terminal y provocan que los polipéptidos recién sintetizados se dirijan hacia el retículo endoplasmático rugoso. En éste, el péptido señal se escinde a partir del polipéptido y la proteína madura se secreta hacia el entorno. Por tanto, el péptido señal permanece dentro de la célula.

La pro-parte de la proteína se escinde de la parte madura de la proteína y acaba fuera de la célula. Para algunos factores neurotróficos, por ejemplo NGF, la pro-parte de la proteína es bioactiva como neuropéptido.

En terapia génica, cuando el gen insertado codifica para una proteína que va a secretarse, se necesitará colocar una secuencia señal en frente de la proteína madura para garantizar su procesamiento apropiado a través del retículo endoplasmático rugoso y el aparato de Golgi. La primera elección es casi invariablemente la secuencia señal nativa de la proteína en cuestión, debido a que generalmente se desea que la proteína se secrete y/o procese en la misma forma que se secreta y procesa por la célula nativa. Para algunos usos también se desea que la cantidad de proteína expresada sea la misma que en la célula nativa. Además, no puede excluirse la posibilidad de que la secuencia señal escindida desempeñe un papel en el metabolismo de la célula. Finalmente, un experto en la técnica elegiría utilizar la parte de la pre-pro-proteína para garantizar un procesamiento y plegado correctos de la proteína madura.

En muchos casos ha resultado que las células transducidas y transfectadas in vivo que se supone que secretan un factor terapéutico no secretan el factor terapéutico en cantidades terapéuticamente suficientes y durante un tiempo suficiente. Esto también puede ser un problema en la terapia génica ex vivo en la que las células se transfectan o transducen fuera del organismo y se insertan en el paciente tras la modificación genética.

La técnica anterior no proporciona mucha información con respecto al acoplamiento del péptido señal con proteínas heterólogas en mamíferos. Para la expresión heteróloga de proteínas de mamífero en hongos o levaduras, es una práctica común sustituir el péptido señal de mamífero por uno que es funcional en la especie productora.

El documento 2004/094592 describe la expresión de un polipéptido que comprende un péptido señal de albúmina o un péptido señal de hormona de crecimiento unido a una neublastina truncada en el extremo N-terminal de 104 residuos de aminoácido (NBN 104) y en la que el polipéptido carece de la pro-región de neublastina.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido de neublastina biológicamente activo, que comprende cultivar una célula que comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en el que dicha secuencia de nucleótidos no codifica para una pro-región de neublastina.

El polipéptido de pre-pro-neublastina nativa humana tiene 220 aminoácidos de longitud (figura 17A) (SEQ ID NO: 10). El péptido señal de neublastina consiste en 39 aminoácidos, empezando con metionina en la posición 1 y terminando con alanina en la posición 39 (figura 17B). El pro-dominio de longitud completa más largo de neublastina consiste en 69 aminoácidos, empezando con serina en la posición 40 y terminando con arginina en la posición 107 (figura 17C). Un polipéptido de neublastina madura consiste en los 113 aminoácidos C terminales, empezando con alanina en la posición 108 y terminando con glicina en la posición 220. La pre-pro-Neublastina contiene varios sitios de escisión pro-propéptido posibles y la expresión de pre-pro-neublastina en células de mamífero da como resultado la secreción de una variedad de péptidos maduros, formas posibles que consisten en los 140, 113, 107 y 104 aminoácidos C-terminales. Para cada una de estas formas maduras existe un pro-dominio correspondiente constituido por los aminoácidos desde la posición 40 hasta la posición anterior al primer residuo en la proteína madura.

La presente invención proporciona una solución al problema de ausencia casi completa de secreción del factor neurotrófico, incluyendo neublastina, frecuentemente experimentada tras la transducción de células de mamífero con vectores virales tanto in vivo como in vitro. También se observa el fenómeno para vectores de expresión basados en plásmidos. Por algunas razones desconocidas, se bloquea frecuentemente en las células de mamífero la secreción del factor neurotrófico codificado por el vector. Una explicación posible podría ser que el procesamiento correcto de las proteínas secretadas es específico de la célula. Esto representa un grave problema en el uso de terapia génica con vector viral. Actualmente, la terapia génica con vectores virales se considera el método más preferido (si no el único relevante) para terapia génica in vivo o ex vivo debido a que los vectores virales garantizan la integración estable en el genoma de la célula transducida.

La invención proporciona la expresión eficaz de una neublastina humana madura, o un truncamiento biológicamente activo de una neublastina humana madura, es decir, un polipéptido secretado de neublastina, como una pre-proteína, en vez de como una pre-pro-proteína. Una pre-proteína de neublastina según la invención comprende generalmente dos componentes: un polipéptido secretado de neublastina (como se definió anteriormente) y una secuencia señal heteróloga.

Además, los presentes inventores han mostrado que mediante la sustitución del péptido señal nativo de neublastina por un péptido señal alternativo a partir de otras proteínas, tal como a partir de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina, la secreción de neublastina se potencia adicionalmente, especialmente a partir de las células transducidas.

Además, los presentes inventores han mostrado que mediante la eliminación de la secuencia de nucleótidos que codifica para la pro-región de la secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido señal así como el polipéptido de neublastina, es posible entonces expresar y tener una mayor cantidad de neublastina secretada, que si se incluyera la pro-región.

Se ha encontrado que aunque la pro-región es necesaria para que se plieguen correctamente muchas proteínas, es posible producir un polipéptido de neublastina biológicamente activo sin una pro-región.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido señal y el polipéptido de neublastina, al vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos, a una composición farmacéutica que comprende el vector según la invención y uno o más adyuvantes, excipientes, vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica puede utilizarse para terapia génica in vivo y ex vivo.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una célula huésped aislada transducida o transfectada con el vector según la invención.

Ha resultado que tales células huésped genéticamente modificadas producen cantidades inesperadamente elevadas de neublastina en comparación con las células transducidas o transfectadas con vectores que codifican...

1. Ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido que comprende un polipéptido de neublastina y un péptido señal seleccionado del grupo que consiste en un péptido señal de albúmina y un péptido señal de hormona de crecimiento, en el que el polipéptido carece de la pro-región de neublastina y el polipéptido de neublastina es distinto de NBN104 (SEQ ID NO. 19).

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el péptido señal es péptido señal de albúmina de rata.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el péptido señal es péptido señal de hormona de crecimiento humana.

4. Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido de neublastina es al menos el 85% idéntico a la SEQ ID NO: 20, preferiblemente al menos el 90% idéntico a la SEQ ID NO: 20, más preferiblemente al menos el 95% idéntico a la SEQ ID NO: 20.

5. Vector de expresión que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Célula aislada que comprende el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el vector según la reivindicación 5.

7. Célula según la reivindicación 6, siendo la célula una célula de mamífero, seleccionada del grupo que consiste en células de ovario de hámster chino (CHO), células HEK293, células COS, células PC12, células HiB5, células RN33b, células de fibroblastos inmortalizados, células C2C12, células HeLa, células HepG2, líneas celulares de RPE, células ARPE-19, células RPE, células neuronales, células precursoras neuronales, células madre y células fetales.

8. Dispositivo implantable de cultivo celular, comprendiendo el dispositivo:

9. Dispositivo según la reivindicación 8, en el que la membrana semipermeable es inmunoaislante.

10. Dispositivo según la reivindicación 8, en el que el dispositivo comprende además una matriz dispuesta dentro de la membrana semipermeable.

11. Dispositivo según la reivindicación 8, en el que el dispositivo comprende además un punto de anclaje.

12. Método de expresión de un polipéptido de neublastina, comprendiendo el método cultivar la célula según la reivindicación 6 ó 7 en un medio de cultivo celular en condiciones para que el polipéptido de neublastina se exprese y secrete en el medio de cultivo celular.

13. Método según la reivindicación 12, que comprende además recuperar dicho polipéptido de neublastina de dicho medio de cultivo celular.

14. Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o vector según la reivindicación 5, o célula según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para uso como medicamento.

15. a) Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o

b) vector según la reivindicación 5, o

c) célula según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o

d) dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11,

para uso en un método de tratamiento de un trastorno del sistema nervioso.

16. Ácido nucleico, vector, célula o dispositivo según la reivindicación 15, en el que el trastorno del sistema nervioso se selecciona del grupo que consiste en neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático, lesión de la médula espinal, avulsión de la raíz espinal, tic doloroso y causalgia.

17. a) Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o

b) vector según la reivindicación 5, o

c) célula según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o

d) dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11,

para uso en un método de tratamiento de una enfermedad ocular seleccionada del grupo que consiste en heridas y úlceras corneales y retinopatías.