AISLAMIENTO DE INMUNOGLOBULINAS.

Un método para aislar inmunoglobulinas a partir de una solución que contiene una o varias inmunoglobulinas,

que comprende las siguientes operaciones:

a) poner en contacto la solución que contiene una o varias inmunoglobulinas que tiene un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0, y un contenido total en sales correspondiente a una fuerza iónica de como máximo 2,0, con una matriz en fase sólida que comprende un esqueleto de la matriz funcionalizado que es portador de una pluralidad de grupos funcionales con la fórmula siguiente M-SP1-L en donde M designa el esqueleto de la matriz, SP1 designa un espaciador, L designa un ligando que comprende un resto aromático o heteroaromático, opcionalmente sustituidos con un monociclo o un biciclo, con la condición de que el peso molecular del ligando -L sea como máximo 500 Dalton, en donde el resto aromático o heteroaromático o SP1 es portador de un grupo ácido, y en donde la concentración del ligando está en el intervalo de 10-120mimol/ml de matriz en fase sólida hidratada y sedimentada, con la condición adicional de que se cumplan los criterios de (i) e (ii), o los criterios de (ii) e (iii):

(i) la matriz en fase sólida tiene una eficacia de la unión de al menos el 50%, cuando se somete a ensayo con un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0 en el "Ensayo convencional de la unión de inmunoglobulinas" descrito en esta memoria, o

(ii) la matriz en fase sólida tiene una eficacia de la unión promedio de al menos 60%, para todas las inmunoglobulinas sometidas a ensayo en el "Ensayo de la unión a una matriz de anticuerpos monoclonales" cuando se somete a ensayo con un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0, o

(iii) la estabilidad de la matriz en fase sólida en NaOH 1 M es de tal modo, que la incubación de la matriz en NaOH 1 M en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 7 días, reduce la eficacia de la unión, a un pH en el intervalo desde una unidad de pH inferior al valor de pH máximo de la unión, hasta una unidad de pH superior al valor de pH máximo de la unión, tal y como se determina en el "Ensayo convencional de la unión de inmunoglobulinas", descrito en esta memoria, en menos del 25%, comparada con una matriz sin tratar correspondiente, o de este modo al menos una parte de las inmunoglobulinas queda unida a la matriz en fase sólida; y

b) separar la matriz en fase sólida que tiene inmunoglobulinas unidas a la misma, de la solución; y

c) opcionalmente, lavar la matriz en fase sólida; y

d) poner en contacto la matriz en fase sólida con un eluyente para liberar una o varias de las inmunoglobulinas de la matriz en fase sólida

Aislamiento de inmunoglobulinas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para aislar o purificar inmunoglobulinas a partir de diferentes materias primas y a matrices en fase sólida para el mismo.

Antecedente de la invención

Las inmunoglobulinas -o los anticuerpos- constituyen una clase muy importante de proteínas que están presentes en diferentes fluidos corporales de mamíferos, de aves y de peces y que actúan como agentes protectores del animal contra sustancias, bacterias y virus que desafían al animal. Las inmunoglobulinas están presentes típicamente en la sangre, la leche y la saliva de animales, así como en otros fluidos corporales y secreciones.

La actividad biológica, que poseen las inmunoglobulinas, se explota en la actualidad en un abanico de diferentes aplicaciones en el diagnóstico humano y veterinario, en el sector sanitario y en el terapéutico.

Diagnósticos

Los anticuerpos se han aplicado durante muchos años como una herramienta analítica importante en relación con la detección y la cuantificación de una amplia variedad de sustancias relevantes en el diagnóstico de enfermedades y que tienen una importancia en aumento en áreas tales como el control de calidad de productos alimenticios, el control medioambiental, el abuso de fármacos y la vigilancia y el control de procesos industriales.

Para estos fines, los anticuerpos deseados se pueden producir mediante hiperinmunización de animales hospedadores adecuados, tales como conejos y ovejas o, alternativamente, produciendo anticuerpos monoclonales en cultivos de células de hibridoma.

Después de la producción primaria de los anticuerpos en un animal hospedador o en un cultivo celular, el anticuerpo se aísla típicamente de la masa de las otras sustancias en la materia prima, mediante un cierto tipo de procedimiento de aislamiento. Este es necesario para evitar la interferencia de estas otras sustancias con la actividad del anticuerpo, en la aplicación analítica.

Aplicaciones sanitarias y terapéuticas

La inmunización pasiva mediante inyección intramuscular de concentrados de inmunoglobulina es una aplicación bien conocida para la protección temporal contra enfermedades infecciosas, que se aplica típicamente cuando una persona está viajando de una parte del mundo a la otra. El éxito de este tipo de tratamiento en los seres humanos, se está siguiendo ahora en el campo veterinario, en donde se está aplicando y desarrollando la inmunización pasiva de ganado, caballos, cerdos y pollos recién nacidos, para mejorar la tasa de supervivencia de estos animales durante sus primeras semanas de vida. Una cuestión importante en este campo, es por supuesto el coste de tal tratamiento, que depende en un alto grado del coste de la producción del concentrado de inmunoglobulina.

Material aislado de inmunoglobulinas animales, p. ej., de la leche bovina, también se está investigando como un producto sanitario oral o incluso terapéutico, para evitar o tratar infecciones gastrointestinales, p. ej., en pacientes con SIDA. Para tales aplicaciones, tanto el grado de pureza del producto como el coste, tienen gran importancia.

Una aplicación más sofisticada de los anticuerpos para uso terapéutico, se basa en los denominados "fármacos dirigidos hacia una diana", en donde los fármacos muy potentes se enlazan covalentemente con anticuerpos que tienen unas afinidades de unión específicas, hacia células específicas en el organismo humano, p. ej., células cancerosas. Esta técnica asegura que el fármaco esté concentrado en las células enfermas, proporcionando un efecto máximo del fármaco, sin los graves efectos secundarios que tienen lugar con frecuencia al usar la quimioterapia. Para tales fines, los anticuerpos tienen que estar controlados muy cuidadosamente y tener una alta pureza, y el modo típico de realizar la producción primaria es o bien produciendo anticuerpos monoclonales en un cultivo de células de hibridoma, o fermentando bacterias modificadas genéticamente, p. ej., E. coli.

Aislamiento de inmunoglobulinas

Todas las aplicaciones de las inmunoglobulinas mencionadas anteriormente, requieren un cierto tipo de aislamiento del anticuerpo a partir de la materia prima bruta, pero cada tipo de aplicación tiene sus propios requerimientos muy variados, en relación con la pureza final y los costes admisibles para el producto del anticuerpo.

Generalmente, existe una amplia gama de métodos diferentes disponibles para el aislamiento de las inmunoglobulinas, que proporcionan una amplia gama de purezas finales, de rendimientos y de costes del producto.

Los métodos tradicionales para el aislamiento de inmunoglobulinas se basan en una precipitación reversible y selectiva de la fracción proteica que comprende las inmunoglobulinas, cuando se separan de otros grupos de proteínas en la solución. Siendo los agentes de precipitación típicos, etanol, polietilenglicol, sales liotrópicas (anti-caotrópicas), tales como sulfato de amonio y fosfato potásico, y ácido caprílico.

Típicamente, estos métodos de precipitación proporcionan productos muy impuros, y al mismo requieren mucho tiempo y son laboriosos. Además, la adición del agente precipitante a la materia prima, dificulta el uso del material sobrenadante para otros fines y crea un problema de eliminación. Esto es particularmente relevante cuando se trata de una purificación de inmunoglobulinas a gran escala, p. ej., a partir del suero y del plasma.

La cromatografía de intercambio iónico es otro método bien conocido para el fraccionamiento de proteínas, que se emplea con frecuencia para aislar inmunoglobulinas. Sin embargo, este método no es aplicable generalmente debido a las restricciones en la fuerza iónica y el pH, que son necesarios para asegurar una unión eficaz del anticuerpo, junto con los puntos isoeléctricos que varían de diferentes inmunoglobulinas.

La cromatografía de afinidad de la proteína A y la proteína G son métodos muy populares y extendidos para el aislamiento y la purificación de inmunoglobulinas, particularmente para el aislamiento de anticuerpos monoclonales, debido principalmente a la facilidad de empleo y a la alta pureza obtenida. Aunque es popular, sin embargo se reconoce que la proteína A y la proteína G plantean otros problemas al usuario, siendo algunos de ellos: el coste muy elevado, una eficacia de la unión variable de los diferentes anticuerpos monoclonales (particularmente la IgG₁ de ratón), la fuga de Proteína A/Proteína G en el producto, y una estabilidad baja de la matriz con soluciones limpiadoras típicas, p. ej., hidróxido sódico 1 M. Cada uno de estos inconvenientes tiene su consecuencia específica en la aplicación individual, variando desde consecuencias insignificantes a consecuencias muy graves y costes prohibitivos.

La cromatografía hidrófoba es también un método ampliamente descrito para el aislamiento de inmunoglobulinas, p. ej., en la "Application Note 210, BioProcess Media" publicada por Pharmacia LKB Biotechnology, 1991. En esta referencia, se describe un producto del estado de la técnica, "fenil Sepharose de alto rendimiento", con el fin de purificar anticuerpos monoclonales a partir del material sobrenadante de cultivos celulares. Igual que con otras matrices hidrófobas empleadas hasta la fecha, es necesario añadir sales liotrópicas a la materia prima para que la unión de la inmunoglobulina sea eficaz. El anticuerpo unido se libera de la matriz disminuyendo la concentración de sal liotrópica en un gradiente continuo o escalonado. Se recomienda combinar la cromatografía hidrófoba con otra etapa, si se desea un producto muy puro.

La desventaja de este procedimiento es la necesidad de añadir sal liotrópica a la materia prima, ya que ésta plantea un problema de eliminación y, por tanto, un coste incrementado para el usuario a gran escala. Para otras materias primas diferentes al material sobrenadante de cultivos celulares, tales como lactosuero, plasma y yema de huevo, la adición de sales liotrópicas a las materias primas, sería en muchos casos prohibitiva en aplicaciones a gran escala, ya que la sal evitaría cualquier uso económicamente factible de materia prima pobre en inmunoglobulina, junto con el problema de la eliminación de varios miles de litros de desecho.

La cromatografía tiofílica por adsorción fue introducida por J. Porath en 1985 (J. Porath y col.; FEBS Letters, volumen. 185, pág. 306, 1985) como un nuevo principio de adsorción cromatográfico para el aislamiento de inmunoglobulinas....

1. Un método para aislar inmunoglobulinas a partir de una solución que contiene una o varias inmunoglobulinas, que comprende las siguientes operaciones:

a) poner en contacto la solución que contiene una o varias inmunoglobulinas que tiene un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0, y un contenido total en sales correspondiente a una fuerza iónica de como máximo 2,0, con una matriz en fase sólida que comprende un esqueleto de la matriz funcionalizado que es portador de una pluralidad de grupos funcionales con la fórmula siguiente

M-SP1-L

en donde M designa el esqueleto de la matriz, SP1 designa un espaciador, L designa un ligando que comprende un resto aromático o heteroaromático, opcionalmente sustituidos con un monociclo o un biciclo, con la condición de que el peso molecular del ligando -L sea como máximo 500 Dalton,

en donde el resto aromático o heteroaromático o SP1 es portador de un grupo ácido, y en donde la concentración del ligando está en el intervalo de 10-120 µmol/ml de matriz en fase sólida hidratada y sedimentada,

con la condición adicional de que se cumplan los criterios de (i) e (ii), o los criterios de (ii) e (iii):

        (i)        la matriz en fase sólida tiene una eficacia de la unión de al menos el 50%, cuando se somete a ensayo con un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0 en el "Ensayo convencional de la unión de inmunoglobulinas" descrito en esta memoria, o

        (ii)        la matriz en fase sólida tiene una eficacia de la unión promedio de al menos 60%, para todas las inmunoglobulinas sometidas a ensayo en el "Ensayo de la unión a una matriz de anticuerpos monoclonales" cuando se somete a ensayo con un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0, o

        (iii)        la estabilidad de la matriz en fase sólida en NaOH 1 M es de tal modo, que la incubación de la matriz en NaOH 1 M en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 7 días, reduce la eficacia de la unión, a un pH en el intervalo desde una unidad de pH inferior al valor de pH máximo de la unión, hasta una unidad de pH superior al valor de pH máximo de la unión, tal y como se determina en el "Ensayo convencional de la unión de inmunoglobulinas", descrito en esta memoria, en menos del 25%, comparada con una matriz sin tratar correspondiente, o

de este modo al menos una parte de las inmunoglobulinas queda unida a la matriz en fase sólida; y

b) separar la matriz en fase sólida que tiene inmunoglobulinas unidas a la misma, de la solución; y

c) opcionalmente, lavar la matriz en fase sólida; y

d) poner en contacto la matriz en fase sólida con un eluyente para liberar una o varias de las inmunoglobulinas de la matriz en fase sólida.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde L se selecciona entre radicales que tienen la siguiente fórmula:

- X-A-SUB

en donde X designa -O-, -S- o -NH-; A designa un anillo o un sistema de anillos aromáticos o heteroaromáticos; y SUB designa unos o varios sustituyentes.

3. Un método según la reivindicación 2, en donde SUB comprende al menos un sustituyente con la siguiente fórmula:

-SP2-ACID

en donde SP2 designa un segundo espaciador opcional y ACID designa un grupo ácido.

4. Un método según la reivindicación 3, en donde SP2 designa alquileno-C_1-6, alquenileno-C_2-6, o un enlace simple.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde A es un radical aromático seleccionado entre radicales de benceno y radicales de naftaleno.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde A es un resto heteroaromático seleccionado entre radicales heteroaromáticos monocíclicos seleccionados a partir de tiofeno, furano, pirano, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina y radicales de piridazina; y radicales heteroaromáticos bicíclicos, tales como indol, purina, quinolina, benzofurano, bencimidazol, benzotiazol y radicales de benzoxazol.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde A se selecciona entre radicales de piridina, radicales de bencimidazol, benzo-tiazol y benzoxazol.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el grupo ácido se selecciona entre un grupo de ácido carboxílico (-COOH), un grupo de ácido sulfónico (-SO₂OH), un grupo de ácido sulfínico (-S(O)OH), un grupo de ácido fosfínico (-PH(O)(OH)), grupos monoésteres de ácido fosfónico (-P(O)(OH)(OR)), y un grupo de ácido fosfónico (-P(O)(OH) ₂).

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde L es un grupo aromático o heteroaromático (radical) con los tipos siguientes como grupos funcionales: ácidos benzoicos, tales como ácidos 2-aminobenzoicos, ácidos 3-aminobenzoicos, ácidos 4-aminobenzoicos, ácidos 2-mercaptobenzoicos, ácido 4-amino-2-clorobenzoico, ácido 2-amino-5-clorobenzoico, ácido 2-amino-4-clorobenzoico, ácidos 4-aminosalicílicos, ácidos 6-aminosalicílicos, ácidos 3,4-diaminobenzoicos, ácido 3,5-diaminobenzoico, ácido 5-aminoisoftálico, ácido 4-aminoftálico; ácidos cinámicos, tales como ácidos hidroxi-cinnámicos; ácidos nicotínicos, tales como ácidos 2-mercaptonicotínicos; ácidos naftoicos, tales como ácido 2- hidroxi-1-naftoico; quinolinas, tales como 2-mercaptoquinolina; ácidos tetrazolacéticos, tales como ácido 5-mercapto-1-tetrazolacético; tiadiazoles, tales como 2-mercapto-5-metil-1,3,4-tiadiazol; bencimidazoles, tales como 2-amino-bencimidazol, 2-mercaptobencimidazol y 2-mercapto-5-nitro-bencimidazol; benzotiazoles, tales como 2-aminobenzotiazol, 2-amino-6-nitrobenzotiazol, 2-mercaptobenzotiazol y 2-mercapto-6-etoxibenzotiazol; benzoxazoles, tales como 2-mercaptobenzoxazol; tiofenoles, tales como tiofenol y 2-aminotiofenol; ácido 2-(4-aminofeniltio)acético; ácidos sulfónicos y ácidos fosfónicos aromáticos o heteroaromáticos, tales como ácido 1-amino-2-naftol-4-sulfónico y fenoles, tales como 2-amino-4-nitrofenol.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el contenido total en sales de la solución que contiene las inmunoglobulinas, se corresponde con una fuerza iónica en el intervalo de 0,05 a 2,0.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución que contiene las inmunoglobulinas comprende sales liotrópicas en una concentración de cómo máximo 0,4 M.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el eluyente empleado (operación (d)) comprende menos de 10% (v/v) de disolventes orgánicos.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el lavado de la fase sólida (operación (c)) comprende lavar con solución acuosa que comprende un detergente cargado negativamente.

14. Un método según la reivindicación 13, en donde el lavado de la matriz en fase sólida (operación (c)) comprende lavar con un tampón de sales inorgánicas u orgánicas que comprende un detergente cargado negativamente.

15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución que contiene las inmunoglobulinas comprende un detergente cargado negativamente.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde SP1 designa un espaciador que comprende un grupo ácido.

17. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución que contiene una o varias inmunoglobulinas tiene un pH en el intervalo de pH 3-7.

18. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el peso molecular del brazo ligando-espaciador (SP1-L) es como máximo 300 Dalton.

19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde A es un radical aromático seleccionado entre el grupo consistente en un radical benceno, tal como fenilo, 1,2-fenileno, 1,3-fenileno, 1,4-fenileno, 1,2,3-benzotriilo, 1,2,4-benzotriilo, 1,3,5-benzotriilo, 1,2,3,4-benzotetrailo, 1,2,3,5-benzotetrailo, 1,2,4,6-benzotetrailo y 1,2,3,4,5-benzopentailo.

20. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde L se selecciona entre el grupo consistente en ácidos aminobenzoicos, tales como ácido 2-amino-benzoico; ácido 2-mercapto-benzoico; ácido 3-amino-benzoico, ácido 4-amino-benzoico; ácido 4-amino-2-clorobenzoico; ácido 2-amino-5-clorobenzoico; ácido 2-amino-4-clorobenzoico; ácidos 4-aminosalicílicos; ácidos 5-aminosalicílicos; ácidos 3,4-diaminobenzoicos; ácido 3,5-diaminobenzoico; ácido 5-aminoisoftálico; y ácido 4-aminoftálico.

21. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde L se obtiene a partir del grupo de compuestos heteroaromáticos que comprenden un ácido carboxílico y un grupo amino como sustituyente, tal como ácido 2-amino-nicotínico, ácido 2-mercapto-nicotínico, ácido 6-amino-nicotínico o ácido 2-amino-4-hidroxipirimidin-carboxílico.

22. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el grupo ácido tiene un valor de pK_a en el intervalo de 1,0-6,0.

23. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el espaciador SP1 se selecciona entre birradicales alifáticos de cadena corta, de fórmula -CH₂-CH(OH)-CH₂- (obtenido a partir de epiclorohidrina), -(CH₂)₃-O-CH₂-CH(OH)-CH₂- (obtenido a partir de éter glicidílico de alilo) o -CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(CH₂)₄-O-CH₂-CH(OH)-CH₂- (obtenido a partir de éter diglicidílico de butanodiol).