Virus de la gripe recombinantes para vacunas y terapia génica.

Una célula puesta en contacto con una pluralidad de vectores del ortomixovirus,

que comprende:

(i) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB1 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB2 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de HA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(v) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NP del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de M del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(viii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NS del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ix) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PA de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(x) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB1 de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB2 de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y

(xii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NP de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción

en donde dicha célula expresa dicho ortomixovirus.

Virus de la gripe recombinantes para vacunas y terapia génica Antecedentes de la invención

La capacidad para generar virus de ARN infecciosos a partir de ADNc clonados ha contribuido en gran medida al conocimiento biológico de estos patógenos y, por tanto, a mejorar los procedimientos de control de enfermedades (Palese y col., 1996). Sin embargo, este progreso ha sido relativamente limitado para los virus de ARN con sentido negativo en comparación con los virus de ARN con sentido positivo, ya que ni el ARN viral (ARNv) genómico ni el ARN complementario antigenómico (ARNc) de virus de ARN con sentido negativo pueden servir como molde directo para la síntesis de proteínas. Más bien, el ARNv, tras su encapsulación por nucleoproteínas (NP) virales, debe transcribirse a ARNm con sentido positivo mediante el complejo de la ARN polimerasa viral. Por tanto, la unidad mínima de replicación está formada por el ARNv genómico formando complejo con las NP y las proteínas de la polimerasa. A pesar de estos obstáculos, se han establecido procedimientos de genética inversa para producir virus de ARN con sentido negativo no segmentados, incluyendo el virus de la rabia (Snell y col., 1994), virus de la estomatitis vesicular (Lawson y col., 1995; Whelan y col., 1995), virus del sarampión (Radecke y col., 1995), virus respiratorio sincitial (Collins y col., 1995), virus Sendai (Garcin y col., 1995; Kato y col., 1996), virus de la peste bovina (Barón y col., 1997), virus de la parainfluenza humana de tipo 3 (Hoffman y col., 1997) y SV5 (He y col., 1997).

Las familias Orthomyxovirídae, Arenavirídae y Bunyaviridae contienen genomas de ARN con cadena negativa segmentado e incluyen varios patógenos humanos y animales, por ejemplo, los virus de la gripe de tipos A, B y C (Orthomyxovirídae), virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (Arenavirídae) y virus de la encefalitis y de la fiebre hemorrágica (Bunyaviridae, Arenavirídae). Sus genomas están compuestos de dos (Arenavirídae), tres (Bunyaviridae) o de seis a ocho (Orthomyxovirídae) moléculas de ARN de cadena sencilla de polaridad negativa (complementarias al ARNm). Los ARNv interaccionan con NP y con la ARN polimerasa dependiente de ARN viral para formar complejos ribonucleoproteína (RNP). Los RNP se rodean de una bicapa lipídica derivada de la célula hospedadora. En esta envuelta se insertan glucoproteínas virales, que esencialmente son para la unión al receptor y la entrada en la célula hospedadora. De este modo, la generación de virus de ARN con sentido negativo segmentado a partir de ADNc clonado supone un desafío formidable, ya que tiene que producirse un ARNv separado para cada segmento génico.

Bridgen y Elliott (1996) produjeron un virus Bunyamwera (familia Bunyaviridae) a partir de ADNc clonado que codificaba tres segmentos del ARNv con sentido positivo antigenómico. Sin embargo, la eficacia de recuperación del virus era baja. Ninguno de los ortomixovirus, que contienen seis (thogotovirus), siete (virus de la gripe C) u ocho (virus de la gripe A y B) segmentos de ARN con sentido negativo se han producido por completo a partir de ADNc clonado. Esta demora en el progreso se ha dejado notar más intensamente en los esfuerzo para controlar las infecciones por el virus de la gripe.

Palese y colaboradores (Enami y col., 1990) han sido pioneros en sistemas de genética inversa dependientes de virus auxiliares para el virus de la gripe A (Figura 1A). En sus aproximaciones, los complejos RNP se generan mediante la síntesis del ARNv in vitro en presencia de polimerasa purificada y de proteínas NP y, a continuación, se utilizan para transfectar células eucariotas. La infección posterior con el virus auxiliar de la gripe A da lugar a la generación de virus que poseen un gen derivado del ADNc clonado. Un segundo procedimiento, desarrollado por Neumann y col. (1994), se basa en la síntesis in vivo de ARNv mediante la ARN polimerasa I (Figura 1B), una enzima celular que transcribe el ARN ribosómico que carece tanto de la caperuza 5 como de la cola poli A 3. Las células infectadas con el virus de la gripe y transfectadas con un plásmido que contiene el ADNc del virus de la gripe clonado, flanqueado por las secuencias promotora y terminadora de la ARN polimerasa I murina, condujeron a la producción de virus transfectantes. Sin embargo, con ambos procedimientos deben seleccionarse transfectantes a partir de un extenso fondo de virus auxiliares, lo que requiere un potente sistema de selección y complica la generación de virus con crecimiento defectuoso.

Mena y col. (1996) desarrollaron un sistema para generar partículas similares a virus (PSV) incompetentes para la replicación, en el que se transcribe in vitro un gen indicador que codifica un ARNv similar al virus de la gripe y se transfecta en células eucarióticas. Todas las diez proteínas del virus de la gripe se expresan a partir de plásmidos bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa T7. Cuando las células transfectadas se infectan con un virus de la variolovacuna recombinante que expresa la ARN polimerasa T7, producen PSV de la gripe. Sin embargo, la eficacia del sistema es baja: en el 25 % de los experimentos, los investigadores no consiguieron detectar una expresión del gen indicador. Además, el virus de la variolovacuna expresa más de 80 proteínas, cualquiera de las cuales podría afectar al ciclo vital del virus de la gripe.

Por tanto, lo que es necesario es un procedimiento para preparar virus de ARN con cadena negativa segmentado, por ejemplo, ortomixovirus, tales como los virus de la gripe A, completamente a partir de ADNc clonados.

Resumen

La presente invención se refiere a las realizaciones como se define en las reivindicaciones. En particular, la

invención se refiere a una célula puesta en contacto con una pluralidad de vectores del ortomlxovirus, que comprende:

(I) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB1 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB2 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de HA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(v) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NP del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de M del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(viii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NS del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ix) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PA de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(x) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB1 de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB2 de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y

(xii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NP de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción

en la que dicha célula expresa el ortomixovirus. La invención se refiere adicionalmente a una célula puesta en contacto con una pluralidad de vectores del ortomixovirus que comprende:

(i) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB1 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB2 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a ADNc de HA... [Seguir leyendo]

1. Una célula puesta en contacto con una pluralidad de vectores del ortomixovirus, que comprende:

(i) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB1 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB2 del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de HA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(v) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NP del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NA del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de M del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(viii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NS del virus de la gripe unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ix) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PA de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(x) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB1 de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB2 de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y

(xii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NP de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción

en donde dicha célula expresa dicho ortomixovirus.

2. La célula según la reivindicación 1, en la que la célula se pone en contacto adicionalmente con una pluralidad de vectores del ortomixovirus, que comprende:

(xiii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido HA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xiv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido M1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xvi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido M2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y

(xvii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NS2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción

en donde dicha célula expresa dicho ortomixovirus.

3. La célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, , en donde el promotor del vector es un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor de la ARN polimerasa I, un promotor de la ARN polimerasa II, un promotor de la ARN polimerasa III, un promotor T7 y un promotor T3.

4. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el promotor del vector es un promotor de la ARN polimerasa I.

5. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el promotor del vector es un

promotor de la ARN polimerasa I humana.

6. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la secuencia de terminación de transcripción se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de terminación de la transcripción seleccionada entre una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa I, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa III y una ribozima.

7. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dos o más vectores están unidos físicamente.

8. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde uno o más vectores están en

plásmidos separados.

9. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente la etapa de introducir al menos una mutación en uno o más del ADNc de PA de la gripe, el ADNc de PB1 de la gripe, el ADNc del PB2 de la gripe, el ADNc de HA de la gripe, el ADNc de NP de la gripe, el ADNc de NA de la gripe, el ADNc de M de la gripe o el ADNc de NS de la gripe, antes de introducir el vector en las células hospedadoras.

10. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende adicionalmente la etapa de introducir al menos una mutación en el ADNc de HA de la gripe antes de introducir los vectores en las células hospedadoras.

11. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que uno o más vectores comprenden adicionalmente secuencias no codificantes 3' y 5' de un virus de la gripe.

12. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que un vector codifica un péptido inmunogénico o proteína útiles como una vacuna.

13.

mamífero.

La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que las células son células de

14. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el ADNc está en una orientación sentido.

15. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el ADNc está en una orientación antisentido.