Un método para la preparación de una vacuna contra la encefalitis Japonesa que comprende hidróxido de aluminio como adyuvante y un virus de la encefalitis Japonesa atenuado o inactivado,

caracterizado porque el método comprende realizar pases en serie del virus de la encefalitis Japonesa en células vero a temperaturas no mayores que aproximadamente 35°C.

Virus de la encefalitis Japonesa atenuado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un virus de la encefalitis Japonesa atenuado adaptado a la célula Vero por pases en célula Vero y una vacuna contra la encefalitis Japonesa que comprende dicho virus atenuado.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La encefalitis japonesa (EJ) es una enfermedad arboviral transmitida por los mosquitos de principal importancia para la salud pública en Asia. Cada año se informa de más de 35.000 casos y 10.000 muertes en ese continente, pero los informes oficiales indudablemente subestiman el número real de casos (Okuno, T. World Health Stat Q. 3: 120-31, 1.978; Umenei, T. et al. Bull World Health Org. 63: 625-31, 1.985) . La enfermedad se puede manifestar por un síndrome de dolor de cabeza febril, meningitis aséptica o encefalitis y aproximadamente la mitad de los supervivientes tiende a presentar secuelas neurológicas y psiquiátricas permanentes (Burke, D. S. et al. The Arbovirus: Epidemiology and Ecology 3: 63-92, 1.988; Monath, T. P. Virology 763-814, 1.990) .

El virus de la EJ es uno de 66 virus de ARN monocatenario con sentido positivo, con cubierta, Flaviviridae, que son en gran medida transmitidos por vectores (Chambers, T. J. et al. Ann. Rev. Microbiol. 44: 649-88, 1.990) . Morfológicamente, los flavivirus son esféricos, de aproximadamente 40 nm de diámetro, están constituidos por una bicapa lipídica que rodea a una nucleocápside que contiene genoma de 11-kb complejado con una proteína de la cápside (C) (Rice, C. M. et al. Science 229: 726-33, 1.985) . Las proyecciones superficiales en la membrana están constituidas por una cubierta (E) glicosilada y proteínas de membrana (M) . Se escinde una glicoproteína pre-M, presente en viriones nacientes intracelulares, en la proteína M, encontrada en viriones extracelulares maduros. Se asocian importantes actividades fisiológicas a la proteína E de 53-kd, incluyendo hemaglutinación, neutralización vírica, ensamblaje del virión, fusión de membranas y unión vírica a receptores celulares (Koshini, E. et al. Virol. 188: 714-20, 1.992) .

Hay tres vacunas contra la EJ para seres humanos (Tsai, T. et al. Vaccines 671-713, 1.993) . De las tres, sólo la vacuna contra la EJ inactivada producida en cerebro de ratón está disponible internacionalmente. Un fabricante, la Fundación para la Investigación de Enfermedades Microbianas de la Universidad de Osaka (Biken) produce la mayoría de la vacuna contra la EJ inactivada distribuida internacionalmente; esa vacuna fue autorizada en 1.992 en los EE.UU., donde es distribuida por Connaught Laboratories, Inc., como JE-VAX™. La vacuna contra la EJ inactivada y viva atenuada preparada en células de riñón de hámster primarias (RHP) es distribuida exclusivamente en China.

La vacuna inactivada contra la EJ producida en cerebros de ratón fue autorizada en Japón en 1.954. Debido a que se produce por inyección cerebral de ratones bebés, es laboriosa de fabricar y aumentaron las preocupaciones acerca de la posibilidad de efecto secundario neurológico relacionado con la vacuna. Aunque sucesivos refinamientos en el procedimiento de fabricación han aumentado su pureza y potencia (Oya, A. Vaccination Theor y and Practice 69-82, 1.975; Oya, A. Acta Pediatr Jpn. 30: 175-84, 1.988; Takaku, K. Biken J. 11: 25-39, 1.968) , se ha declarado una frecuencia moderada de reacciones sistémicas locales y leves hasta recientemente (Hoke, C. H. et al. New Engl J Med. 319: 608-14, 1.988; Poland, J. D. et al. J Infect Dis. 161: 878-82, 1.990; Sanchez, J. L. et al. Lancet

335: 972-73, 1.990) . Con el 20% de las vacunas tiene lugar sensibilidad, enrojecimiento y/o inflamación, local, en el sitio de la inyección. Se declaran síntomas sistémicos leves, principalmente dolor de cabeza, fiebre baja, mialgias, malestar y síntomas gastrointestinales, por el 10 a 30% de las vacunas. Un modelo aparentemente nuevo de reacciones adversas incluyendo urticaria, angioedema, insuficiencia respiratoria, eritema multiforme, eritema nodoso y trastornos neurológicos graves se ha declarado desde 1.989, principalmente entre viajeros vacunados en Australia, Europa y América del Norte (Anderson, M. M. et al. Lancet. 337: 1.044, 1.991; Ruff, T. A. et al. Lancet 228: 881-2, 1.991) . Además, en 1.992 y 1.995 Ohtaki informó de siete niños con encefalomielitis aguda diseminada (EMAD) con cambios en resonancia magnética nuclear (MRI, por sus siglas en inglés) después de vacunación contra la EJ (Ohtaki, E. et al. Pediatr Neurol. 8: 137-9, 1.992; Ohtaki, E. et al. J Neurol Neurosurg Psychiatr y 59: 316-7, 1.995) . También hay que observar que la vacunación con vacunas contra la rabia que contienen tejido de cerebro animal ha causado complicaciones neurológicas graves (Plotkin, S. A. et al. Vaccines 661-2, 1.994) . Por estas razones, la OMS ha designado el desarrollo de la vacuna contra la EJ como una alta prioridad.

Más recientemente, la vacuna inactivada y viva atenuada contra la EJ de China han demostrado ser eficaces, obteniendo altos títulos de anticuerpo que neutraliza virus y confiriendo una protección sólida (Tsai, T. et al. Vaccines 671-713, 1.993) . Sin embargo, las células RHP en que se preparó la vacuna China no están homologadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para producción de vacuna vírica o autorizada para uso humano por los países desarrollados. La principal desventaja en el uso de células de hámster primarias para la producción de vacunas es la incertidumbre con respecto a la calidad de la vacuna. Incluso si se usan hámsteres sin patógenos específicos, los animales pueden llegar a estar infectados inesperadamente, siendo problemático para la producción de vacunas. Ocasionalmente una infección de este tipo podía no ser detectada durante mucho tiempo. Con estas críticas, se requieren estudios controlados adicionales de la seguridad de la vacuna para permitir la confianza teniendo en cuenta su uso extendido. Otra desventaja de la producción de vacunas a partir de células primarias es la baja proporción de recolección del virus y el alto coste sin que se permita la producción en masa.

A la vista de lo anterior, hay una necesidad de una nueva vacuna contra la EJ que se produzca en líneas celulares estándar tales como Vero o células diploides humanas que hayan sido aceptadas como sustratos para vacunas humanas, con buena eficacia de coste. Las células Vero se transforman pero las células no tumorígenas procedían de riñón de mono. La línea celular Vero es más ventajosa que cualquier otra línea celular estándar porque las células Vero se pueden adaptar más fácilmente a cultivo de células a gran escala y como una célula transformada tiene una vida infinita.

Ahora se ha encontrado que el virus de la EJ se puede cultivar en cultivo de células Vero. Se han realizado considerables esfuerzos en el campo de la vacuna contra la EJ para producir vacunas en células estándar que permitan efectuar cultivos de células en un gran volumen. Sin embargo, la caracterización del virus incluyendo estabilidad genética, rendimiento y procedimiento necesario para la comercialización de la vacuna por cultivo con células Vero nunca había satisfecho los requerimientos de vacuna humana. Debido a estos hechos y a las dificultades de trasponer un conocimiento adquirido en otros cultivos de virus a virus de la EJ, la técnica anterior no había alcanzado el éxito en el desarrollo de la vacuna contra el virus de la EJ que fuera genéticamente estable y presentara un carácter inmunogénico alto a partir de líneas celulares continuas. Entre todas estas investigaciones, ninguna ha resultado hasta el momento una nueva producción de vacunas que satisfaga el criterio mencionado en este fundamento.

La presente invención sugiere un desarrollo y una propagación de virus de la EJ en línea celular continua. Las células Vero para la producción de vacunas que superen los problemas previos en el virus de la EJ se produjeron en cerebro de ratón o en líneas celulares primarias. La presente invención también identifica la metodología desarrollada para cultivar el virus de la EJ y un procedimiento al final de la línea de producción para producción de vacunas con eficacia de coste.

Además, la presente invención identifica la metodología mejorada en las vacunas contra la EJ comercializadas previamente de las siguientes maneras.

1. Seguridad: El virus inventado no adquirió la virulencia por el cultivo de células Vero, reduciéndose los peligros de producción y permitiéndose un nivel... [Seguir leyendo]

1. Un método para la preparación de una vacuna contra la encefalitis Japonesa que comprende hidróxido de aluminio como adyuvante y un virus de la encefalitis Japonesa atenuado o inactivado, caracterizado porque el método comprende realizar pases en serie del virus de la encefalitis Japonesa en células vero a temperaturas no mayores que aproximadamente 35°C.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el virus se somete a cuatro pases en células vero.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que el virus se somete a más de cuatro pases en células vero.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que el virus se somete a hasta treinta pases en células vero.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que el método comprende inactivar el virus de la encefalitis Japonesa 15 usando un agente de inactivación.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que el método comprende un virus de la encefalitis Japonesa vivo atenuado no tratado por un agente de inactivación.

7. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el método comprende además añadir aditivos farmacéuticamente aceptables.