VECTORES NO VIRALES PARA TERAPIA GÉNICA.
Vectores no virales para terapia génica.
La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales,
que comprenden al menos un nanocuerno de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrimeros que a su vez están unidos con al menos una molécula biológicamente activa, para su uso en terapia génica y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos vectores no virales.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201031204.
Solicitante: UNIVERSIDAD CASTILLA - LA MANCHA.
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: GARCÍA MARTÍNEZ,JOAQUÍN CALIXTO, SÁNCHEZ VERDU,María Del Prado, MERINO GUIJARRO,Sonia, RODRIGUEZ LOPEZ,Julian, VÁZQUEZ FERNÁNDEZ-PACHECO,Ester, HERRERO CHAMORRO,Maria Antonia, CAMPO RODRIGO,Ana, RUBIO CARRERO,Noelia, GUERRA NAVARRO,Fco. Javier, PÉREZ MARTÍNEZ,Francisco, CE;A CALLEJO,Valentín.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K31/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos.
- A61K47/34 A61K […] › A61K 47/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos utilizados, p. ej. portadores o aditivos inertes; Agentes de direccionamiento o agentes modificadores enlazados químicamente al ingrediente activo. › Compuestos macromoleculares obtenidos por reacciones distintas a aquellas en las que intervienen solamente enlaces insaturados carbono-carbono, p. ej. poliésteres, poly(amino ácidos), polisiloxanos, polifosfacinas, copolímeros de polialquilenglicol o poloxámeros (A61K 47/10 tiene prioridad).
- A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- A61K49/00 A61K […] › Preparaciones para examen in vivo.
- A61P25/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso.
- A61P29/00 A61P […] › Agentes analgésicos, antipiréticos o antiinflamatorios que no actúan sobre el sistema nervioso central, p. ej. agentes antirreumáticos; Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs).
- A61P31/00 A61P […] › Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos.
- A61P35/00 A61P […] › Agentes antineoplásicos.
- B82Y5/00 TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES. › B82 NANOTECNOLOGIA. › B82Y USOS O APLICACIONES ESPECIFICOS DE NANOESTRUCTURAS; MEDIDA O ANALISIS DE NANOESTRUCTURAS; FABRICACION O TRATAMIENTO DE NANOESTRUCTURAS. › Nano- biotecnología o nano-medicina, p. ej. ingeniería de proteínas o administración de fármaco.
- C12N15/87 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.
PDF original: ES-2374245_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Vectores no virales para terapia génica.
Estado de la técnica anterior
El uso de vectores no virales en terapia génica es especialmente relevante, ya que la FDA ha suspendido, sine die, los ensayos clínicos usando virus (adenovirus, adenoasociados, etc) debido a que generan reacciones inmunes que han causado la muerte de algunos pacientes que participaban en dichos ensayos. Los vectores víricos poseen varios inconvenientes, tales como, inseguridad en su manejo, toxicidad, provocación de una respuesta inmune que disminuye su efectividad o falta de especificidad celular. Junto a ello, estos sistemas son rápidamente eliminados de la circulación, limitando el proceso de transfección a órganos de primer paso (pulmones, hígado y bazo).
También hay que tener en cuenta que procesos de recombinación pueden originar un virus replicante aunque el peligro es remoto. No obstante, los problemas que plantean los virus como vectores en terapia génica son serios y los ensayos clínicos de terapia génica en, por ejemplo, Estados Unidos, han sido interrumpidos recientemente por la FDA debido a la muerte de varios pacientes por fallo multiorgánico. Este tipo de graves problemas ha llevado a la búsqueda y desarrollo de alternativas al uso de los virus como vectores de material génico.
Los vectores no virales poseen una serie de ventajas con respecto a los análogos víricos: a) facilidad en la preparación (incluso a escala multigramo) y modificación, b) mayor flexibilidad con respecto al tamaño del material genético a transfectar, c) son generalmente seguros in vivo y d) no provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser administrados repetidamente.
La introducción de nanocuernos acoplados a dendrímeros polares como vehículos para la transfección génica se basa en tres factores distintos: (i) la escasez de estudios donde se desarrolla el uso de nanocuernos como vehículos para transferencia génica; (ii) los dendrímeros de PAMAM (Poly(amido amine)), especialmente los de generaciones altas, han demostrado ser tóxicos debido fundamentalmente a procesos de hemolisis y el anclaje a los nanocuernos disminuye su toxicidad y (iii) los nanocuernos son inertes químicamente lo que les confiere una alta estabilidad.
Dentro de los vectores no virales, los dendrímeros representan una de estas alternativas, ya que presentan un tamaño nanométrico, una estructura globular, una baja polidispersidad y una alta densidad funcional en la superficie con un pequeño volumen molecular.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales para su uso en terapia génica que solventan todos los problemas que se plantean en las otras vías de actuación en terapia génica. Estas ventajas son las siguientes:
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, donde dicho vector no viral comprende:
En la presente invención, se entiende por nanocuernos de carbono a: nanomateriales consistentes en tubos de grafeno enrollados en una sola capa con un diámetro de entre 2-5 nm y una longitud entre 40-50 nm. Estos tubos terminan en una estructura cónica con un ángulo de 20º. Dicho ángulo se debe a la presencia de anillos de carbono pentagonales. Los nanocuernos de carbono usualmente se agregan entre sí constituyendo lo que se conoce por sus anglicismos como dalias, buds y seeds.
Según otra realización preferida, los nanocuernos de carbono tienen un radio inferior a 10 nm, preferiblemente inferior a 6 nm. Los nanocuernos son solo monocapa, no existiendo en la actualidad bi- o multicapas.
Según otra realización preferida, los nanocuernos de carbono tienen una longitud inferior a 50 nm, siendo el diámetro de las dalias de nanocuernos (asociación de nanocuernos) igual o menor de 150 nm.
Según otra realización preferida, los nanocuernos de carbono están cortados en las puntas y/o en su capa exterior, donde se entiende por nanocuernos cortados a aquellos cuya longitud es menor de la inicial ya que se tratan mediante el uso de medio ácido fuerte y calefacción originando grupos carboxílicos y un corte indiscriminado de los nanocuernos. El corte da lugar a que los nanocuernos se funcionalicen preferentemente en las puntas (es decir, los extremos) de los nanocuernos pero también en la capa exterior de los mismos.
Según otra realización preferida, las nanocuernos de carbono y los dendrímeros están enlazados químicamente mediante enlaces covalentes.
En la presente invención se entiende por dendrímero a una macromolécula tridimensional de construcción arborescente. Los dendrímeros forman parte de los polímeros, pero su diferencia radica en que la distribución de las moléculas que constituyen a los polímeros lineales es probabilística, en tanto que en el caso de los dendrímeros, se tiene una estructura química precisa, donde los enlaces químicos entre los átomos pueden ser descritos con exactitud. Las macromoléculas dendriméricas presentan una forma de crecimiento generacional, G0, G1, G2.
En la presente invención se entiende por dendrón una macromolécula con estructura dendrítica y cuyos posteriores acoplamientos a otros dendrones o núcleos constituirán el dendrímero en su totalidad.
Según otra realización preferida, el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster presentes en la superficie de los nanocuernos de carbono, preferiblemente mediante un enlace de tipo amida.
Según otra realización preferida, el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la superficie de los nanocuernos de carbono.
Según otra realización preferida los dendrones y/o dendrímeros comprenden desde 0 a 8 generaciones, preferiblemente de 2 a 6 generaciones. Cuando el dendrímero es de generación 0 (G0) se denomina dendrón. En la presente invención se entiende por generación a las etapas del crecimiento de un dendrímero.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros tienen un peso molecular comprendido entre 300 y 100.000 g/mol, preferiblemente entre 1.000 y 10.000 g/mol.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros tienen un diámetro comprendido entre 5 a 140 Å, preferiblemente tienen un diámetro comprendido entre 10 y 70 Å.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros comprenden entre 2 y 1.024 grupos de superficie, preferiblemente entre 4 y 260 grupos de superficie.
En la presente invención se entiende por grupo de superficie a: grupos amino, grupos ácido carboxílico, grupos éster, grupos hidroxilo, grupos alquílicos, grupos amino cuaternizados u otras estructuras como pudieran ser aminoácidos o polietilenglicol.
Según otra realización preferida, los grupos de superficie de los dendrones y/o dendrímeros son grupos amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están protonadas a un pH inferior a 6.
Según otra realización preferida, la relación carga/masa de los dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0,1 a 10 mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero.
Según otra realización preferida, los dendrones y/o dendrímeros son solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes como después... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Uso de un vector no viral, donde el vector no viral comprende:
para la elaboración de un medicamento para terapia génica.
2. El uso según la reivindicación anterior, donde el nanocuerno de carbono tiene un radio inferior a 10 nm, preferiblemente inferior a 6 nm.
3. El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono tiene una longitud inferior a 50 nm siendo el diámetro de las dalias de nanocuernos igual o menor de 150 nm.
4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono está cortado en las puntas y/o en su capa exterior.
5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono y los dendrones y/o dendrímeros están enlazados químicamente mediante enlaces covalentes.
6. El uso según la reivindicación anterior, donde el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster presentes en la superficie del nanocuerno de carbono.
7. El uso según la cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde el nanocuerno de carbono y los dendrones y/o dendrímeros están enlazados mediante un enlace de tipo amida.
8. El uso según la reivindicación anterior, donde el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la superficie del nanocuerno de carbono.
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden desde 0 a 8 generaciones.
10. El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden de 2 a 6 generaciones.
11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un peso molecular comprendido entre 300 y 100.000 g/mol, preferiblemente entre 1.000 y 10.000 g/mol.
12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre 5 y 140 Å.
13. El uso según la reivindicación anterior, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre 10 y 70 Å.
14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero comprende entre 2 y 1.024 grupos de superficie.
15. El uso según la reivindicación anterior, donde el dendrón y/o dendrímero comprende de 4 a 260 grupos de superficie.
16. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, donde los grupos de superficie son grupos amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están protonadas a un pH inferior a 6.
17. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la relación carga/masa de los dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0,1 a 10 mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero.
18. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros son solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de carbono.
19. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde los dendrones y/o dendrímeros en sus formas neutras son solubles en metanol tanto antes como después de la unión del dendrímero al nanocuerno de carbono.
20. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el núcleo de los dendrones o dendrímeros se selecciona entre:
donde n es un número entero desde 1 a 4.
21. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde los dendrones y/o dendrímeros se seleccionan entre:
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación.
22. El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación contienen partículas de oro.
23. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde los dendrímeros tipo PAMAM comprenden en su superficie grupos amino cuaternarios.
24. El uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros tipo PAMAM tienen unido a través de sus grupos amino cuaternarios un grupo: -CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
25. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, donde el dendrímero PAMAM de cuarta o sexta generación se selecciona entre:
donde R es ---CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
26. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula biológicamente activa es una cadena de oligonucleótidos y/o una cadena de aminoácidos y/o una molécula farmacéuticamente activa.
27. El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o a la cadena farmacéuticamente activa mediante interacciones electrostáticas y/o enlaces covalentes, preferiblemente amida y/o éster.
28. El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la interacción electrostática y/o la unión covalente tiene lugar entre una de las posiciones terminales finales de las cadenas de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o de la sustancia farmacéuticamente activa y la superficie de los nanocuernos de carbono.
29. El uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros están unidos a ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro ARN, antagomir, anticuerpos, proteínas o cualquier combinación de los mismos.
30. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares.
31. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
32. El uso según la reivindicación anterior donde la infección es bacteriana o viral.
33. El uso según la reivindicación anterior donde la infección es causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano (SIDA).
34. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer.
35. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
36. El uso de los vectores descritos en las reivindicaciones 1 a 29 para la preparación de un medio de contraste o sonda de imagen que comprende el vector no viral y una molécula de mareaje radiológico.
37. Vector no viral como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.
38. Composición farmacéutica que comprende el vector no viral como se define en la reivindicación 37 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
39. Composición farmacéutica según la reivindicación anterior, que además comprende al menos otro principio activo.
40. Uso de la composición según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, para la elaboración de un medicamento.
41. Kit de transfección de ARN de silenciamiento que comprende el vector no viral según se define en la reivindicación 37.
42. Uso del kit de transfección de ARN de silenciamiento según la reivindicación anterior en cultivos primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células primarias.
43. Procedimiento para la síntesis del vector no viral según se define en la reivindicación 37, que comprende las siguientes etapas:
44. El procedimiento según la reivindicación anterior, donde los nanocuernos están previamente cortados.
45. El procedimiento según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde los nanocuernos se dispersan en al menos una disolución de DMF.
46. El procedimiento según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde a la disolución del dendrón y/o dendrímero es añadida una disolución acuosa de HAuCl4 y posteriormente se reduce mediante NaBH4.
47. El procedimiento según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, donde los nanocuernos de carbono han sido previamente funcionalizados mediante una cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante reacción radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación directa de los nanocuernos para obtener en su superficie grupos carboxilo y anclar sobre ellos grupos amino, y/o éster.
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