VECTORES DE FUSIÓN TRANSCRIPCIONAL PARA REGIONES PROMOTORAS UNI- Y BIDIRECCIONALES PARA SU USO EN BACTERIAS LÁCTICAS.

Vectores de fusión transcripcional para regiones promotoras uni- y bidireccionales para su uso en bacterias lácticas.



La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica recombinante que comprende la secuencia del gen mrfp que codifica para una proteína autofluorescente roja optimizada para la expresión en bacterias lácticas así como a los vectores que la comprenden. La invención también se refiere a las células que comprenden la secuencia o el vector de la invención y sus usos. Así mismo, también se refiere al uso tanto de la secuencia como del vector para la detección y caracterización de una región promotora unidireccional o bidireccional, así como de su uso para transcripción. Además, se refiere al uso de las células que contienen la secuencia de la invención o el vector de la invención para la determinación de la capacidad colonizadora de células. También se refiere a los métodos relacionados con los usos de la invención, a un kit que comprende los elementos de la invención y su uso.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201130356.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: LOPEZ GARCIA,PALOMA, PELAEZ MARTINEZ,CARMEN, REQUENA ROLANIA,TERESA, GARCÍA CAYUELA,Tomás, MOHEDANO BONILLO,M Luz, PÉREZ GÓMEZ DE CADIÑANOS,M Luz, FERNÁNDEZ DE PALENCIA DELGADO,Pilar, BODEN,Daniel, WELLS,Jerry.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/435 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de animales; de humanos.
  • C12N15/74 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes procariotas distintos a E. coli, p. ej. Lactobacillus, Micromonospora.

PDF original: ES-2388255_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Vectores de fusión transcripcional para regiones promotoras uni-y bidireccionales para su uso en bacterias lácticas.

La presente invención se refiere a nuevos vectores de fusión transcripcional que contienen el gen mrfp, que codifica para una proteína fluorescente roja, optimizado en codones para su expresión en bacterias lácticas. Dichos vectores son útiles para la clonación, detección y caracterización de regiones promotoras unidireccionales o bidireccionales. Además, también son útiles para la detección de la expresión de polinucleótidos de interés y para la determinación de la capacidad colonizadora de las células que los comprenden.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los genes que codifican proteínas fluorescentes mediante formación autocatalítica del fluoróforo son ideales para ser empleados como marcadores en la evaluación de expresión génica y para un amplio rango de procedimientos de biología molecular. Existe una amplia oferta comercial de vectores disponibles para realizar ensayos de expresión génica que incorporan como marcador la expresión de la proteína fluorescente verde (“green fluorescent protein”, GFP) procedente de Aequorea victoria. Otros marcadores ampliamente difundidos son los genes que codifican para º-galactosidasa (º-gal) , luciferasa, cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) , fosfatasa alcalina secretada (SEAP) , entre otras. El gen que codifica la GFP se ha utilizado como marcador de procesos biológicos como actividad y regulación génica, de plegamiento y localización celular de proteínas y seguimiento in vitro e in vivo de células marcadas (Wiedenmann, Oswald y Nienhaus (2009) IUBMB Life 61: 1029-1042) .

Entre las proteínas autofluorescentes que se han perseguido con mayor interés en investigación destaca la búsqueda de proteínas fluorescentes rojas (“red fluorescent protein”, RFP) , obteniéndose en la naturaleza la proteína fluorescente procedente de Discosoma sp. DsRed. Sin embargo, la principal dificultad en el empleo de esta proteína es que es un tetrámero que madura lentamente. En este sentido, se han obtenido proteínas fluorescentes monoméricas por ingeniería de proteínas mediante mutagénesis dirigida en la secuencia genética de la proteína fluorescente roja DsRed (Shaner, Campbell, Steinbach, Giepmans, Palmer y Tsien (2004) Nature Biotechnol. 22: 1567-1572) . De las proteínas autofluorescentes obtenidas, destaca la proteína monomérica mCherr y (mRFP) , que tiene la ventaja de madurar rápida y completamente, poseer una elevada fotoestabilidad y una excelente resistencia al pH ácido (pKa < 4, 5) . Además, los espectros óptimos de excitación y emisión de GFP (488 nm y 511 nm, respectivamente) y mRFP (587 nm y 610 nm, respectivamente) no solapan entre sí lo que hace posible su detección simultánea.

Mientras la oferta comercial de vectores que contienen el gen que codifica para GFP (gfp) es muy amplia, existen pocos vectores disponibles que codifiquen para proteínas fluorescentes rojas. El vector Cherr y ™Express, comercializado por Evrogen (Moscú, Rusia) , se compone de una secuencia que codifica un polipéptido rojo de 11 kDa procedente de la región de unión al grupo hemo del citocromo. Por su parte, la empresa Clontech (Mountain View, California, EE UU) comercializa un vector denominado pmCherr y 1 que contiene la secuencia que codifica la proteína mRFP optimizada en codones para la expresión de genes humanos, y que permite la inserción y evaluación de promotores funcionales. Dicho vector puede propagarse en E. coli y permite la expresión en células eucariotas.

En la bibliografía científica, se ha descrito la expresión de mRFP en diferentes especies de bacterias Gramnegativas como Pseudomonas spp., Edwarsiella tarda y E. coli (Lagendijk, Validov, Lamers, de Weert, Bloemberg y GV (2010) FEMS Microbiol. Lett. 305: 81-90) y en Gram-positivas como Staphylococcus aureus (Malone, Boles, Lauderdale, Thoendel, Kavanaugh y Horswill (2009) J. Microbiol. Meth. 77: 251-260) . Ambos estudios están enfocados al empleo de la proteína autofluorescente como marcador para la visualización de las comunidades de estas bacterias formando biopelículas. En estos estudios, también se emplean otros marcadores fluorescentes con GFP para diferenciar comunidades bacterianas constituidas por mezclas de diferentes especies o la misma especie expresando diferentes propiedades. El gen gfp también se ha usado como marcador para el seguimiento in vitro e in vivo de bacterias lácticas empleadas como vehículos de vacunas orales (Geoffroy, Guyard, Quatannens, Pavan, Lange y Mercenier (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 383-391) .

Se ha descrito la construcción de vectores utilizados para la caracterización de promotores divergentes en bacterias Gram-negativas, empleando como genes marcadores de clonación los que codifican para actividades enzimáticas como 1-glucuronidasa y 1-galactosidasa (Parr y , Sharma y Terzaghi (1994) Gene 150: 105-109; Jiwaji, Matcher y Dorrington (2008) S. Afr. J. Sci. 104: 305-307) y 1-glucuronidasa y GFP (Zhang, Gal, Zhu, Chen y Jiang (2010) Front. For. China 3: 112-116) . El gen lacZ también se ha empleado como gen reportero para evaluar la actividad de promotores divergentes en Saccharomyces cerevisiae (Partow, Siewers, Bjorn, Nielsen y Maur y (2010) Yeast 27: 955-964) . Sin embargo, la verificación de la clonación y la detección de expresión de promotores en la mayoría de estos ejemplos requieren la evaluación de la actividad enzimática empleada como marcador de manera discontinua y no simultánea con el crecimiento.

En bacterias lácticas se han descrito vectores que comprenden el gen que codifica para la GFP así como genes marcadores de clonación que codifican para actividades enzimáticas, como es el caso del vector pAK80 y sus derivados que incluyen el gen de la 1-galactosidasa (Margolles, Moreno, Ruiz, Marelli, Magni, de los Reyes Gavilán, Ruas Madiedo (2010) J. Biosci. Bioeng. 109: 322-324) . Sin embargo, la proteína GFP presenta una baja resistencia a la acidez (pKa > 6, 6) por lo que su uso en bacterias lácticas representa una dificultad ya que dichas bacterias tienden a acidificar el medio y, por lo tanto, el medio necesariamente debe contener tampones para mantener el pH en valores próximos a la neutralidad.

Lactococcus lactis es una bacteria Gram-positiva del orden Lactobacillales y constituye una de las especies más representativas dentro de las bacterias lácticas. Además, se caracteriza por haber sido consumida de manera segura en los alimentos, sobre todo en quesos, a lo largo de la historia de la humanidad. En conjunto, L. lactis es la bacteria láctica más ampliamente utilizada en estudios fisiológicos y de expresión debido a las posibilidades de ser manipulada mediante ingeniería genética. En las últimas décadas, esta especie ha demostrado un valioso papel como vehículo seguro para la expresión de proteínas terapéuticas y vacunas y para su potencial aplicación en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y alergias (Rottiers, De Smedt y Steidler (2009) Int. Rev. Immunol. 28: 465-486) .

Al igual que L. lactis, Enterococcus faecalis es una bacteria Gram-positiva del orden Lactobacillales, sin embargo, esta especie está surgiendo en los últimos tiempos como patógeno nosocomial en pacientes inmunocomprometidos, detectándose clones adaptados a hospitales debido a sus características de resistencia múltiple a antibióticos y a la adquisición de genes de virulencia (Sava, Heikens y Huebner (2010) Clin. Microbiol. Infect. 16: 533-540) .

Por todo lo aquí descrito, en la actualidad existe la necesidad de vectores que contengan genes que codifiquen para fluorescencia roja y sean útiles en bacterias lácticas (orden Lactobacillales) de interés agroalimentario y sanitario. Los vectores que combinan fluorescencia verde (mediante el uso del gen gfp) con genes que codifican para actividades enzimáticas presentan la desventaja de no poder ser utilizados para una detección simultánea de expresión a partir de dos promotores divergentes ni tampoco es posible utilizarlos para la detección simultánea de expresión y crecimiento celular. Se hace necesario, por lo tanto, el desarrollo de una nueva herramienta que combine dos genes que codifiquen para proteínas fluorescentes que permitan la detección rápida y simultánea de regiones promotoras bidireccionales en bacterias lácticas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a vectores que permiten la detección rápida y simultánea de regiones promotoras bidireccionales en bacterias lácticas, mediante... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Secuencia nucleotídica que consiste en la secuencia del gen mrfp que codifica una proteína fluorescente roja, donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 1.

2. Secuencia nucleotídica recombinante que comprende la secuencia nucleotídica según la reivindicación 1.

3. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 2 que además comprende al menos una secuencia reconocida por al menos una enzima de restricción.

4. Secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 que además comprende el gen gfp, que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) , donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 8.

5. Secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 que además comprende al menos una secuencia reconocida por al menos una enzima de restricción entre los genes mrfp y gfp.

6. Vector que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Vector según la reivindicación 6 que además comprende un replicón funcional en Lactococcus lactis.

8. Vector según la reivindicación 7 que además comprende un replicón funcional en Escherichia coli.

9. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde la secuencia nucleotídica está unida operativamente a al menos una secuencia reguladora de la expresión génica.

10. Vector según la reivindicación 9 donde la secuencia reguladora de la expresión génica se selecciona de entre: a) un promotor, o b) una señal de inicio de la transcripción.

11. Vector según la reivindicación 10 donde dicho promotor controla al menos la transcripción de una de las proteínas fluorescente.

12. Vector según la reivindicación 11 donde el promotor es un promotor unidireccional.

13. Vector según la reivindicación 12 donde el promotor unidireccional es el promotor PX de Streptococcus pneumoniae, cuya secuencia es SEQ ID NO: 10.

14. Vector según la reivindicación 13 donde el vector es el vector derivado de pAK80 que carece del gen que codifica para º-galactosidasa.

15. Vector según la reivindicación 11 donde el promotor es bidireccional.

16. Vector según la reivindicación 15 donde el promotor bidireccional es la región promotora que comprende los promotores divergentes PKivD y PRmaF-RlrC de Lactococcus lactis, cuya secuencia es SEQ ID NO: 13.

17. Vector según la reivindicación 16 donde el vector es el vector derivado de pAK80 que carece del gen que codifica para º-galactosidasa.

18. Célula que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17.

19. Célula según la reivindicación 18 donde dicha célula es una bacteria Gram-positiva.

20. Célula según la reivindicación 19 donde dicha célula se selecciona de entre Lactobacillus lactis o Enterococcus faecalis.

21. Célula según la reivindicación 18 donde la célula es Escherichia coli

22. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde dicha célula emite fluorescencia roja por expresión de la proteína mRFP, fluorescencia verde por expresión de la proteína GFP o fluorescencia marrón por expresión simultánea de ambas proteínas.

23. Población celular que comprende una célula según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22.

24. Uso del ácido nucleico según las reivindicaciones 1 a 5 o del vector según las reivindicaciones 6 a 17 para la detección y caracterización de un promotor.

25. Uso según la reivindicación 24 donde el promotor es unidireccional.

26. Uso según la reivindicación 24 donde el promotor es bidireccional.

27. Uso del ácido nucleico según las reivindicaciones 1 a 5 o del vector según las reivindicaciones 6 a 17 para la transcripción de al menos un polinucleótido.

28. Uso de las células según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 o de la población celular según la reivindicación 23 para la determinación de la capacidad colonizadora de dichas células en un cultivo mixto bacteriano, en co-cultivos con células eucariotas aisladas, en cultivo de tejido biológico aislado o en un modelo animal.

29. Método de detección de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 que comprende detectar la fluorescencia de dichas células.

30. Método según la reivindicación 29, donde la detección de la fluorescencia se lleva a cabo por medio de espectrofluorimetría o por microscopía de fluorescencia.

31. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, donde la fluorescencia se detecta en colonias de dichas células.

32. Método de detección y caracterización de promotores que comprende: a) transformar una célula hospedadora con el vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17, b) cultivar la célula del paso (a) en condiciones adecuadas, c) determinar los niveles de fluorescencia de la proteína fluorescente, d) comparar la fluorescencia obtenida en el paso (c) con la fluorescencia emitida por una célula control.

33. Método de detección de la expresión de polinucleótidos que comprende: a) insertar en el vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17 un polinucleótido que está controlado por el mismo promotor que regula la transcripción del gen que codifica la proteína

fluorescente, b) transformar una célula hospedadora con el vector resultante del paso (a) , c) cultivar la célula del paso (b) en las condiciones adecuadas y d) determinar los niveles de fluorescencia de la proteína fluorescente simultáneamente a la

determinación del crecimiento celular.

34. Método de determinación de la capacidad colonizadora de las células según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 o de la población celular según la reivindicación 23 que comprende:

a) cultivar las células en las condiciones adecuadas,

b) poner en contacto las células con bacterias, tejidos o un modelo animal,

c) determinar los niveles de fluorescencia de la proteína fluorescente por espectrofluorimetría o por microscopía de fluorescencia y

d) comparar la fluorescencia determinada en el paso (c) con la fluorescencia emitida por una célula, tejido o animal control que no presentan las mismas características que la célula, tejido, o animal del paso (b)

35. Kit que comprende: a) al menos una secuencia nucleotídica recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, b) al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17, o c) al menos una célula según cualquiera de las características 18 a 21.

36. Uso del kit según la reivindicación 35 para la detección y caracterización de promotores, para la transcripción de un polinucleótido de interés o para la determinación de la capacidad colonizadora en cultivos mixtos bacterianos, en co-cultivos con células eucariotas aisladas, en cultivo de tejido biológico aislado o en un modelo animal.


 

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