VARIANTES DE PROTEASA CON SUSTITUCIONES MÚLTIPLES CON CARGA NETA ALTERADA PARA USAR EN DETERGENTES.

Método de mejora de la eficiencia de una subtilisina en un sistema de baja,

media y alta concentración detergente que tiene menos de aproximadamente 800 ppm, entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2.000 ppm, y por encima de aproximadamente 2.000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado respectivamente: a)sustituir un aminoácido en una o más posiciones de residuo en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más positiva o menos negativa comparada con el precursor; b)sustituir un aminoácido en una o más posiciones de residuo en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la que la sustición altera la carga en esa posición para hacer que la carga sea más negativa o menos positiva comparada con la del precursor; c)someter a ensayo la variante para determinar su eficacia comparada con la de la subtilisina precursora en un sistema de baja, media y alta concentración de detergente que tiene menos de aproximadamente 800 ppm, entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2.000 ppm, y por encima de aproximadamente 2.000 ppm, de componentes detergentes presentes en el agua de lavado respectivamente; y d)repetir las etapas a)-c) tanto como sea necesario para producir una variante de subtilisina que sea más eficaz en un sistema de baja, media y alta concentración de detergente, que una proteasa precursora

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05018139.

Solicitante: DANISCO US INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 925 PAGE MILL ROAD PALO ALTO, CA 94304 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: POULOSE, AYROOKARAN, J., SCHELLENBERGER, VOLKER, KELLIS, JAMES, T., JR., PAECH, CHRISTIAN, NADHERNY, JOANNE, NAKI, DONALD, P., CALDWELL, ROBERT, M., COLLIER, KATHERINE, D..

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 23 de Octubre de 1998.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A23G4/12M
  • A61K8/66 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 8/00 Cosméticos o preparaciones similares para el aseo. › Enzimas.
  • A61Q11/00 A61 […] › A61Q USO ESPECIFICO DE COSMETICOS O DE PREPARACIONES SIMILARES PARA EL ASEO.Preparaciones para el cuidado de los dientes, la cavidad bucal o la dentadura, p.ej. dentífricos o pasta dental; Colutorios.
  • C11D3/386 QUIMICA; METALURGIA.C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS.C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA.C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
  • C12N9/54 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › siendo las bacterias del género Bacillus.

Clasificación PCT:

  • A23K1/165
  • C11D3/386 C11D 3/00 […] › Preparaciones que contienen enzimas.
  • C12N15/57 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre los enlaces peptídicos (3.4).
  • C12N9/54 C12N 9/00 […] › siendo las bacterias del género Bacillus.

Clasificación antigua:

  • A23K1/165
  • C11D3/386 C11D 3/00 […] › Preparaciones que contienen enzimas.
  • C12N15/57 C12N 15/00 […] › que actúan sobre los enlaces peptídicos (3.4).
  • C12N9/54 C12N 9/00 […] › siendo las bacterias del género Bacillus.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Chipre.

PDF original: ES-2367505_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes. Antecedentes de la Invención Las serinaproteasas son un subgrupo de carbonilhidrolasas. Las mismas comprenden una clase diversa de enzimas que tienen una extensa gama de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R. Sci. Amer., 131: 7488. A pesar de su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las serinaproteasas ha sido abordada por al menos dos familias de enzimas genéticamente distintas: 1) las subtilisinas y 2) las serinaproteasas de mamífero afines a la quimotripsina y serinaproteasas bacterianas homólogas (v.g., tripsina y S. gresius tripsina). Estas dos familias de serinaproteasas exhiben mecanismos de catálisis notablemente similares. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46: 331358. Adicionalmente, aunque la estructura primaria no está emparentada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas reúne una tríada catalítica conservada de aminoácidos constituida por serina, histidina y aspartato. Las subtilisinas son serinaproteasas (PM aprox. 27.500) que son secretadas en grandes cantidades por una gran diversidad de especies de Bacillus y otros microorganismos. La secuencia proteínica de la subtilisina ha sido determinada a partir de al menos nueve especies diferentes de Bacillus. Markland, F.S., et al. (1983), Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 364: 15371540. La estructura cristalográfica tridimensional de las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis y varias variantes naturales de B. lentus ha sido consignada. Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está emparentada genéticamente con las serinaproteasas de mamífero, tiene una estructura de sitio activo similar. Las estructuras cristalinas de rayos X de inhibidores peptídicos unidos covalentemente que contienen subtilisina (Robertus, J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11: 24392449) o complejos de productos (Robertus. J.D., et al. (1976), J. Biol. Chem., 251: 10971103) han proporcionado también información concerniente al sitio activo y a la hendidura supuesta de unión al sustrato de la subtilisina. Adicionalmente, se han consignado un gran número de estudios de modificación cinética y química para subtilisina; Svendsen, B. (1976). Carlsberg Res. Commun., 41: 237291; Markland, F.S. id.) así como al menos un informe en el cual la cadena lateral de la metionina en el residuo 222 de la subtilisina se convirtió con peróxido de hidrógeno en metioninasulfóxido (Stauffer, D.C., et al. (1965), J. Biol. Chem., 244: 53335338) y se ha llevado a cabo una mutagénesis orientada extensa (Wells y Estell (1988) TIBS 13: 291297). El documento WO9100345 describe un método para mejorar la eficiencia de las subtilisinas en detergentes mediante la sustitución de los residuos aminoácidos con un residuo más negativo o más positivo y midiendo la eficiencia de la enzima en relación con el pH de la disolución de lavado. El documento WO9523221 describe que sustituyendo los residuos por otros más negativos se puede incrementar la eficiencia de lavado de una subtilisina en un sistema detergente europeo. También el documento EP 328229 describe que cambiando la carga de un residuo aminoácido de la subtilisina se puede incrementar la eficiencia de lavado de la enzima en muchos detergentes. Una cuestión común en el desarrollo de una variante de proteasa para uso en una formulación detergente es la diversidad de condiciones de lavado que incluyen formulaciones detergentes variables en las que podría utilizarse una variante de proteasa. Por ejemplo, formulaciones detergentes utilizadas en diferentes áreas tienen distintas concentraciones de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, un sistema detergente europeo tiene por lo general aproximadamente 4505000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado, mientras que un sistema detergente japonés tiene por lo general aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En Norteamérica, particularmente en los Estados Unidos, un sistema detergente tiene por lo general aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sorprendentemente, se ha desarrollado un método para el diseño racional de una variante de proteasa para uso en un sistema de baja concentración detergente, un sistema de alta concentración detergente, y/o un sistema de concentración detergente media así como para el uso en los tres tipos de sistemas de concentración detergente. Sumario de la Invención ES 2 367 505 T3 La presente invención proporciona un método de mejora de la eficiencia de una subtilisina en un sistema de baja, media y alta concentración detergente que tiene menos de aproximadamente 800 ppm, entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2.000 ppm, y por encima de aproximadamente 2.000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado respectivamente: a)sustituir un aminoácido en una o más posiciones de residuo en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más positiva o menos negativa comparada con el precursor; b)sustituir un aminoácido en una o más posiciones de residuo en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la que la sustición altera la carga en esa posición para hacer que la carga sea más negativa o menos positiva comparada con la del precursor; 2 c)someter a ensayo la variante para determinar su eficacia comparada con la de la subtilisina precursora en un sistema de baja, media y alta concentración de detergente que tiene menos de aproximadamente 800 ppm, entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2.000 ppm, y por encima de aproximadamente 2.000 ppm, de componentes detergentes presentes en el agua de lavado respectivamente; y d)repetir las etapas a)-c) tanto como sea necesario para producir una variante de subtilisina que sea más eficaz en un sistema de baja, media y alta concentración de detergente, que una proteasa precursora. La precursora puede ser una subtilisina de Bacillus, tal como subtilisina de Bacillus lentus. Se proporciona también un método de producción de una composición detergente que comprende, habiendo mejorado la eficiencia de una subtilisina por producción de una variante de subtilisina por un método de la invención, formular la variante de subtilisina en una composición detergente en polvo o líquida que tiene un pH entre 6,5 y 12,0 a aproximadamente 0,1 hasta 5% en peso. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figs. 1 AC representan la secuencia de DNA y de aminoácidos para la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen. La Fig. 2 representa los residuos de aminoácidos conservados entre las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens (BPN') y Bacillus lentus (tipo salvaje). Las Figs. 3A y 3B representan la secuencia de aminoácidos de cuatro subtilisinas. La línea superior representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (a la que se hace referencia también en ocasiones como subtilisina BPN'). La segunda línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus subtilis. La tercera línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis. La cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus (a la que se hace referencia también como subtilisina 309 en el documento PCT WO89/06276). El símbolo designa la ausencia de residuos de aminoácidos específicos en comparación con la subtilisina BPN'. Descripción Detallada de la Invención ES 2 367 505 T3 Como se ha indicado arriba, ciertas geografías tienen ciertas condiciones de lavado y, así, utilizan tipos de detergentes diferentes. Por ejemplo, Japón utiliza un sistema de baja concentración de detergente, mientras que Europa utiliza un sistema de alta concentración de detergente. Como se ha expuesto previamente, los Estados Unidos utilizan un sistema de concentración media de detergente. Los autores de la presente invención han encontrado que diferentes variantes de proteasa se comportan óptimamente en estas formulaciones de detergente diferentes. Sin embargo, como resultado de estas observaciones, se esperaría que fuera imposible encontrar una proteasa que funcionara bien en los tres tipos de detergentes. Sorprendentemente, este no es el caso. Se ha desarrollado un método para diseñar de manera racional una variante de proteasa que funcina en los tres sistemas de concentrtación de detergente. Se ha encontrado que, para producir una variante de proteasa que es más eficaz en un sistema de baja concentración de detergente, es necesario reemplazar residuo(s) cargado(s) positivamente con residuo(s) cargado(s) negativamente o residuos neutros... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de mejora de la eficiencia de una subtilisina en un sistema de baja, media y alta concentración detergente que tiene menos de aproximadamente 800 ppm, entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2.000 ppm, y por encima de aproximadamente 2.000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado respectivamente: a)sustituir un aminoácido en una o más posiciones de residuo en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más positiva o menos negativa comparada con el precursor; b)sustituir un aminoácido en una o más posiciones de residuo en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la que la sustición altera la carga en esa posición para hacer que la carga sea más negativa o menos positiva comparada con la del precursor; c)someter a ensayo la variante para determinar su eficacia comparada con la de la subtilisina precursora en un sistema de baja, media y alta concentración de detergente que tiene menos de aproximadamente 800 ppm, entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2.000 ppm, y por encima de aproximadamente 2.000 ppm, de componentes detergentes presentes en el agua de lavado respectivamente; y d)repetir las etapas a)-c) tanto como sea necesario para producir una variante de subtilisina que sea más eficaz en un sistema de baja, media y alta concentración de detergente, que una proteasa precursora. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el precursor es una subtilisina de Bacillus. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el precursor es una subtilisina de Bacillus lentus. 4. Un método de producción de una composición detergente que comprende, habiendo mejorado la eficiencia de una subtilisina por producción de una variante de subtilisina por un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, formular dicha variante de subtilisina en una composición detergente en polvo o líquida que tiene un pH entre 6,5 y 12,0 para aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5,0% en peso. 23 ES 2 367 505 T3 24 ES 2 367 505 T3 ES 2 367 505 T3 26 ES 2 367 505 T3 27 RESIDUOS CONSERVADOS EN SUBSTILISINAS DE BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS ES 2 367 505 T3 28 COMPARACIÓN DE SECUENCIAS DE SUBTILISINA DE: ES 2 367 505 T3 29 ES 2 367 505 T3

 

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