Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas.

Una variante de glucoamilasa que comprende al menos:

(i) una sustitución de aminoácidos en la posición 61 en SEQ ID NO:

2 y

(ii) una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 73, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539 o 563 de SEQ ID NO:2;

en la que la variante de glucoamilasa presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2.

y en la que la variante de glucoamilasa muestra termoestabilidad aumentada o actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO:2.

Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas

LISTADO DE SECUENCIAS

También se adjunta un listado de secuencias que comprende los SEQ ID NO:1-167.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Las variantes de glucoamilasas presentan de forma beneficiosa propiedades modificadas (p. ej., termoestabilidad y/o actividad específica mejoradas) . Se presentan composiciones que comprenden las glucoamilasas variantes, construcciones de ADN que codifican las variantes y métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped.

ANTECEDENTES

Las enzimas de glucoamilasa (glucano 1, 4-α-glucohidrolasas, EC 3.2.1.3) son carbohidrasas hidrolizantes de almidón que actúan en exo, que catalizan la eliminación de unidades de glucosa sucesivas de los extremos no reductores de moléculas relacionadas con oligosacáridos y polisacáridos o almidón. Las glucoamilasas pueden hidrolizar tanto los enlaces glucosídicos lineales como ramificados de almidón (p.ej., amilosa y

amilopectina) .

Las glucoamilasas se producen mediante numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Especialmente interesantes, y comercialmente importantes, las glucoamilasas son enzimas fúngicas que se producen de forma extracelular, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al. (1983) Carlsberg Res. Commun. 48:529-544; Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. Chem. 20 53:923-929; patente estadounidense nº 5.024.941; patente estadounidense nº 4.794.175 y WO 88/09795) ; Talaromyces (patente estadounidense nº 4.247.637; patente estadounidense nº 6.255.084 y patente estadounidense nº 6.620.924) ; Rhizopus (Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957-964; Ashikari et al., (1989) App. Microbiol. Biotech. 32:129-133 y patente estadounidense nº 4.863.864) ; Humicola (WO 05/052148 y patente estadounidense nº 4.618.579) y Mucor (Houghton-Larsen et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol.

62:210-217) . Muchos de los genes que codifican estas enzimas han sido clonados y expresados en células bacterianas, fúngicas y/o levadura.

Comercialmente, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (p. ej., para la producción de glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón) . Las glucoamilasas se utilizan para producir edulcorantes de maíz con alto 30 contenido de fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos. En general, las glucoamilasas pueden utilizarse, y normalmente se utilizan, con alfa-amilasas en procesos hidrolizantes de almidón para hidrolizar almidón en dextrinas y posteriormente glucosa. La glucosa puede entonces convertirse en fructosa por parte de otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa) ; cristalizarse; o utilizarse en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, succinato, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol y 1, 3-propanodiol) . El etanol producido mediante el uso de glucoamilasas en la fermentación de material que contiene celulosa y/o almidón puede utilizarse como una fuente de combustible o para consumo alcohólico.

Aunque las glucoamilasas se han utilizado con éxito en aplicaciones comerciales durante muchos años, todavía existe la necesidad de nuevas glucoamilasas con propiedades modificadas, tal como actividad específica mejorada o termoestabilidad aumentada.

Se han realizado diferentes mutaciones en glucoamilasas de Aspergillus que potencian la estabilidad térmica y la actividad específica. Se hace referencia a la patente estadounidense nº 6.537.792; la patente estadounidense nº 6.352.851; Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9:499-505, Chen et al., (1995) Prot Eng. 8:575-582; Fierobe et al. (1996) Biochem. 35:8698-8704; y Li et al., (1997) Prot. Eng. 10:1199-1204. Todavía existe la 45 necesidad de proporcionar variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas en relación con su precursora. El nº de accesión EBI UNIPROT: Q6DUY5 proporciona la secuencia de glucoamilasa Aspergillus ficcum. WO 2006/060062 expone la glucoamilasa Trichoderma reesei y homólogos de esta.

SUMARIO

La presente exposición hace referencia a variantes de glucoamilasa de una glucoamilasa precursora. Las 50 variantes de glucoamilasa contienen sustituciones de aminoácidos en el dominio catalítico y/o el dominio de unión a almidón. Las variantes muestran propiedades modificadas, tal como termoestabilidad y/o actividad

específica mejoradas.

En un aspecto, la presente invención hace referencia a una variante de glucoamilasa que comprende al menos una sustitución de aminoácido correspondiente a la posición 61 y una o más sustituciones correspondientes a las posiciones 73, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539 o 563 de SEQ ID NO:2, variante de 5 glucoamilasa que presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con una glucoamilasa precursora de SEQ ID NO:1 o 2, en la que la variante de glucoamilasa muestra termoestabilidad aumentada o actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO:2. En una forma de realización, la glucoamilasa precursora presenta un dominio catalítico con al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2, o un dominio de unión a almidón con al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID

NO:1 o 2. En una forma de realización, la sustitución en la posición 61 en SEQ ID NO:2 se elige de: N61D/I/L/Q/V/W.

En aspectos adicionales de la invención, la variante de glucoamilasa comprende la sustitución de aminoácido N61I y una o más sustituciones de aminoácidos correspondientes a la posición: G73F, L417R/V, T430A/M, A431 L/Q, E503A/V, Q511H, A535R, A539R o N563I/K de SEQ ID NO:2 En algunos aspectos, la 15 variante de glucoamilasa comprende además una o más de las siguientes sustituciones: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W, I12L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C, Y47W, Y49N, Q70R/K/MIP/G/L/F, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y, E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y/, 20 V181E/C/D/G/H/I/P/T/Y/S/L/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211C/R/E/A/Y/W/M/H/L/I/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/P/V, I292D/H/P/R/T/N/V/F/L, G294C/D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/Y/L, Y31OE/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/V/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L, S369F, N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/H/K/G,

R433H/Q, I436A/T o S451M/T/H I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C o G294C/D/E/T/Q/I/A de SEQ ID NO:2.

En un aspecto, la presente exposición hace referencia a una glucoamilasa variante según se define en la reivindicación 7.

La glucoamilasa precursora puede la enzima obtenida de cualquiera de entre: una Trichoderma spp., una Aspergillus spp., una Humicola sup., una Penicillium spp., una Talaromycese spp. o una Schizosaccharmyces 30 spp. En algunos aspectos, la glucoamilasa precursora puede ser de una Trichoderma sup. o una Aspergillus spp.

La glucoamilasa variante muestra termoestabilidad aumentada en comparación con la glucoamilasa precursora. Como alternativa, o de forma complementaria, la variante muestra actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa precursora.

Un aspecto adicional de la exposición es un polinucleótido que codifica la variante descrita. Un aspecto adicional es un vector que comprende el polinucleótido. Un aspecto adicional es una célula huésped que contiene el vector.

Un aspecto adicional de la exposición es una composición de enzima que incluye la variante de glucoamilasa. En un aspecto, la composición de enzima puede utilizarse en un proceso de conversión de almidón o un proceso de fermentación de alcohol.

Un aspecto adicional de la invención es un método para la producción de una glucoamilasa variante mediante el cultivo de la célula huésped que contiene el polinucleótido bajo condiciones adecuadas para la expresión y producción de la variante de glucoamilasa y la producción de la variante. El método puede también incluir la etapa de recuperación de la variante de glucoamilasa del cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La fig. 1A representa la glucoamilasa precursora Trichoderma reesei (TrGA) con 632 aminoácidos (SEQ ID NO:1) . 1) . El péptido señal se subraya, la... [Seguir leyendo]

1. Una variante de glucoamilasa que comprende al menos:

(i) una sustitución de aminoácidos en la posición 61 en SEQ ID NO:2 y

(ii) una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 73, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539 o 563 de SEQ ID NO:2;

en la que la variante de glucoamilasa presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2. y en la que la variante de glucoamilasa muestra termoestabilidad aumentada o actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO:2.

2. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la sustitución en la posición 61 en SEQ ID NO:2 se elige de: N61D/I/L/Q/V/W.

3. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la glucoamilasa precursora presenta un dominio catalítico que presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2 o un dominio de unión a almidón que presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2.

4. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la variante de glucoamilasa presenta al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99, 5 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2 o en la que la glucoamilasa precursora es SEQ ID NO:1 o 2.

5. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la variante comprende sustituciones de aminoácidos correspondientes a N61I y uno o más de G73F, L417R/V, T430A/M, A431L/Q, E503A/V, QS11H, A535R, A539R o N563I/K en SEQ ID NO:2.

6. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la variante comprende además una o más de las siguientes sustituciones: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W, I12L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C, Y47W, Y49N, Q70R/K/M/P/G/L/F, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y, E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y, V181E/C/D/G/H/I/P/T/Y/S/L/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211C/R/E/A/Y/W/M/H/L/I/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/P/V, I292D/H/P/R/T/N/N/F/L, G294C/D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/Y/L, Y310E/G/UP/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/PN/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L, S369F, N376Q/T/H/SN, Y395Q/R/S, A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/H/K/G, R433H/Q, 1436A/T o S451 M/T/H en SEQ ID NO:2.

7. Variante de glucoamilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende uno de los conjuntos de sustitución:

I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R; I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R; I43Q/N61I/L417V/T430M/Q511H/A539R; I43R/N61I/L417R, V/E503A/Q511H/A539R; I43Q/N61I/T430A/A431L/Q511H/A539R; I43Q/N61I/T430A/Q511H; I43Q/N61I/T430A/Q511H/A539R; I43Q/N61FT430M/Q511H/A539R; I43Q/N61I/Q511H; I43Q/N61I/Q511H/A539R en SEQ ID NO:2.

8. Variante de glucoamilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la glucoamilasa precursora se elige de una glucoamilasa obtenida a partir de una Trichoderma spp., una Aspergillus spp., una Humicola spp., una Penicillium spp., una Talaromycese spp. o una Schizosaccharmyces spp.

9. Un polinucleótido que codifica la variante de glucoamilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9.

11. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 10.

12. Una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Un método para producir una variante de glucoamilasa en una célula huésped que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 11 con las condiciones adecuadas para la expresión y producción de la variante de glucoamilasa y la producción de la variante de glucoamilasa.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa del cultivo.

Dibujos

Proteína precursora TrGA (632 Aminoácidos) (SEQ ID NO:1)

128 129 130 131

Poliligador pSL1180

Promotor cbh1

pb

Poliligador pSL1180

Marcador AmdS Terminador cbh1

Poliligador pSL1180

Promotor cbh1

pb

Poliligador pSL1180

Marcador AmdS

Terminador cbh1