Variantes de FVII o FVIIa.

Una variante de polipéptido del factor VII humano (hFVII) o del factor VIIa humano (hFVIIa),

dicha variantecontiene una modificación en la posición 341 y una inserción en la posición 237 si se compara con el hFVII o elhFVIIa, que se representa en la SEQ ID NO: 2, dicha inserción se elige entre el grupo formado por G237GXX,G237GXXX y G237GXXXX, en las que X es cualquier resto aminoácido o X se elige opcionalmente entre el grupoformado por Ala, Val, Leu, Ile, Gly, Ser y Thr, y dicha variante tiene una mayor actividad coagulante si se comparacon los hFVII o hFVIIa, cuando dicha actividad se determina por el ensayo en sangre total, dicho ensayo consiste en:

(a) diluir 100 μl de dicho hFVII, hFVIIa o variante en un tampón que contiene 10 mM de glicilglicina, 50 mM de NaCl,37,5 mM de CaCl2, de pH 7,35;

(b) transferir la dilución resultante a un vaso de reacción;

(c) iniciar la reacción de coagulación añadiendo 50 μl de sangre que contienen un 10 % de citrato trisódico 0,13 Mcomo anticoagulante;

(d) anotar el tiempo de coagulación; un tiempo de coagulación corto corresponde a una actividad coagulanteelevada.

Variantes de FVII o FVIIa Ámbito de la invención La presente invención se refiere a nuevas variantes de FVII o FVIIa que contienen modificaciones de aminoácidos en las posiciones 237 y 341. La presente invención se refiere también al uso de tales variantes de polipéptido para la terapia, en particular para el tratamiento de muchos trastornos relacionados con la coagulación.

Antecedentes de la invención La coagulación de la sangre es un proceso que consiste en una interacción compleja de varios componentes (o factores) de la sangre, que eventualmente desemboca en la formación de un coágulo de fibrina. En general, los componentes de la sangre que participan en ello se denominan la “cascada de la coagulación” y son proenzimas o cimógenos, es decir, proteínas enzimáticamente inactivas que se convierten en la forma activa por acción de un activador. Uno de estos factores de coagulación es el factor VII (FVII) .

El FVII es una proteína plasmática dependiente de la vitamina K, sintetizada en el hígado y secretada al torrente sanguíneo en forma de glicoproteína de cadena simple, de un peso molecular de 53 kDa (Broze & Majerus, J. Biol. Chem. 255, 1242-1247, 1980) . El cimógeno FVII se convierte en la forma activada (FVIIa) por división proteolítica de un solo sitio, el R152-I153, que da lugar a dos cadenas unidas por un solo puente disulfuro. El FVIIa formando un complejo con el factor tisular (TF) , el complejo FVIIa, es capaz de convertir tanto el FIX como el FX en sus formas activadas, que intervienen en reacciones que conducen a una rápida producción de trombina y a la formación de fibrina (Østerud & Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5260-5264, 1977) .

El FVII sufre modificaciones post-traduccionales, incluida la carboxilación dependiente de la vitamina K, que da lugar a diez restos de ácido γ-carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. Por tanto, los restos número 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 representados en la SEQ ID NO: 2 son restos de ácidos-carboxiglutámico del γ dominio Gla, importantes para la actividad del FVII. Otras modificaciones post-traduccionales incluyen la unión de restos azúcar a dos sitios de N-glicosilación de origen natural de las posiciones 145 y 322, respectivamente, y dos sitios de O-glicosilación de origen natural de las posiciones 52 y 60, respectivamente.

El gen que codifica al FVII humano (hFVII) se ha mapeado hasta el cromosoma 13 en q34-qter 9 (de Grouchy y col., Hum. Genet. 66, 230-233, 1984) . Contiene nueve exones y abarca 12, 8 kb (O’Hara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5158-5162, 1987) . La organización genética y la estructura de proteína del FVII son similares a las de otras proteínas procoagulantes dependientes de la vitamina K, cuyos exones 1a y 1b codifican la secuencia de señal; el exón 2 al propéptido y al dominio Gla; el exón 3 a una región hidrófoba corta; los exones 4 y 5 a los dominios epidérmicos similares al factor de crecimiento; y del exón 6 al 8 al dominio catalítico de la serina-proteasa (Yoshitake y col., Biochemistr y 24, 3736-3750, 1985) .

Se han publicado artículos sobre las estructuras tridimensionales experimentales del hFVIIa (Pike y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8925-30, 1999 y Kemball-Cook y col., J. Struct. Biol. 1999; 127, 213-223) , del hFVIIa formando complejo con el factor tisular soluble empleando métodos cristalográficos de rayos X (Banner y col., Nature 380, 41, 1996; y Zhang y col., J. Mol. Biol. 285, 2089, 1999) , y de fragmentos más pequeños del hFVII (Muranyi y col., Biochemistr y 37, 10605, 1998; y Kao y col., Biochemistr y , 38, 7097, 1999) .

Se han descrito relativamente pocas variantes de ingeniería de proteínas del FVII (Dickinson & Ruf, J. Biol. Chem. 272, 19875-19879, 1997; Kemball-Cook y col., J. Biol. Chem. 273, 8516-8521, 1998; Bharadwaj y col., J. Biol. Chem. 271, 30685-30691, 1996; Ruf y col., Biochemistr y 38, 1957-1966, 1999) .

Se han publicado artículos sobre la expresión del FVII en BHK o en otras células de mamíferos (WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y sobre la co-expresión del FVII y de la endoproteasa kex2 en células eucariotas (WO 00/28065) .

Las preparaciones comerciales de FVIIa humano recombinante (rhFVIIa) se suministran con el nombre comercial de NovoSeven®. El NovoSeven® es indicado para el tratamiento de episodios hemorrágicos en pacientes de hemofilia A o B. El NovoSeven® es el único rhFVIIa para el tratamiento eficaz y fiable de episodios hemorrágicos disponible en el mercado.

En el documento WO 91/11514 se describe una forma inactiva del FVII, en la que la arginina 152 y/o la isoleucina 153 se han modificado. Estos aminoácidos están ubicados en el sitio de activación. En WO 96/12800 se describe la inactivación del FVIIa con un inhibidor de serina-proteinasa; la inactivación por carbamilación del FVIIa en el grupo α-aminoácido I153 se ha descrito en Petersen y col., Eur. J. Biochem. 261, 124-129, 1999. La forma inactivada es capaz de competir con el hFVII o el hFVIIa por la unión con el TF y de inhibir la actividad coagulante. La forma inactivada del FVIIa se ha propuesto para el uso en el tratamiento de pacientes que sufren estados hipercoagulables, por ejemplo los pacientes de sepsis, riesgo de infarto de miocardio o de apoplejía trombótica.

En WO 98/32466 se sugiere que el FVII, entre muchas otras proteínas, puede PEGilarse (es decir, unirse a una o más moléculas de polietilenglicol) , pero no se aporta ninguna información adicional al respecto.

En WO 01/58935 se describe una nueva estrategia para desarrollar moléculas de FVII o FVIIa que tengan, entre otras, una vida media más larga, que consiste en la glicosilación o la PEGilación dirigidas.

En WO 03/093465 se describen variantes de FVII o FVIIa que tienen ciertas modificaciones en el dominio Gla y tienen uno o más sitios de N-glicosilación introducidos fuera del dominio Gla. Neuenschwander y Morrissey (Biochemistr y 34 (27) , pp. 8701-8707, 1995) publican una investigación de la influencia de las mutaciones K192Q y K192E sobre el sustrato y las especificidades inhibidoras del FVIIa.

En el documento US-5, 580, 560 se describe la sustitución del K34a del FVII por E, Q, G, T, A o S, con preferencia por E o Q, con el fin de evitar la rotura proteolítica.

Shah y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 (8) , 4229-4234, 1998) describen que el mutante Q10E32 del factor VII tiene una actividad coagulante más intensa.

En el resumen para el registro sanitario del NovoSeven® se indica una vida media del rhFVIIa circulante de 2, 3 horas (ver “Summar y Basis for Approval for NovoSeven®”, número de referencia FDA: 96-0597) . Son necesarias dosis relativamente elevadas y una administración frecuente para alcanzar y mantener el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Como consecuencia de ello, es difícil conseguir la regulación adecuada de la dosis y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes supone restricciones para el modo de vida del paciente.

En la hemostasis normal, el sistema procoagulante se halla en equilibrio con los sistemas anticoagulantes que intervienen en la terminación de la reacción hemostática y el sistema fibrinolítico, que disuelve los coágulos después de haberse formado. Los sistemas anticoagulantes contienen diversos inhibidores de proteasas, p.ej. el inhibidor del mecanismo del factor tisular (TFPI) , la antitrombina-III (AT-III) , el cofactor-II de la heparina (HC-II) y el mecanismo de la proteína C.

El TFPI es un inhibidor reversible, dirigido a un sitio activo, que regula la coagulación inhibiendo al FVIIa-TF de un modo dependiente del FXa. El complejo TFPI-FXa se une al complejo FVIIa-TF, desembocando en la formación de un complejo TFFVIIa-TFPI-FXa.

La importancia del TFPI “in vivo” se ha confirmado con ensayos que demuestran el efecto hemostático de un anticuerpo neutralizador anti-TFPI en un modelo de hemorragia hemófila (Erhardtsen y col., Blood Coagul. Fibrinolysis 6, 388-394, 1995) . Además, en ensayos de reconstitución bioquímica, se demuestra que el TFPI extiende la fase de inicio y reduce la velocidad de generación de la trombina durante la fase de propagación (van’t Veer y Mann; J. Biol. Chem. 272, 4367-4377, 1997) .

Un objeto de la presente invención es proporcionar variantes de FVII o FVIIa que desplieguen una mayor actividad coagulante que el hFVIIa o el rhFVIIa. Se ha contemplado que esto puede conseguirse... [Seguir leyendo]

1. Una variante de polipéptido del factor VII humano (hFVII) o del factor VIIa humano (hFVIIa) , dicha variante contiene una modificación en la posición 341 y una inserción en la posición 237 si se compara con el hFVII o el hFVIIa, que se representa en la SEQ ID NO: 2, dicha inserción se elige entre el grupo formado por G237GXX, G237GXXX y G237GXXXX, en las que X es cualquier resto aminoácido o X se elige opcionalmente entre el grupo formado por Ala, Val, Leu, Ile, Gly, Ser y Thr, y dicha variante tiene una mayor actividad coagulante si se compara con los hFVII o hFVIIa, cuando dicha actividad se determina por el ensayo en sangre total, dicho ensayo consiste en:

(a) diluir 100 µl de dicho hFVII, hFVIIa o variante en un tampón que contiene 10 mM de glicilglicina, 50 mM de NaCl, 37, 5 mM de CaCl2, de pH 7, 35;

(b) transferir la dilución resultante a un vaso de reacción;

(c) iniciar la reacción de coagulación añadiendo 50 µl de sangre que contienen un 10 % de citrato trisódico 0, 13 M como anticoagulante;

(d) anotar el tiempo de coagulación; un tiempo de coagulación corto corresponde a una actividad coagulante elevada.

2. La variante de reivindicación 1, en la que dicha modificación es una sustitución, que se elige opcionalmente entre el grupo formado por K341Q y K341N.

3. La variante de reivindicación 1, en la que dicha inserción es G237GAA.

4. La variante de reivindicación 1, dicha variante contiene además por lo menos una modificación adicional del dominio Gla, dicha modificación del dominio Gla es opcionalmente una sustitución, dicha sustitución del dominio Gla está situada opcionalmente en una posición elegida entre el grupo formado por P10, K32, D33 y A34.

5. La variante de reivindicación 4, en la que la sustitución de la posición P10 es P10Q.

6. La variante de reivindicación 4, en la que la sustitución de la posición K32 es K32E.

7. La variante de reivindicación 4, en la que la modificación adicional es una inserción de un resto aminoácido entre A3 y F4, dicha inserción es opcionalmente A3AY.

8. Una secuencia de nucleótidos que codifican a una variante definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7

9. Un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 8.

10. Una célula hospedante que contiene una secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 8 o un vector de expresión definido en la reivindicación 9, dicha célula hospedante es opcionalmente una célula gamma-carboxilante capaz de realizar la glicosilación “in vivo”.

11. Una composición que contiene una variante definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 y por lo menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Una variante definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 para el uso como medicamento.

13. Uso de una variante definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad o de un trastorno, en el que es deseable la formación de coágulos.

14. Una variante definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 para el uso en el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno, en el que es deseable la formación de coágulos.

15. Uso según la reivindicación 13, en el que dicha enfermedad o trastorno se elige entre el grupo formado por hemorragias, incluidas las hemorragias cerebrales, las hemorragias severas incontroladas, por ejemplo en caso de trauma, las hemorragias de pacientes sometidos a trasplantes o resección, hemorragias de varices y hemofilia.