Variantes de fitasa.

Variante de una fitasa progenitora de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.

96, la variante comprendiendo al menos una de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 20R; 29N, C, T; 45A; 63N; 69A; 92L; 931, 95R, H, M, N, S, T; 97V; 98G; 99D; 1021, 110Y, R, W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C, R; 157K; 160R; 163P; 183K, A, W, G; 185A, H, N, P, K; 187G; 190S, K; 191L, R, S; 194R; 199S; 205S; 210G; 218T; 2221, 234K, S; 248A, C, D, E, G, H, S, T; 286S; 321A; 323A; 324S, L; 328T; 330R; 334E, D, G; 343N; 344A, V, S; 345D, H; 347Q, P; 349M, K; 350T, M, I, L; 384S, A; 395G; 398T; 409S; 421 R, S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 4291 y 430M; donde

(a) la variante tiene actividad de fitasa;

(b) cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº : 2 y

(c) la variante tiene un porcentaje de identidad a la SEC ID nº : 2 de al menos 75%.

Variantes de fitasa Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a variantes de una fitasa progenitora de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96. La invención también se refiere a las secuencias de ADN que codifican tales variantes, su producción en una célula huésped recombinante, al igual que a métodos de uso de las variantes, en particular dentro del campo de piensos para animales. Una fitasa preferida progenitora es la fitasa de Peniophora que comprende la SEC ID nº : 2.

Antecedentes de la invención [0002] EP 897010 titulada "Fitasas modificadas" divulga, entre otros, variantes determinadas de una fitasa de Aspergillus fumigatus. EP 897985 titulada "Fitasas de consenso" divulga, entre otros, una fitasa de consenso fúngica que puede ser diseñada con base en, entre otros, un alineamiento múltiple de diferentes fitasas de ascomicetos. WO 99/48380 titulada "Fitasas termoestables en la preparación de pienso y expresión en plantas" se refiere a ciertos aspectos del uso de fitasas termoestables. Ejemplos de fitasas termoestables son las varias fitasas de consenso listadas en la p. 30 debajo de la línea en negrita. WO 00/43503 titulada "Fitasas mejoradas" se refiere entre otros a ciertas variantes de fitasa de termostabilidad aumentada, que se pueden diseñar por un proceso similar al descrito en EP 897985. Ejemplos de fitasas termoestables se muestran en p. 54-55 debajo de la línea en negrita. Estas fitasas tienen todas un porcentaje de identidad a la SEC ID nº : 2 inferior al 75%. EP 0 969 089 se refiere a formulaciones de fitasa que comprenden una fitasa y un agente estabilizante seleccionado de varios agentes, o alternativamente estabilizado por reticulación química. EP 0 969 089 además divulga el uso de varias fitasas de consenso, tales como aquellas diseñadas a partir de varias secuencias de fitasa de Aspergillus (o fúngicas) (ver por ejemplo EP 897985) , varias fitasas de basidiomicetos, y otras (Figs. 13 hasta 22 y 33) . Las propiedades de algunas de estas fitasas de consenso, tales como la termostabilidad, temperatura óptima, perfiles de actividad del pH y especificidades del sustrato son comparadas (Figs. 23 a 32)

[0003] Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevas y mejoradas variantes de fitasa, en particular de termostabilidad mejorada y/o actividad específica aumentada.

Antecedentes de la técnica [0004] Una fitasa derivada de Peniophora lycii se describe en WO 98/28408, y algunas variantes de las mismas en WO 99/49022 (ver por ejemplo reivindicación 31 a p. 76-77) .

Resumen de la invención [0005] La presente invención se refiere a una variante de una fitasa progenitora, de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96, la variante comprendiendo al menos una de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 20R; 29N, C, T; 45A; 63N; 69A; 92L; 93I; 95R, H, M, N, S, T; 97V; 98G; 99D; 102I; 110Y, R, W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C, R; 157K; 160R; 163P; 183K, A, W, G; 185A, H, N, P, K; 187G; 190S, K; 191L, R, S; 194R; 199S; 205S; 210G; 218T; 222I; 234K, S; 248A, C, D, E, G, H, S, T; 286S; 321A; 323A; 324S, L; 328T; 330R;

45 334E, D, G; 343N; 344A, V, S; 345D, H; 347Q, P; 349M, K; 350T, M, I, L; 384s, A; 395G; 398T; 409S; 421R, S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 429I; y 430M; donde (a) la variante tiene actividad de fitasa;

(b) cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº : 2 y 50 (c) la variante tiene un porcentaje de identidad a la SEC ID nº : 2 de al menos 75%.

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican la variante de fitasa y a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos al igual que a métodos para producir y usar las variantes de fitasa.

55 Breve descripción de las figuras [0007] La Figura 1 proporciona las coordenadas para la estructura 3D de una fitasa de Peniophora lycii que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº : 2.

60 Descripción detallada de la invención

Estructura tridimensional de la fitasa de Peniophora [0008] La estructura de la fitasa de Peniophora lycii fue resuelta conforme a los principios para los métodos cristalográficos por rayos X como se dan, por ejemplo, en X-Ray Structure Determination, Stout, G.K. y Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989. Las coordenadas estructurales para la estructura cristalina a una resolución de 2.2 Ã usando el método de sustitución isomoría se dan en la Fig. 1 en el formato estándar de PDB (Protein Data Bank, Brookhaven National Laborator y , Brookhaven, CT) . El fichero PDB de la figura 1 se refiere a una parte sólo de la secuencia de esta fitasa, es decir la parte correspondiente a los residuos 22-422 de SEC ID nº : 2.

Dinámica Molecular (MD)

Simulaciones de la Dinámica Molecular (MD) son indicativas de la movilidad de los aminoácidos en una estructura de proteína (véase McCammon, JA y Harvey, SC., (1987) , "Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press) . Tal dinámica de proteína es frecuentemente comparada con los B-factores cristalográficos (véase Stout, GH y Jensen, LH, (1989) , "X-ray structure determination", Wiley) . Al realizar la simulación por MD, por ejemplo, a temperaturas diferentes, la movilidad relacionada con la temperatura de los residuos es simulada. Las regiones con la movilidad o flexibilidad más alta (aquí fluctuaciones isotrópicas) se pueden sugerir para la mutagénesis aleatoria. Se entiende aquí que la alta movilidad encontrada en ciertas áreas de la proteína, puede ser térmicamente mejorada por la substitución de estos residuos.

Usando el programa CHARMM (Simulaciones Moleculares (MSI) ) , la estructura de la fitasa de Peniophora anteriormente descrita fue sometida a MD a 300, 350, 400, 450, y 500K durante 300 y 600ps y luego minimizada usando 300 pasos de Máxima Pendiente (Steepest Descent) , 600 pasos de Gradientes Conjugados, y 3000 pasos de ABNR con una calidad de tolerancia de 0.001kcal/mol.

Las siguientes regiones sugeridas para mutagénesis resultan de las simulaciones por MD: MD a 300 y 400K sin agua: 37-48, 91-119, 232-238, 300-308, 325-335, 343-348; MD a 300 y 400K con agua: 407-412; MD a 300K sin agua: 229-236; MD en una caja de agua cúbica con bordes periódicos: 123-126, 154-157, 204-216, 284-289, 419-423.

Las siguientes regiones sugeridas para mutagénesis resultan de evaluaciones de los B-factores en la estructura en X: 73-83, 207-217.

Las regiones anteriores se pueden combinar de la siguiente manera: 37-48, 73-83, 91-119, 123-126, 154-157, 204217, 229-238, 284-289, 300-308, 325-335, 343-348, 407-412, 419-423.

Otras regiones que resultan de simulaciones por MD son: 154-163, 204-218, 323-335, 342-350.

Otras regiones que resultan de evaluación de B-factores son: 1-29, preferiblemente 1-28, 59-106, 169-171, 178-247, 339-344, 367-371, 417 en adelante. Regiones más preferidas son: 1-24, 69-94, 182-188, 199-220, 229-241, 368-370, 420

423.

Sitio activo y cubiertas de unión de sustrato [0016] Programas conocidos en la técnica, tales como INSIGHTII de Molecular Simulations MSI, San Diego, California pueden utilizarse para definir cubiertas de sitio activo que comprenden aquellos residuos de aminoácidos que son muy próximos a los residuos catalíticos (H55, D319, R54) . Cubiertas de unión de sustrato pueden también ser definidas, comprendiendo aquellos residuos de aminoácidos que están muy próximos al sitio de unión de sustrato (H55; R54; R139 N320) y que se puede prever por lo tanto que estén en contacto con el sustrato. Proximidad cercana puede ser definida como, por ejemplo, 0Ã, 15Ã, 16Ã, o 20Ã, de los residuos pertinentes. Información sobre la unión de sustrato se puede deducir quitando el ácido fítico o un derivado tal como inositol-1, 4, 5-trifosfato (base de datos Brookhaven archivo 1djx. Inositol-1, 4, 5-trifosfato) en el corte del sitio activo (los residuos formando la superficie del sitio activo.

Estrategia para preparar variantes [0017] Con base en la estructura 3D de la figura 1 y la SEC ID nº : 2, y el estudio siguiente del sitio activo y cubiertas de unión de sustrato (16Ã, preferiblemente 15Ã, más preferiblemente 10Ã) , al igual que la dinámica molecular, las siguientes regiones fueron sugeridas para mutagénesis, principalmente... [Seguir leyendo]

1. Variante de una fitasa progenitora de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96, la variante comprendiendo al menos una de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 20R; 29N, C, T; 45A; 63N; 69A; 92L; 931, 95R, H, M, N, S, T; 97V; 98G; 99D; 1021, 110Y, R, W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C, R; 157K; 160R; 163P; 183K, A, W, G; 185A, H, N, P, K; 187G; 190S, K; 191L, R, S; 194R; 199S; 205S; 210G; 218T; 2221, 234K, S; 248A, C, D, E, G, H, S, T; 286S; 321A; 323A; 324S, L; 328T; 330R; 334E, D, G; 343N; 344A, V, S; 345D, H; 347Q, P; 349M, K; 350T, M, I, L; 384S, A; 395G; 398T; 409S; 421 R, S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 4291 y 430M; donde

(a) la variante tiene actividad de fitasa;

(b) cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº : 2 y

(c) la variante tiene un porcentaje de identidad a la SEC ID nº : 2 de al menos 75%.

2. Variante según la reivindicación 1, que comprende una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del siguiente grupo de sustituciones y combinaciones de sustituciones:

(i) 20R+95R+97V+98G;

(ii) 29N+1021;

(iii) 29N+118A;

(iv) 29N+163P+324S;

(v) 29N+163P+324S+395G;

(vi) 29N+234S;

(vii) 29N+324S;

(viii) 29S;

(ix) 29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V;

(x) 29S+63N +125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S;

(xi) 29S+95H+110W+183W+324A+350V;

(xii) 29S+95M+110W+183W+324A+350V;

(xiii) 29S+95N+110R+183W+324A+350V;

(xiv) 29S+95R+110W+183W+324A+350V;

(xv) 29S+95S+110R+183W+324A+350V;

(xvi) 29S+95S+110W+183W+324A+350V;

(xvii) 29S+95T+110R+183W+324A+350V;

(xviii) 29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V;

(xix) 29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V;

(xx) 29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V;

(xxi) 29S+95T+110Y+157K+183W+185H+187R+190S+191R+248G+324A+350V;

(xxii) 29S+95T+110Y+183W+185A+248A+324A+350V;

(xxiii) 29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V;

(xxiv) 29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V;

(xxv) 29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V;

(xxvi) 29S+95T+110Y+183W+185E+248S+324A+350V;

(xxvii) 29S+95T+110Y+183W+185H+248G+321A+323A+324A+350V;

(xxviii) 29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V;

(xxix) 29S+95T+110Y+183W+185H+187S+190K+191S+210G+222I+248G+324A+350 V;

(xxx) 29S+95T+110Y+183W+185K+248G+324A+349K+350L;

(xxxi) 29S+95T+110Y+183W+185K+248S+324A+350V;

(xxxii) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349A+350L;

(xxxiii) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350I;

(xxxiv) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350M;

(xxxv) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+350V;

(xxxvi) 29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V;

(xxxvii) 29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V;

(xxxviii) 29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V;

(xxxix) 29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V;

(xl) 29S+95T+110Y+183W+324A;

(xli) 29S+95T+110Y+183W+324A+350V;

(xlii) 29S+99D+125D+324A+334E+350V;

(xliii) 29S+110Y+183W+185N+324A+350V;

(xliv) 29S+125D+218T+324A+344S+350V;

(xlv) 29S+125D+234K+324A+330R;

(xlvi) 29S+125D+234K+324A+330R+395G;

(xlvii) 29S+125D+324A;

(xlviii) 29S+125D+324A+330R+395G;

(xlix) 29S+125D+324A+350V;

(l) 29S+183A+324A+350V;

(li) 29S+183G+324A+334E+344S+350V;

(lii) 29S+183W+324A+350V;

(liii) 29S+205S;

(liv) 29S+324A+350V;

(lv) 29T+324L;

(lvi) 45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M;

(lvii) 69A+334E;

(lviii) 99D+398T;

(lix) 114A+187G+194R+324S;

(lx) 218T+334G;

(lxi) 323A+324S;

(lxii) 324S;

(lxiii) 324S+328T;

(lxiv) 324S+345D+347Q;

(lxv) 324S+395G;

(lxvi) 330R;

(lxvii) 334D+343N+344V;

(lxviii) 334E+344A;

(lxix) 345H+347P+350V; y (lxx) 350V.

3. Secuencia de ácidos nucléicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucléicos que codifica la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Constructo de ácidos nucléicos que comprende la secuencia de ácidos nucléicos según la reivindicación 3 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

5. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 4.

6. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 4 y/o el vector de expresión según la reivindicación 5.

7. Método para la producción de la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende

(a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 6 para producir un sobrenadante que comprende la variante; y

(b) recuperar la variante.

8. Planta transgénica, o parte de la planta que expresa una variante de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos del mismo que expresa una variante de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1- 2.

10. Composición que comprende al menos una variante de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y

(a) al menos una vitamina soluble en grasa;

(b) al menos una vitamina soluble en agua; y/o

(c) al menos un oligoelemento.

11. Composición según la reivindicación 10 que comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: xilanasas, endoglucanasas, endo-1, 3 (4) -beta-glucanasas, y proteasas.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 que es un aditivo de pienso para animales.

13. Composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprendiendo la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12.

14. Método para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales, donde la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12 se añade al pienso.

15. Proceso para reducir los niveles de fitato en el abono de origen animal que comprende alimentar a un animal con una cantidad eficaz del pienso según la reivindicación 13.

16. Método para el tratamiento de proteínas vegetales, que comprende el paso de añadir la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12 al menos a una proteína vegetal o fuente de proteína.

17. Uso de la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12 en el pienso para animales; en la preparación de pienso para animales; para mejorar el valor nutritivo del pienso para animales; para reducir los niveles de fitato en el abono de origen animal; para el tratamiento de proteínas vegetales; o para liberar fósforo de un sustrato de fitasa.