VARIANTE DE LA GHRELINA Y SUS USOS.
Variante de la ghrelina y sus usos.
La presente invención se refiere a una nueva variante de splicing de la ghrelina/obestatina,
denominada In2-ghrelina, y a su uso de manera aislada y/o en combinación con la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-R1b), para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030905.
Solicitante: SERVICIO ANDALUZ DE SALUD.
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: CASTAÑO FUENTES, JUSTO PASTOR, GRACIA NAVARRO, FRANCISCO, BENITO LÓPEZ,Pedro, LUQUE HUERTAS,Raúl Miguel, GAHETE ORTIZ,Manuel David, MARTÍNEZ FUENTES,Antonio Jesús, CÓRDOBA CHACÓN,José, KINEMAN,Rhonda Denisse.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/60 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factor de liberación de la hormona del crecimiento (GH-RF) (Somatoliberina).
- C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/574 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para el cáncer.
- G01N33/74 G01N 33/00 […] › en los que intervienen hormonas.
PDF original: ES-2372337_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Variante de la ghrelina y sus usos.
La presente invención se encuentra dentro de la biología molecular y la medicina, y se refiere a una nueva variante de splicing de la ghrelina/obestatina, denominada In2-ghrelina, y sus usos. En concreto, se refiere al uso de esta variante, de manera aislada y/o en combinación con la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-R1b), para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
Estado de la técnica anterior
La ghrelina es una hormona sintetizada fundamentalmente por el estómago (Kojima et al., 1999. Nature. 402 (6762): 656-60), aunque también se expresa en un amplio rango de tejidos donde actúa como factor paracrino o autocrino (Lago et al., 2005. Vitam Horm. 71: 405-32.; Tena-Sempere, 2005. Growth Horm IGF Res. 15 (2): 83-8.; Leite-Moreira and Soares, 2007. Drug Discov Today. 12 (7-8): 276-88.; Leontiou et al., 2007. Pituitary. 10 (3): 213-25.; Leite-Moreira et al., 2008. Vitam Horm. 77: 207-38). La ghrelina puede ser acilada por la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) y esta forma de ghrelina (AG) es el principal ligando endógeno del receptor de secretagogos de la hormona del crecimiento (GHS-R) de tipo 1a (GHS-R1a). Actualmente se sabe que el sistema ghrelina-acilada (AG)/GHS-R1a ejerce acciones en múltiples tejidos, muchos de ellos relacionados con la regulación de las funciones metabólicas (Tschop et al., 2000. Nature 407 (6806): 908-13; Horvath et al., 2001. Endocrinology. 142. (10): 4163-9; Nakazato et al., 2001. Nature. 409 (6817): 194-8; van der Lely et al., 2004. Endocr Rev. 25 (3): 426-57).
La ghrelina humana es codificada por el gen GHRL, cuya transcripción da lugar a un prepro-péptido inmaduro de 117 residuos (prepro-ghrelina) que, como se menciona anteriormente, puede ser acilado por la enzima GOAT y que, en todo caso, es procesado posteriormente por convertasas de prohormonas (PC1, PC7, Furin), originando la hormona activa (AG) o la teóricamente inactiva (ghrelina no-acilada o UAG) (Zhu et al., 2006. J. Biol Chem. 281 (50): 38867-70.; Garg, 2007. J Clin Endocrinol Metab. 92 (9): 3396-8). Clásicamente se ha considerado que el gen de la ghrelina humana consistía en 4 exones codificantes (Ex) y un Ex (Ex0) no codificante. El péptido señal de la prepro-ghrelina es codificado en Ex1, y la secuencia codificante (CDS) de la ghrelina madura es codificada por Ex2 y Ex3 (Kanamoto et al., 2004. Endocrinology. 145 (9): 4144-53.; Nakai et al, 2004. Life Sci. 75 (18): 2193-201).
Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la prepro-ghrelina también codifica otro péptido, la obestatina (Zhang et al., 2005. Science. 310 (5750): 996-9) cuya expresión tisular difiere de la exhibida por la ghrelina y posee acciones biológicas específicas (Karaoglu et al., 2009. Mol Cell Biochem. 323 (1-2): 113-8.; Tsolakis et al., 2009. Eur J Endocrinol. 160 (6): 941-9; Volante et al., 2009. J Pathol. Aug; 218(4):458-66). Además, un examen exhaustivo de la estructura genómica de la GHRL humana ha revelado que este gen, en realidad, ocupa 7,2 kb del DNA genómico (Seim et al., 2007. BMC genomics 8:298) y de hecho, se ha identificado un nuevo Ex (-1) y varias regiones de los Ex0 y Ex1. La expresión de estas recientemente identificadas regiones exónicas origina múltiples transcritos tejido-específicos que pueden carecer de ghrelina u obestatina e incluso codificar nuevos péptidos (Seim I et al., 2009. Clin Exp Pharmacol Physiol. 37(1):125-31.; Seim I et al., 2007. BMC Genomics 8:298). Además, se han descrito variantes de la prepro-ghrelina que carecen del exón 3 y, por lo tanto, de la obestatina. Esta isoforma se ha denominado exon3-deleted-ghrelin y se presenta en varios tipos de tumores (Jeffery et al., 2002. J. Endocrinol. 172 (3): R7-11; Jeffery et al., 2005b. Endocr Relat Cancer. 12 (4): 839-50.; Yeh et al., 2005. Clin Cancer Res. 11(23): 8295-303). Por último, se ha descrito la ocurrencia del proceso de retención de intrones en el gen de la ghrelina murina (Kineman et al., 2007. J Mol Endocrinol. 38 (5): 511-21). Específicamente, la retención del intrón 2 (In2) da lugar a una nueva isoforma de ARNm, denominada In2-ghrelina, que contiene los Ex2 y 3, pero carece de los Ex1, 4 y 5. Aunque la traducción del ARNm de la In2-ghrelina no está aún demostrada, su expresión es entre 10 y 50 veces mayor que la de la ghrelina nativa en la hipófisis y el hipotálamo, respectivamente, y más importante, el nivel de expresión del ARNm de esta isoforma se regula bajo condiciones metabólicas extremas (ayuno y obesidad) (Kineman et al., 2007. J Mol Endocrinol. 38 (5): 511-21).
Descripción de la invención
En la presente invención se demuestra la existencia de una nueva variante de splicing del gen GHRL humano, originada por la retención del In2, lo que da lugar a un transcrito alternativo que contiene Ex0, Ex1, In2, y Ex2 pero que carece de Ex3 y 4, denominado In2-ghrelina humana. Su traducción originaría un prepro-péptido de 117 aa que comparte con la prepro-ghrelina nativa el péptido señal (24 aa) y los 12 primeros aa y, por lo tanto, conserva el posible sitio de acilación por la GOAT en la Ser3. Este transcrito se expresa a diferentes niveles en los 22 tejidos humanos analizados, donde su expresión se correlaciona con la de GOAT (R2=0,921). Estos datos sugieren que la In2-ghrelina podría ser un sustrato primario de esta enzima en tejidos humanos. La secuencia peptídica inferida a partir del ARNm de la In2-ghrelina posee varios sitios de procesamiento por convertasas de prohormonas, lo que sugiere que, a partir del prepro-péptido codificado por la In2-ghrelina, se podrían originar diferentes productos peptídicos.
Los niveles de expresión de la In2-ghrelina humana están consistentemente aumentados en muestras de cáncer de mama en comparación con muestras normales. Además, en estas muestras tumorales, los niveles de expresión de la In2-ghrelina se correlacionan no solo con los niveles de expresión de la GOAT o el GHS-R1b, sino también con los niveles de expresión de dos marcadores de proliferación celular (Ki67 y ciclina D3). En líneas celulares derivadas de cáncer de mama, la sobreexpresión de esta variante provoca un incremento de la tasa basal de proliferación celular. Por último, tratamientos con la ghrelina nativa, la UAG y el tamoxifeno (la terapia endocrina estándar (antiestrogénica) usada en el tratamiento cáncer de mama) alteran los niveles de expresión de la In2-ghrelina en dichas líneas celulares.
Los niveles de expresión de la In2-ghrelina humana están consistentemente aumentados en muestras de tumores hipofosarios de distintos tipos (incluidos acromegalias, Cushing, prolactinoma, TSHoma (adenoma hipofisario secretor de tirotropina), así como tumores ectópicos) en comparación con muestras normales.
La In2-ghrelina humana presenta una expresión muy elevada en las líneas celulares derivadas de tumores de mama (MCF7, BT 549, SKBR 3, HBL 100), de ovario (SKOV 3, MDAH 2774), de endometrio (SKUT1, HEC 1B, AN3CA, HEC 265, KLE, ISHIKAWA) y de cérvix (HELA, SIHA).
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a la variante In2-ghrelina, cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de, al menos, un 80, y más preferiblemente al menos un 85, un 90, un 91, un 92, un 93, un 94, un 95, un 96, un 97, un 98, o un 99% con el péptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Aún más preferiblemente, la secuencia aminoacídica de la In2-ghrelina es la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 1. Por tanto, la SEQ ID NO: 1 constituye la secuencia aminoacídica de la In2-ghrelina, que es originada por el splicing alternativo del gen GHRL humano. La secuencia de ARNm se recoge en la SEQ ID NO: 10.
El término "identidad", tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos secuencias. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la variante de... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Variante In2-ghrelina cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de, al menos:
con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
2. Variante In2-ghrelina según la reivindicación anterior, cuya secuencia aminoacídica es la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 1.
3. Uso del ARNm que codifica para la variante In2-ghrelina o de sus productos peptídicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, como marcadores para la obtención de datos útiles en el diagnóstico pronóstico, o seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
4. Uso del ARNm que codifica para la variante In2-ghrelina o de sus productos peptídicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en combinación con los productos de expresión del gen de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), del ARNm o proteína de la variante truncada del receptor de la ghrelina (GHS-R1b), o ambos, como marcadores para la obtención de datos útiles en el diagnóstico pronóstico, o seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
5. Método de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix que comprende:
6. Método de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix según la reivindicación anterior, donde el paso (b) además comprende detectar los productos de expresión del gen de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), el ARNm o proteína de la variante truncada del receptor de la ghrelina (GHS-R1b), o ambos.
7. Método de seguimiento de la evolución del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix que comprende realizar al menos dos veces la secuencia de pasos (a)-(c) según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en muestras obtenidas de un mismo individuo de manera no simultánea.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde la detección de los productos de expresión se realiza mediante RT-PCR.
9. Kit o dispositivo que comprende cebadores y/o sondas para analizar la cantidad de ARNm de la variante In2-ghrelina, o la In2-ghrelina según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en una muestra biológica aislada.
10. Kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
11. Kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, que además comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7.
12. Método para identificar sustancias químicas útiles en el tratamiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix que comprende:
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