VACUNAS MEJORADAS.

Una vacuna para prevenir infecciones con virus de influenza que comprende - un antígeno de influenza,

- un péptido con la secuencia de aminoácidos KLKL5KLK, y - una molécula de ácido oligodesoxinucleico inmunoestimulante que se selecciona de oligodesoxinucleótidos d(IC)13, tcc atg aci ttc ctg atg ct y tcc atg aci ttc ctg atg ct sustituido con tiofosfato

La presente invención se refiere a vacunas mejoradas, especialmente a vacunas virales y a procedimientos de preparación de las mismas.

La protección del huésped frente a patógenos invasores implica a efectores humorales y celulares y es el resultado de la acción coordinada de la inmunidad tanto no adaptativa (innata) como adaptativa (adquirida). La última se basa en el reconocimiento inmunológico específico mediado por receptores, es una adquisición reciente del sistema inmune y está presente sólo en vertebrados. La primera evolucionó antes del desarrollo de la inmunidad adaptativa, y consiste en una diversidad de células y moléculas distribuidas por todo el organismo con la tarea de mantener a patógenos potenciales bajo control.

Los linfocitos B y T son los mediadores de la inmunidad adaptativa específica de antígeno adquirida, incluyendo el desarrollo de memoria inmunológica, que es el objetivo principal de generar una vacuna con éxito. Las células presentadoras de antígeno (CPA) son células altamente especializadas que pueden procesar antígenos y presentar sus fragmentos procesados en la superficie celular junto con moléculas necesarias para la activación de linfocitos. Esto significa que las CPA son muy importantes para el inicio de reacciones inmunes específicas. Las CPA principales para la activación de linfocitos T son células dendríticas (CD), macrófagos y células B, mientras que las CPA principales para las células B son células dendríticas foliculares. En general, las CD son las CPA más potentes en términos del inicio de respuestas inmunes que estimulen linfocitos T y B de memoria y sin exposición previa quiescentes.

La tarea natural de las CPA en la periferia (por ejemplo, CD o células de Langerhans) es capturar y procesar antígenos, activándose de este modo, comienzan a expresar moléculas coestimulantes de linfocitos, a migrar a órganos linfoides, a secretar citocinas y a presentar antígenos a diferentes poblaciones de linfocitos, iniciando respuestas inmunes específicas de antígeno. No sólo activan linfocitos, en determinadas circunstancias, también inducen tolerancia de células T a antígenos.

El reconocimiento de antígenos por linfocitos T está restringido por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Un linfocito T dado reconocerá un antígeno solamente cuando el péptido esté unido a una molécula del CMH particular. En general, los linfocitos T se estimulan solamente en presencia de moléculas propias del CMH y el antígeno se reconoce solamente como péptidos unidos a moléculas propias del CMH. La restricción por CMH define la especificidad del linfocito T en términos del antígeno reconocido y en términos de la molécula de CMH que se une a su fragmento peptídico.

Los antígenos intracelulares y extracelulares representan desafíos completamente diferentes para el sistema inmune, ambos en términos del reconocimiento y de la respuesta apropiada. La presentación de antígenos a células T está mediada por dos clases distintas de moléculas CMH de clase I (CMH-I) y CMH de clase II (CMH-II), que utilizan rutas de procesamiento de antígenos diferentes. Principalmente se podría distinguir entre dos rutas de procesamiento de antígenos principales que han evolucionado. Los péptidos derivados de antígenos intracelulares se presentan a células T CD8+ por moléculas del CMH de clase I que se expresan en prácticamente todas las células, mientras que los péptidos derivados de antígenos extracelulares se presentan a células T CD4+ por moléculas del CMH-II. Sin embargo, existen ciertas excepciones a esta dicotomía. Varios estudios han demostrado que los péptidos generados a partir de proteínas solubles o particulados endocitados se presentan en moléculas del CMH-I en macrófagos, así como en células dendríticas. Por lo tanto, las CPA, como células dendríticas que se asientan en la periferia, que ejercen una alta potencia para capturar y procesar antígenos extracelulares y que los presentan en moléculas del CMH-I a los linfocitos T, son dianas interesantes para estimularlas extracelularmente con antígenos in vitro e in vivo.

El singular e importante papel de las CPA, incluyendo su actividad estimulante sobre diferentes tipos de leucocitos, es reflejar su posición central como dianas para estrategias apropiadas en el desarrollo de vacunas de éxito. Teóricamente, una forma de hacerlo es aumentar o estimular su tarea natural, la captación de un antígeno o antígenos. Una vez estimuladas con los antígenos apropiados contra los que se dirige la vacuna, las CPA deberían comenzar a procesar el antígeno o antígenos captados, activándose de este modo, expresando moléculas coestimulantes de linfocitos, migrando a órganos linfoides, secretando citocinas y presentando antígenos a diferentes poblaciones de linfocitos, iniciando de este modo respuestas inmunes.

Las células T activadas generalmente secretan varias citocinas efectoras de una forma altamente regulada, por ejemplo, interleucina 2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-10 e interferón gamma (IFN-g). La detección funcional de respuestas de linfocitos T citotóxicos a antígenos específicos (por ejemplo, antígenos tumorales, en general antígenos administrados en una vacuna) se controla comúnmente mediante un ensayo ELISpot (ensayo inmune de manchas ligado a enzimas), una técnica que analiza la producción de citocinas a nivel celular individual. En la presente invención, se usa un ensayo ELISpot para la inmunidad celular (respuesta inmune de tipo 1) que promueve la citocina IFN-g para controlar el éxito de la activación de células T específicas de antígeno. Además, la citocina IL-4 se determina como un indicador para una respuesta de tipo 2, habitualmente implicada en promover respuestas humorales potentes. Además, la respuesta inmune humoral se determinó por ELISA (IgG1 como indicador

para una respuesta de tipo 2, IgG2b como indicador para una respuesta de tipo 1).

Se ha demostrado previamente que los policationes aumentan eficazmente la captación de los péptidos correspondientes al CMH clase I en células tumorales, un proceso de estimulación con péptido o proteína que se denominó “TRANScarga”. Además, se ha demostrado que los policationes son capaces de “TRANScargar” péptidos o proteínas en células presentadoras de antígenos in vivo así como in vitro. Además, la coinyección de una mezcla de poli-L-arginina o poli-L-lisina junto con un péptido apropiado como vacuna protege a los animales del desarrollo de tumores en modelos de ratón. Esta vacuna definida químicamente es capaz de inducir un alto número de células T específicas de péptido/antígeno. Se demostró que eso era al menos parcialmente atribuible a una captación aumentada de péptidos en CPA mediada por el policatión que indica que cuando las CPA se estimulan in vivo con antígenos pueden inducir una inmunidad mediada por células T contra el antígeno administrado.

Al contrario que la inmunidad adaptativa, que se caracteriza por una respuesta altamente específica pero relativamente lenta, la inmunidad innata se basa en mecanismos efectores que se desencadenan por diferencias en la estructura de los componentes microbianos respecto al huésped. Estos mecanismos pueden generar una respuesta inicial bastante rápida que, principalmente, conduce a la neutralización de los agentes nocivos. Las reacciones de la inmunidad innata son la única estrategia de defensa de los filos inferiores y se han conservado en vertebrados como defensa del huésped de primera línea antes de que se movilice el sistema inmune adaptativo.

En vertebrados superiores las células efectoras de la inmunidad innata son neutrófilos, macrófagos y linfocitos citolíticos naturales, y probablemente también células dendríticas, mientras que los componentes humorales en esta ruta son la cascada del complemento y una diversidad de proteínas de unión diferentes.

Un componente rápido y eficaz de la inmunidad innata es la producción de una gran diversidad de péptidos microbicidas con una longitud de habitualmente entre aproximadamente 12 y aproximadamente cien restos aminoacídicos. Se han aislado varios cientos de péptidos antimicrobianos diferentes a partir de una diversidad de organismos, que varían de esponjas e insectos a animales y seres humanos, lo que apunta a una amplia distribución de estas moléculas. También se producen péptidos antimicrobianos por bacterias como sustancias antagonistas contra organismos competidores.

Se han identificado dos subconjuntos principales de células CD4+ (T auxiliares 1 (Th1) y T auxiliares...

1. Una vacuna para prevenir infecciones con virus de influenza que comprende -un antígeno de influenza, -un péptido con la secuencia de aminoácidos KLKL5KLK, y -una molécula de ácido oligodesoxinucleico inmunoestimulante que se selecciona de oligodesoxinucleótidos d(IC)13, tcc atg aci ttc ctg atg ct y tcc atg aci ttc ctg atg ct sustituido con tiofosfato.

2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene además un adyuvante de Al(OH)3.

3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque dicho antígeno es un antígeno de hemaglutinina o neuraminidasa.

4. Uso de una combinación de un antígeno de influenza, un péptido con la secuencia de aminoácidos KLKL5KLK y una molécula de ácido oligodesoxinucleico inmunoestimulante que se selecciona de oligodesoxinucleótidos d(IC)13, tcc atg aci ttc ctg atg ct y tcc atg aci ttc ctg atg ct sustituido con tiofosfato, para la fabricación de una vacuna contra virus de influenza con una eficacia protectora mejorada frente a una infección con virus de influenza.

5. Uso de una combinación de un antígeno de influenza, un péptido con la secuencia de aminoácidos KLKL5KLK y una molécula de ácido oligodesoxinucleico inmunoestimulante que se selecciona de oligodesoxinucleótidos d(IC)13, tcc atg aci ttc ctg atg ct y tcc atg aci ttc ctg atg ct sustituido con tiofosfato, para la fabricación de una vacuna contra virus de influenza con una respuesta de tipo 1 específica de antígeno mejorada, especialmente una respuesta de anticuerpos IgG2 o una respuesta de IFN-gamma, contra infecciones con virus de influenza, y que al mismo tiempo conserve o preferentemente también aumente la respuesta de tipo 2, especialmente la respuesta de anticuerpos IgG1 o la respuesta de interleucina 4 (IL-4), de dicha vacuna.

6. Uso de la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque la vacuna comprende un antígeno de hemaglutinina o un antígeno de neuraminidasa.