Utilización de inhibidores peptídicos permeables celulares de la vía de transducción de señales JNK para el tratamiento de diversas enfermedades.

Utilización de un péptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO:

2 o de un péptido quimérico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2, estando el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias seleccionadas de entre asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), neumonía, inflamación pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, meningitis, esclerosis múltiple, hepatitis, endometriosis, meningoencefalitis primavero-estival (ESME), encefalitis japonesa, poliomielitis, reacciones de rechazo al injerto o de rechazo al transplante.

Utilizacion de inhibidores peptidicos permeables celulares de la via de transduccion desenales JNK para el tratamiento de diversas enfermedades.

La presente invencion se refiere a la utilizacion de inhibidores de proteina quinasa y mas especificamente al uso de inhibidores de la proteina quinasa amino terminal c-Jun, de secuencias inhibidoras de JNK, de peptidos quimericos o composiciones farmaceuticas que los contienen, para el tratamiento de diverass enfermedades o trastornos relacionados con la senalizacion de JNK, seleccionandose dichas enfermedades o transtornos de entre enfermedades inflamatorias.

La quinasa amino terminal c-Jun (JNK) es un miembro del grupo activado por estres de las proteina quinasas activadas por mitogeno (MAP) . Estas quinasas estan implicadas en el control del crecimiento y la diferenciacion celular y, en general, en la respuesta celular a estimulos ambientales. La via de transduccion de las senales JNK es activada en respuesta al estres ambiental y por la union de varias clases de receptores de la superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores citocina, receptores serpentina y tirosinquinasas receptoras. En las celulas de mamifero, la JNK esta implicada en procesos biologicos como la transformacion oncogenica y en respuestas mediadoras de adaptacion al estres ambiental. La JNK tambien se asocia a la respuesta inmunomoduladora, incluyendo a la maduracion y diferenciacion de celulas inmunitarias, ademas Para llevar a cabo la muerte celular programada en aquellas celulas identificadas para su destruccion por el sistema inmunitario. Esta propiedad excepcional convierte a la senalizacion JNK en un objetivo prometedor para desarrollar una intervencion farmacologica. Entre otros trastornos neurologicos, la senalizacion de JNK esta particularmente implicada en la apoplejia isquemica y en la enfermedad de Parkinson, pero tambien en otras enfermedades que se mencionaran a continuacion. Ademas, la proteina quinasa activada por mitogeno (MAPK) p38alfa se ha demostrado que regula negativamente la proliferacion celular mediante la antagonizacion de la via JNK-cJun. Por tanto, la proteina quinasa activada por mitogeno (MAPK) p38alfa parece ser activa en la supresion de la proliferacion de celulas normales y cancerosas y, ademas se ha demostrado la implicacion de JNK en enfermedades cancerosas (ver por ejemplo, Hui y col., Nature Genetics, Vol 39, No. 6, Junio 2007) . Tambien se ha demostrado que la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) esta involucrada en el dolor neuropatico producido por ligacion del nervio espinal (SNL) , donde la SNL induce una activacion lenta y persistente de JNK, en particular JNK1, mientras que la activacion de la proteina quinasa activada por mitogeno p38 se hallo en microgliocitos espinales despues de la SNL, cayendo a un nivel casi basal a los 21 dias (Zhuang y col., The Journal of Neuroscience, 29 de marzo de 2006, 26 (13) : 3551-3560) ) .

Asi, la inhibicion o interrupcion de la via de senalizacion JNK, particularmente la provision de inhibidores de la via de senalizacion JNK, parece una potencial via para combatir trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK. Sin embargo, actualmente solo se conocen unos pocos inhibidores de la via de senalizacion JNK.

Como es sabido de la tecnica anterior, los inhibidores de la via de senalizacion JNK incluyen particularmente, por ejemplo, inhibidores quinasa aguas arriba (por ejemplo, CEP-1347) , inhibidores quimicos pequenos de JNK (SP600125 y AS601245) , que afectan directamente a la actividad quinasa, por ejemplo compitiendo con el sitio de adhesion ATP de la proteina quinasa, e inhibidores de peptidos de la interaccion entre JNK y sus sustratos (D-JNKI e I-JIP) (ver por ejemplo Kuan y col., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, febrero 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67 (5) ) .

El inhibidor de quinasa aguas arriba CEP-1347 (KT7515) es un inhibidor semi-sintetico de la familia quinasa de linaje mixto. CEP-1347 (KT7515) promueve la supervivencia neuronal en dosis que inhiben la activacion de las quinasas amino-terminales c-Jun (JNKs) en cultivos embrionicos primarios y celulas PC12 diferenciadas despues de retirada trofica y en ratones tratados con 1-metil-4-feniltetrahidropiridina. Ademas, CEP-1347 (KT7515) puede promover la supervivencia a largo plazo de neuronas motoras y ciliares del ganglio simpatico de la espina dorsal embrionica del pollo (ver, por ejemplo, Borasioy col., Neuroreport, 9 (7) : 1435-1439, 11 de Mayo de 1998) .

El inhibidor quimico pequeno JNK SP600125 demostro reducir los niveles de fosforilacion de c-Jun para proteger las neuronas dopaminergicas contra la apoptosis y para restaurar parcialmente el nivel de dopamina en PD inducido por MPTP en ratones C57BLl6N (Wang y col., Neurosci Res. 2004 Feb; 48 (2) ; 195-202) . Estos resultados indican ademas que la via JNK es el mediador principal de los efectos neurotoxicos de MPTP in vivo y que la inhibicion de la actividad de JNK puede representar una estrategia nueva y eficaz para tratar el parkinson.

Otro ejemplo de inhibidores quimicos pequenos es el inhibidor JNK AS601245 arriba mencionado. El AS601245 inhibe la via de senalizacion JNK y promueve la supervivencia celular despues de isquemia cerebral. In vivo, AS601245proporciono proteccion significativa contra la perdida tardia de neuronas CA1 del hipocampo en un modelo de jerbo con isquemia global transitoria. Este efecto es mediado por la inhibicion de JNK y, por tanto, por la expresion y fosforilacion de c-Jun (ver por ejemplo Carboni y col., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310 (1) :25-32. Epub 26 de febrero de 2004) .

Una tercera clase de inhibidores de la via de senalizacion JNK es la representada por los inhibidores peptidicos de la interaccion entre JNK y sus sustratos, tal como se ha mencionado anteriormente. Como punto de partida para la construccion de dichos peptidos inhibidores JNK, puede empelarse una alineacion de secuencias de la proteina JNK natural. Tipicamente estas proteinas comprenden dominios de JNK (JBDs) y ocurren en varias proteinas de adhesion a insulina (IB) tales como IB1 o IB2. El resultado de dicha alineacion de secuencia iliustrativa es, por ejemplo, una alineacion de secuencia entre los dominios de adhesion JNQ de IB1 [SEC ID NO: 13], IB2 [SEC ID NO: 14], c-Jun [SEC ID NO: 15] y ATF2 [SECID NO: 16] (ver las FIG. 1A-1C) . Dicha alineacion revela una secuencia de ocho aminoacidos parcialmente conservada (ver por ejemplo FIG. 1A) . Una comparacion de los JBDs de IB1 e IB2 revela ademas dos bloques de siete y tres aminoacidos altamente conservados entre las dos secuencias.

Secuencias construidas en base a dicha alineacion se han descrito por ejemplo en WO 01l27268 o WO 2007l031280. WO 2007l031280 y WO 01l27268 describen peptidos de fusion permeables de celulas pequenas, que comprenden la secuencia de permeabilidad celular denominada TAT, derivada de la secuencia basica de trafico de la proteina HIV-TAT, y una secuencia inhibidora minima de 20 aminoacidos de IB1. Ambos componentes estan unidos covalentemente uno al otro. Ejemplos (actualmente el unico) de inhibidores de la via de senalizacion MAPK-JNK descritos tanto en la WO 2007l031280 como en la WO 01l27268 son L-JNKI1 (peptido inhibidor de JNK compuesto por aminoacidos-L) o los peptidos D-JNKI1 resistentes a proteasa (peptido inhibidor de JNK compuesto por aminoacidos-D no naturales) . Estos peptidos inhibidores de JNK (JNKI) son especificos para JNK (JNK1, JNK2 y JNK3) . En contraste con aquellos inhibidores de compuestos de celulas pequenas que se discutieron anteriormente, las secuencias inhibidoras de WO 2007l031280 o WO 01l27268, por ejemplo JNKI1, inhiben mas bien la interaccion entre JNK y su sustrato. Mediante esta secuencia de trafico derivada de TAT, el peptido de fusion es transportado eficientemente a las celulas. Debido a las nuevas propiedades obtenidas por el componente de trafico, los peptidos de fusion son transportados activamente a las celulas, donde mantienen sus efectos hasta la degradacion proteolitica.

Sin embargo, los peptidos segun WO 2007l031280 o WO 01l27268 demuestran ser activos solo para un numero de enfermedades particularmente limitado, en particular enfermedades proliferativas de celulas no malignas o proliferativas de celulas inmunologicamente relacionadas.

Asi, un objeto de la presente invencion consiste en identificar otras enfermedades que pueden combatirse con los peptidos inhibidores de JNK. Otro objeto de la presente invencion es proporcionar (el uso de) peptidos inhibidores de JNK y derivados de los mismos para el tratamiento de dichas enfermedades, asi como de enfermedades que todavia no son conocidas o son ya conocidas por su estrecha relacion con la senalizacion de JNK.

Este objeto se resuelve mediante la utilizacion de una secuencia inhibidora de JNK tal... [Seguir leyendo]

1. Utilizacion de un peptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o de un peptido quimerico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de trafico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2, estando el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias seleccionadas de entre asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) , neumonia, inflamacion pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis quistica, meningitis, esclerosis multiple, hepatitis, endometriosis, meningoencefalitis primavero-estival (ESME) , encefalitis japonesa, poliomielitis, reacciones de rechazo al injerto o de rechazo al transplante.

2. Utilizacion segun la reivindicacion 1, caracterizada porque la secuencia de trafico del peptido quimerico comprende la secuencia de aminoacidos de un polipeptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana.

3. Utilizacion segun las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque la secuencia de trafico del peptido quimerico consiste o comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 5, 6, 7, 8, 21 o 22.

4. Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la secuencia de trafico del peptido quimerico aumenta la absorcion celular del peptido ylo dirige la localizacion nuclear del peptido.

5. Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el peptido quimerico consiste en la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 11.

6. Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composicion farmaceutica se administra mediante una via de administracion seleccionada de entre el grupo consistente en vias parenterales, incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, transdermica, vias enterales, incluyendo oral, rectal, vias topicas, incluyendo nasal, intranasal, y otras vias, incluyendo epidermica y liberacion desde parches.

7. Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la dosis (por kg de peso corporal) del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico oscila en el intervalo de hasta 10 mmollkg, preferentemente de hasta 1 mmollkg, de forma especialmente preferente de hasta 100 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 10 Imollkg, de forma particularmente preferente de hasta 1 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 100 nmollkg y de forma totalmente preferente de hasta 50 nmollkg.

8. Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la dosis del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico esta en el intervalo de aproximadamente 1 pmollkg a aproximadamente 1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg a aproximadamente 0, 1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg a aproximadamente 0, 01 mmollkg, entre aproximadamente 50 pmollkg a aproximadamente 1 Imollkg, entre aproximadamente 100 pmollkg a aproximadamente 500 nmollkg, entre aproximadamente 200 pmollkg a aproximadamente 300 nmollkg, entre aproximadamente 300 pmollkg a aproximadamente 100 nmollkg, entre aproximadamente 500 pmollkg a aproximadamente 50 nmollkg, entre aproximadamente 750 pmollkg a aproximadamente 30 nmollkg, entre aproximadamente 250 pmollkg a aproximadamente 5 nmollkg, entre aproximadamente 1 nmollkg a aproximadamente 10 nmollkg, o una combinacion de dos cualesquiera de estos valores.

9. Peptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o peptido quimerico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de trafico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2, estando el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad inflamatoria seleccionada de entre asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) , neumonia, inflamacion pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis quistica, meningitis, esclerosis multiple, hepatitis, endometriosis, meningoencefalitis primavero-estival (ESME) , encefalitis japonesa, poliomielitis, reacciones de rechazo al injerto o de rechazo al transplante.

10. Peptido quimerico para su uso segun la reivindicacion 9, caracterizado porque la secuencia de trafico comprende la secuencia de aminoacidos de un polipeptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana.

11. Peptido quimerico para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, caracterizado porque la secuencia de trafico consiste o comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 5, 6, 7, 8, 21 o 22.

12. Peptido quimerico para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la secuencia de trafico aumenta la absorcion celular del peptido ylo dirige la localizacion nuclear del peptido.

13. Peptido quimerico previsto para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque el peptido quimerico consiste en la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 11.

14. Peptido inhibidor de JNK para su uso segun la reivindicacion 9 o peptido quimerico segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque el peptido inhibidor de JNK o el peptido quimerico se administra

mediante una via de administracion seleccionada de entre el grupo consistente en vias parenterales, incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, transdermica, vias enterales, incluyendo oral, rectal, vias topicas, incluyendo nasal, intranasal, y otras vias, incluyendo epidermica y liberacion desde parches.

15. Peptido inhibidor de JNK para su uso segun la reivindicacion 9 o 14, o peptido quimerico segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque una dosis (por kg de peso corporal) del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico oscila en el intervalo de hasta 10 mmollkg, preferentemente de hasta 1 mmollkg, de forma especialmente preferente de hasta 100 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 10 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 1 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 100 nmollkg, y de forma totalmente preferente de hasta 50 nmollkg.

16. Peptido inhibidor de JNK para su uso segun la reivindicacion 9, 14 o 15 o peptido quimerico segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizado porque una dosis del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico oscila entre aproximadamente 1 pmollkg y aproximadamente 1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg y aproximadamente 0, 1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg y aproximadamente 0, 01 mmollkg, entre aproximadamente 50 pmollkg y aproximadamente 1 Imollkg, entre aproximadamente 100

pmollkg y aproximadamente 500 nmollkg, entre aproximadamente 200 pmollkg y aproximadamente 300 nmollkg, entre aproximadamente 300 pmollkg y aproximadamente 100 nmollkg, entre aproximadamente 500 pmollkg y aproximadamente 50 nmollkg, entre aproximadamente 750 pmollkg y aproximadamente 30 nmollkg, entre aproximadamente 250 pmollkg y aproximadamente 5 nmollkg, entre aproximadamente 1 nmollkg y aproximadamente 10 nmollkg, o una combinacion de dos cualesquiera de estos valores.

ººººººººººººººº

Secuenciasºdeºpeptidos, ºiumano, ºratónºyºrata

Señal AlphaScreen (cps)

Señal AlphaScreen (cps)

número de pocillos Citoquinas (ng/ml)

Señal AlphaScreen (cps)

Estaurosporina

Señal AlphaScreen (cps)

-Log inhibidores (M) -Log inhibidores (M)

Ensayo de Reducción de Placa VZV

TNF en BALF por grupos después de BLM en D1

veiiculo veiiculo

veiiculo veiiculo

Cambio de

Pesoº

IngestiónºdeºcomidaIngestiónºdeº agua24ºiº (g)

Producciónºdeºiecesº 24ºiº (g)

Ingestiónºdeºcomida º24ºiº (g g)

Producción ºdeº

iecesº 24ºi º (g g)

Gramos

Macrófago

rata

Liberación de TNF en células THP1 Liberación de IL-6 en células THP1 Liberación de MCP-1 en células THP1

Producción de TNF enProducción de IL-6 enProducción de RANTES enmacrófagos derivados de médula ósea