UTILIZACION DE CHAPERONAS FKBP COMO HERRAMIENTA DE EXPRESION.
Una molécula de DNA recombinante, que codifica una proteína de fusión,
que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diana, corriente arriba de la misma al menos una secuencia de nucleótido que codifica para una chaperona FKBP, y al menos otra secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP, que se caracteriza porque la chaperona FKBP se selecciona de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0206957EP.
Solicitante: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH
F.HOFFMANN-LA ROCHE AG.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: SANDHOFER STRASSE 116,68305 MANNHEIM.
Inventor/es: FAATZ, ELKE, ANDRES, HERBERT, ENGEL, ALFRED, SCHMITT, URBAN, SCHOLZ, CHRISTIAN, SCHAARSCHMIDT,PETER, BAZARSUREN,ARIUNA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K47/48R2
- C07K14/16D
- C12N9/90 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Isomerasas (5.).
- G01N33/543B
- G01N33/569D
- G01N33/569K
- G01N33/569K2
Clasificación PCT:
- C12N15/62 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
Clasificación antigua:
- C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
Fragmento de la descripción:
Utilización de chaperonas FKBP como herramienta de expresión.
La presente invención está relacionada con el clonaje y expresión de una proteína heteróloga o polipéptido en bacterias como Escherichia coli. En particular, esta invención está relacionada con herramientas de expresión que comprenden una peptidil prolil isomerasa de tipo FKBP seleccionadas de entre el grupo que consiste de FkpA y SlyD, a métodos de expresión de proteína recombinante, a los polipéptidos recombinantes así obtenidos así como al uso de tales polipéptidos.
Se han descrito una gran variedad de sistemas de expresión en las patentes así como en las literatura científica. No obstante, a pesar del hecho que las proteínas de fusión se han convertido en la piedra angular de la biología moderna, la obtención de una proteína diana en una forma soluble, biológicamente activa, así como en un alto rendimiento, continua siendo un gran reto (Kapust, R. B. y Waugh, D. S., Proteine Sci 8 (1999) 1668-74).
Ejemplos de parejas de fusión que han sido anunciados como agentes solubilizantes incluye tioredoxina (TRX), glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), Proteína A, ubiquitina, y DsbA. Aunque es ampliamente reconocido y potencialmente de gran importancia, este efecto solubilizante sigue estando pobremente comprendido. No queda claro, por ejemplo, qué características a parte de la alta solubilidad intrínseca representa a un agente solubilizador efectivo. Son todas las parejas de fusión solubles igualmente competentes en esta labor? o algunas son consistentemente más efectivas que otras? De forma similar, no se conoce si la solubilidad de muchos polipéptidos diferentes puede mejorarse fusionándolos a una pareja altamente soluble o si esta aproximación sólo es efectiva en una pequeña parte de los casos.
US 6.207.420 está relacionada con los sistemas de proteínas de fusión diseñados para aumentar la expresión citoplasmática soluble de proteínas heterólogas en Escherichia coli.
El estado de la técnica en relación a los sistemas de expresión más potentes, se ha resumido recientemente por Kapust et al., supra. En su intento de producir proteínas de fusión solubles que comprenden varias proteínas diana, han analizado tres parejas de fusión candidatas diferentes y prominentes. La proteína de unión a Maltosa (MBP), la glutatión S-transferasa (GST), y la tioredoxina (TRX) se han analizado por su capacidad de inhibir la agregación de seis proteínas diferentes que normalmente se acumulan en una forma insoluble. Todos estos sistemas candidatos de expresión son conocidos por los expertos en la materia y están descritos en detalle en varios sitios (por ejemplo, PE 293 249 describe en detalle el uso de GST como una herramienta de expresión).
De forma remarcable, Kapust et al., supra, encontraron que la MBP es de lejos un agente más efectivo al solubilizar que las otras dos parejas de fusión que también se usan ampliamente en la técnica. Además, demostraron que sólo en algunos casos la fusión a MBP puede promover el plegamiento correcto de la proteína unida en su conformación biológicamente activa.
Es especialmente crítico que muchos polipéptidos que tienen tendencia a agregar se mantengan solubles al fusionarlos con una pareja apropiada, pero algunas parejas de fusión candidatas de una forma más o menos impredecible son mucho mejor agentes solubilizadores que otros.
Mientras se trabajaba en la expresión recombinante de varias glicoporteínas retrovirales de superficie (rsgps), se investigó la utilidad de muchas herramientas de expresión conocidas y recomendadas en la técnica, por ejemplo, por Kapust et al., supra. No obstante, se encontró que todos los sistemas de expresión ensayados sufrieron alguno o varios de los siguientes defectos: bajo rendimiento, polipéptido de fusión difícil de manipular, o insolubilidad de la proteína de fusión en condiciones de tampón fisiológicas.
Existe una gran demanda para proporcionar una alternativa, herramientas de expresión eficientes, que son especialmente apropiadas para la expresión recombinante de proteínas con tendencia a agregarse, por ejemplo, como las rsgps.
Existe una gran riqueza de bibliografía de patentes relacionadas con proteínas que se unen al inmunosupresor FK-506, las denominadas proteínas de unión a FK-506 o FKBP.
Estas proteínas se han estudiado ampliamente y se han diseñado aplicaciones comerciales centradas en la actividad de unión a FK-506 de estas proteínas. Por ejemplo, WO 93/25533 utiliza CTP:CMP-3-deoxi-D-mano-octulosonato citidil transferasa (=CKS) como herramienta de expresión. Se inserta un FKBP en un vector de expresión basado en CKS corriente abajo del gen CKS. La proteína de fusión obtenida se utiliza para mejorar las mediciones de FK-506 y otros inmunosupresores.
WO 00/28011 describe materiales y métodos para la regulación de eventos biológicos como la transcripción de genes diana y crecimiento, proliferación y diferenciación de células modificadas.
WO 97/10253 está relacionada con un ensayo de alto rendimiento para el cribado de compuestos capaces de unirse a una proteína de fusión que consta de una proteína diana y una proteína de unión a FK-506. Se describe la utilización de una proteína de fusión FKBP12 (SH2) por homología a Src en un ensayo de cribado de alto rendimiento. La proteína de fusión se produce en forma soluble en el periplasma bacteriano y se libera mediante tratamiento de congelación-descongelación estándar.
La tarea de la presente invención fue investigar si es posible desarrollar y proporcionar sistemas de expresión alternativos eficientes que puedan utilizarse para mejorar la expresión de una proteína recombinante que comprende una rsgp como proteína diana y que a la vez es también apropiado para proteínas diana menos críticas.
Para sorpresa nuestra fuimos capaces de identificar ciertos miembros modulares de la familia de tipo FKBP de las chaperonas de la peptidil prolil isomerasa (PPI o PPIasa) como herramientas de clonaje muy prometedoras. Encontramos que un sistema de expresión basado en una familia de tipo FKBP de la chaperona seleccionada del grupo que consiste en SlyD, FkpA, y factor disparador (trigger factor) es ideal para expresar proteínas críticas como una rsgp y a la vez pudimos demostrar también que estas chaperonas representan a su vez herramientas de clonaje extremadamente prometedoras para proteínas diana menos crítica.
Resumen de la invención
La presente invención en una primera realización está relacionada con una molécula de DNA recombinante, que codifica una proteína de fusión, que comprende al menos una secuencia de nucleótido que codifica para un polipéptido diana y corriente arriba del mismo al menos una secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP y al menos otra secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP, que se caracteriza en que la chaperona FKBP se selecciona de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD.
También se describen las vías preferibles para diseñar dichas moléculas de DNA recombinante, así como su uso como parte de un vector de expresión, una célula huésped que comprende dicho vector de expresión, y en la producción de polipéptido de fusión.
Se ha encontrado además que los polipéptidos de fusión recombinantes por sí mismos presentan propiedades sorprendentes y ventajosas, por ejemplo, respecto a la solubilización, purificación y manejo. En otra realización, la presente invención está relacionada con una proteína de fusión producida de forma recombinante que comprende al menos dos secuencias de polipéptido que corresponden a una chaperona FKBP seleccionada de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD y al menos una secuencia de polipéptido que corresponde a un péptido diana.
Otra realización está relacionada con una proteína de fusión producida de forma recombinante que comprende al menos dos secuencias de polipéptido que corresponden a una chaperona FKBP seleccionada de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD, al menos una secuencia de polipéptido que corresponde a un polipéptido diana, y al menos una secuencia enlazante peptídica de 10 - 100 aminoácidos.
Los polipéptidos de fusión recombinantes preferibles también se describen como el uso de dichos polipéptidos de fusión en varias solicitudes.
Descripción de las figuras
Figura 1 Espectro UV de FkpA-gp41 a pH 2,5
Reivindicaciones:
1. Una molécula de DNA recombinante, que codifica una proteína de fusión, que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diana, corriente arriba de la misma al menos una secuencia de nucleótido que codifica para una chaperona FKBP, y al menos otra secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP, que se caracteriza porque la chaperona FKBP se selecciona de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD.
2. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 que además se caracteriza porque comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazante peptídico de 10 - 100 aminoácidos localizados entre dicha secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido diana y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica una chaperona FKBP.
3. Una molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende dos secuencias de nucleótidos que codifican para dicha chaperona FKBP.
4. Una molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende dos secuencias de nucleótido que codifican para SlyD.
5. La molécula de DNA recombinante de la reivindicación 3 que además se caracteriza porque las dos secuencias que codifican para una chaperona FKBP se localizan corriente arriba de la secuencia que codifica para el polipéptido diana.
6. La molécula de DNA recombinante de la reivindicación 3 que además se caracteriza porque una secuencia que codifica para una chaperona FKBP se localiza corriente arriba de la secuencia que codifica para el polipéptido diana y la otra secuencia que codifica para una chaperona FKBP se localiza corriente abajo de la secuencia que codifica para el péptido diana.
7. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de 3 a 6, que además se caracteriza porque, comprende dos secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido enlazante de 10 - 100 aminoácidos.
8. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en la que las dos secuencias de ácido nucleico que codifican para un enlazante de 10 - 100 aminoácidos son diferentes.
9. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 8, en la que al menos una de dichas secuencias enlazantes codifica para un polipéptido enlazante que comprende un lugar de escisión proteolítica.
10. Un vector de expresión que comprende una molécula de DNA recombinante ligada de forma operativa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. Una célula huésped transformada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un método para producir una proteína de fusión, en el que dicho método comprende los pasos de a) cultivar las células huésped de acuerdo con la reivindicación 11, b) expresar dicha proteína de fusión y c) purificar dicha proteína de fusión.
13. Una proteína de fusión obtenida de forma recombinante que comprende al menos dos secuencias de polipéptido que corresponden a una chaperona FKBP seleccionada de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD y al menos una secuencia de polipéptido que corresponde a un péptido diana.
14. Una proteína de fusión obtenida de forma recombinante que comprende al menos dos secuencias de polipéptido que corresponde a una chaperona FKBP seleccionada de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD, al menos una secuencia de polipéptido que corresponde a un polipéptido diana, y al menos una secuencia enlazante peptídico de 10 - 100 aminoácidos.
15. La proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, que además se caracteriza porque, comprende dos secuencias de polipéptido que corresponden a dicha chaperona FKBP.
16. La proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, que además se caracteriza porque, comprende dos secuencias de polipéptido que corresponde a SlyD.
17. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 15, que además se caracteriza porque, dichas dos chaperonas FKBP se localizan en posición N-terminal respecto al polipéptido diana.
18. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 15, que además se caracteriza porque, una de dichas dos chaperonas FKBP se localizan en posición N-terminal y una de dichas chaperonas FKBP se localiza en posición C-terminal respecto al polipéptido diana.
19. Una proteína de fusión obtenida de forma recombinante que comprende al menos un polipéptido diana, dos secuencias que corresponden a las chaperonas FKBP seleccionadas de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD, y dos secuencias enlazantes peptídicos de 10 - 100 aminoácidos.
20. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 19, en la que al menos una de dichas secuencias enlazantes peptídicos comprende un lugar de escisión proteolítico.
21. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 20, en la que dicha proteína diana comprende un polipéptido de un organismo infeccioso.
22. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 21, que además se caracteriza porque dicho polipéptido comprende al menos un epítopo relevante a nivel diagnóstico de un organismo infeccioso.
23. La utilización de una proteína de fusión obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 - 22 en la producción de un inmunógeno.
24. La utilización de una proteína de fusión obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 - 22, en la producción de una vacuna.
25. La utilización de una proteína de fusión obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-22, en un inmunoensayo.
26. Una composición que comprende una proteína de fusión obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-22, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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