Uso de proteinas y peptidos codificados por el genoma de una nueva cepa de coronavirus asociado al SRAS.

Polipéptido aislado y purificado, caracterizado porque se trata del ectodominio de la proteína S de secuencia SECID nº 3,

y porque está constituido por los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 a 1193 de la secuenciade aminoácidos de dicha proteína S o de los aminoácidos que corresponden a las posiciones 14 a 1193 de lasecuencia de aminoácidos de dicha proteína S.

Uso de proteínas y péptidos codificados por el genoma de una nueva cepa de coronavirus asociado al SRAS

La presente invención se refiere a una nueva cepa de coronavirus asociada al síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) , procedente de una extracción catalogada bajo el nº 031589 y extraída en Hanoi (Vietnam) , a moléculas de ácido nucleico procedentes de su genoma, a las proteínas y péptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico, así como a sus aplicaciones, en particular como agentes reactivos de diagnóstico y/o como vacuna.

El coronavirus es un virus de ARN monocatenario, de polaridad positiva, de aproximadamente 30 kilobases, que se replica en el citoplasma de células hospedantes; el extremo 5' del genoma tiene una estructura en capuchón y el extremo 3' comprende una cola polyA. Este virus está envuelto y comprende, en su superficie, estructuras peploméricas denominadas espículas.

El genoma comprende los cuadros abiertos de lectura, u ORF, siguientes, desde su extremo 5' hacia su extremo 3'; ORF1a y ORF1b, que corresponden a las proteínas del complejo de transcripción-replicación, y ORF-S, ORF-E, ORF-M y ORF-N, que corresponden a las proteínas estructurales S, E, M y N. Comprende también unos ORF que corresponden a proteínas de función desconocida codificadas por: la región situada entre el ORF-S y el ORF-E y que se superpone a esta última, la región situada entre el ORF-M y el ORF-N, y la región incluida entre el ORF-N.

La proteína S es una glicoproteína membranaria (200-220 kDa) , que se presenta en forma de espículas o "pinchos" que emergen de la superficie de envoltura viral. Es responsable de la adhesión del virus a los receptores de la célula hospedante, y de la inducción de la fusión de la envoltura viral con la membrana celular.

La pequeña proteína de envoltura (E) también denominada sM (small membrane) , que es una proteína transmembranaria no glicosilada de aproximadamente 10 kDa, es la proteína presente en cantidad más baja en el virión. Desempeña un papel motor en el proceso del brote de coronavirus que se produce a nivel del compartimiento intermedio en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi.

La proteína M, o proteína matriz (25-30 kDa) , es una glicoproteína membranaria más abundante que está integrada en la partícula viral por una interacción M/E, mientras que la incorporación de S en las partículas está dirigida por una interacción S/M. Parece ser importante para la maduración viral de los coronavirus y para la determinación del sitio al nivel del cual las partículas virales se ensamblan.

La proteína N o proteína de nucleocápside (45-50 kDa) , que es la más conservada entre las proteínas estructurales de los coronavirus, es necesaria para encapsidar el ARN genómico, y después para dirigir su incorporación en el virión. Esta proteína está probablemente también implicada en la replicación del ARN.

Cuando una célula hospedante es infectada, el cuadro de lectura (ORF) situado en 5' del genoma viral se traduce en una poliproteína que es escindida por las proteasas virales, y libera entonces varias proteínas no estructurales, tales como ARN-polimerasa, ARN dependiente (Rep) ATPasa helicasa (Hel) . Estas dos proteínas están implicadas en la replicación del genoma viral, así como en la generación de transcritos que son utilizados en la síntesis de las proteínas virales. Los mecanismos por los cuales se producen estos ARNm sub-genómicos no están totalmente comprendidos; sin embargo, hechos recientes indican que las secuencias de regulación de la transcripción en el extremo 5' de cada gen representan señales que regulan la transcripción discontinua de los ARNm sub-genómicos.

Las proteínas de la membrana viral (proteínas S, E y M) están insertadas en el compartimiento intermedio, mientras que el ARN replicado (hebra +) se ensambla con la proteína N (nucleocápside) . Este complejo proteína-ARN se asocia después con la proteína M incluida en las membranas del retículo endoplásmico y las partículas virales se forman cuando el complejo de la nucleocápside brota en el retículo endoplásmico. El virus migra después a través del complejo del Golgi y eventualmente sale de la célula, por ejemplo mediante exocitosis. El sitio de adhesión del virus a la célula hospedante se encuentra al nivel de la proteína S.

Los coronavirus son responsables del 15 al 30% de los catarros en el ser humano, y de infecciones respiratorias o digestivas en los animales, en particular gatos (FIPV: Feline infectious peritonitis virus) , aves de corral (IBV: Avian Infectious bronchitis virus) , ratones (MHV: Mouse Hepatitis virus) , cerdos (TGEV: Transmissible gastroenterititis virus, PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV: Porcine Respirator y Coronavirus, HEV: Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) y los bovinos (BcoV: Bovine coronavirus) .

En general, cada coronavirus afecta sólo a una especie; en los individuos inmunocompetentes, la infección induce unos anticuerpos eventualmente neutralizantes, y una inmunidad celular, capaces de destruir las células infectadas.

Una epidemia de neumonía atípica, denominada síndrome respiratorio agudo severo (SARS o Severe acute respirator y syndrome, SRAS en español) , se ha propagado en diferentes países (Vietnam, Hong-Kong, Singapur, Thailandia y Canadá) durante el primer trimestre de 2003, a partir de un foco inicial aparecido en China, en el último trimestre de 2002. La severidad de esta enfermedad es tal, que su índice de mortalidad es aproximadamente del 3 al

6%. La determinación del agente causante de esta enfermedad se ha investigado por numerosos laboratorios, en todo el mundo.

En marzo de 2003, se ha aislado un nuevo coronavirus (SARS-CoV, SARS virus o virus SRAS en español) , en asociación con unos casos de síndrome respiratorio agudo severo (T.G.KSIAZEK y otros, The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1319-1330; C. DROSTEN y otros, The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 19671976; Peiris y otros, Lancet, 2003, 361, 1319-) .

Se obtuvieron así unas secuencias genómicas de este nuevo coronavirus, en particular las del aislado Urbani (Genbank nº de acceso AY274119.3 y A. MARRA y otros, Science, 1 de mayo, 2003, 300, 1399-1404) y del aislado de Toronto (Tor2, Genbank n° de acceso AY 278741 y A. ROTA y otros, Science, 2003, 300, 1394-1399) .

La organización del genoma es comparable a la de los demás coronavirus conocidos, permitiendo así confirmar la pertenencia del SRAS-CoV a la familia de los Coronaviridae; se han identificado en particular los cuadros de lectura abiertos ORF1a y 1b, y los cuadros de lectura abiertos que corresponden a las proteínas S, E, M y N, así como a proteínas codificadas por: la región situada entre ORF-S y ORF-E (ORF3) , la región situada entre ORF-S y ORF-E y que se superpone a ORF-E (ORF4) , la región situada entre ORF-M y ORF-N (ORF7 a ORF11) y la región que corresponde a ORF-N (ORF13 y ORF14) .

Se han puesto en evidencia siete diferencias entre las secuencias de los aislados Tor2 y Urbani; 3 corresponden a mutaciones silenciosas (c/t en la posición 16622 y a/g en la posición 19064 de ORF1b, t/c en la posición 24872 de ORF-S) , y 4 modifican la secuencia en aminoácidos respectivamente: las proteínas codificadas por ORF1a (c/t en la posición 7919 que corresponde a la mutación A/V) , la proteína S (g/t en la posición 23220 que corresponde a la mutación A/S) , la proteína codificada por ORF3 (a/g en la posición 25298 que corresponde la mutación R/G) y de la proteína M (t/c en la posición 26857 que corresponde a la mutación S/P) .

Además, el análisis filogenético muestra que el SRAS-CoV está distante de los demás coronavirus, y que no ha aparecido ni por mutación de coronavirus respiratorios humanos, ni por recombinación entre unos coronavirus conocidos (para una revisión, véase Homes J.C.I., 2003, 111, 1605-1609) .

La puesta en evidencia y la consideración de nuevas variantes son importantes para la realización de agentes reactivos de detección y de diagnóstico de SRAS suficientemente sensibles y específicos, así como composiciones inmunógenas aptas para proteger las poblaciones contra unas epidemias de SRAS.

Los inventores han puesto en evidencia ahora otra cepa de coronavirus asociado al SRAS, que se distingue de los aislados Tor2 y Urbani.

La presente invención es tal como se define por las reivindicaciones 1 a 22 más adelante.

Los inventores describen una cepa aislada o purificada de coronavirus humano asociado al síndrome respiratorio agudo severo, caracterizada porque su genoma presenta, en forma de ADN complementario, un codón de serina en la posición 23220-23222... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado y purificado, caracterizado porque se trata del ectodominio de la proteína S de secuencia SEC ID nº 3, y porque está constituido por los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 a 1193 de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína S o de los aminoácidos que corresponden a las posiciones 14 a 1193 de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína S.

2. Ácido nucleico que codifica un polipéptido, según la reivindicación 1.

3. Vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende un ácido nucleico, según la reivindicación 2.

4. Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, que codifica el ectodominio de la proteína S de secuencia SEC ID nº 3, caracterizado porque se selecciona entre los vectores contenidos en las capas bacterianas siguientes, depositadas en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) , 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15

a) cepa n° I-3324, depositada el 22 de noviembre de 2004, b) cepa n° 1-3327, depositada el 1 de diciembre de 2004, c) cepa n° 1-3332, depositada el 1 de diciembre de 2004, d) cepa n° I-3335, depositada el 1 de diciembre de 2004, e) cepa n° I-3337, depositada el 1 de diciembre de 2004, f) cepa n° 1-3339, depositada el 2 de diciembre de 2004, y g) cepa n° I-3341, depositada el 2 de diciembre de 2004

5. Vector de expresión, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un vector viral, en forma de partícula viral o en forma de genoma recombinante.

6. Vector viral, en forma de partícula viral o en forma de genoma recombinante, según la reivindicación 5, caracterizado porque se trata de una partícula viral recombinante o de un genoma viral recombinante susceptible de ser obtenido por transfección de un plásmido según los apartados b) o d) a g) de la reivindicación 4, en un sistema celular apropiado.

7. Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un vector lentiviral.

8. Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un virus de la rubeola.

9. Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un virus de la vacuna antivariólica.

10. Uso de un vector contenido en una cepa bacteriana, según la reivindicación 4, para la producción in vitro, en un sistema eucariota, del ectodominio de la proteína S del coronavirus asociado al SRAS, según la reivindicación 1.

11. Método de producción del ectodominio de la proteína S, según la reivindicación 1, en un sistema eucariota, que comprende una etapa de transfección de células eucariotas en cultivo por un vector seleccionado entre los vectores contenidos en las cepas bacterianas mencionadas en la reivindicación 5.

12. Célula eucariota aislada, genéticamente modificada, que expresa un polipéptido, según la reivindicación 1.

13. Célula, según la reivindicación 12, susceptible de ser obtenida mediante transfección por cualquiera de los vectores mencionados en los apartados d) o e) de la reivindicación 4.

14. Célula, según la reivindicación 13, caracterizada porque se trata de la célula FRhK4-Ssol-30, depositada en la CNCM el 22 de noviembre de 2004, bajo el n° I-3325.

15. Uso de un polipéptido, según la reivindicación 1, para detectar una infección por un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica.

16. Método de detección de una infección por un coronavirus asociado al SRAS o de anticuerpos dirigidos contra un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica, caracterizado porque la detección se efectúa por

ELISA utilizando un polipéptido, según la reivindicación 1, expresado en un sistema eucariota.

17. Método de detección, según la reivindicación 16, que comprende además una etapa de detección por ELISA que utiliza la proteína N recombinante.

18. Método, según la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque se trata de un método por ELISA doble epítopo, y porque el suero a ensayar se mezcla con el antígeno de revelado, siendo puesta después dicha mezcla en contacto con el antígeno fijado sobre un soporte sólido.

19. Complejo inmune aislado formado por un polipéptido, según la reivindicación 1, y un anticuerpo dirigido específicamente contra un epítopo del coronavirus asociado al SRAS.

20. Kit o estuche de detección de un coronarivus asociado al SRAS, caracterizado porque comprende el menos un agente reactivo seleccionado del grupo constituido por: un polipéptido, según la reivindicación 1, un ácido nucleico, según la reivindicación 2, una célula, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

21. Composición inmunógena y/o de vacuna, caracterizada porque comprende un polipéptido recombinante, según la reivindicación 1, obtenido en un sistema de expresión eucariota.

22. Composición inmunógena y/o de vacuna, caracterizada porque comprende un vector o un virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, y 5 a 9.

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