Uso de oleuropeína y derivados en el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2 y patologías relacionadas con fenómenos de agregación de proteínas.

Uso de oleuropeína en forma no glicosilada para la preparación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de patologías relacionadas con fenómenos de agregación de proteínas donde la patología es diabetes mellitus tipo 2.

Uso de oleuropeïna y derivados en el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2 y patologïas relacionadas con fenïmenos de agregaciïn de proteïnas. 5 CAMPO DE LA INVENCIïN

Esta invenciïn se refiere al uso de oleuropeïna en forma no glicosilada en el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2. Ademïs, esta invenciïn se refiere al uso de oleuropeïna en forma no glicosilada en el tratamiento de patologïas relacionadas con fenïmenos de agregaciïn de proteïnas donde la patologïa es diabetes mellitus tipo 2. Especïficamente, esta invenciïn se refiere al uso de oleuropeïna en forma no glicosilada para preparar una fïrmula farmacïutica para el tratamiento profilïctico y terapïutico de patologïas asociadas a o que derivan de un depïsito amiloide donde la patologïa es diabetes mellitus tipo 2.

ESTADO DE LA TïCNICA

Es un hecho bien conocido que la diabetes mellitus no insulino-dependiente tipo 2 (NIDDM) se caracteriza por la presencia de islotes pancreïticos de sustancia amiloide, que comprende principalmente agregados de un pïptido, amilina (hl-APP) .

Los depïsitos de amiloide pueden observarse en aproximadamente el 90% de los pacientes de NIDDM, y hoy en dïa se cree que es una de las principales causas de esta enfermedad. La amilina (hIAPP) es un pïptido de 37 aminoïcidos co-secretados con la insulina por las cïlulas β de los islotes en respuesta a un aumento de la concentraciïn de glucosa en sangre. La amilina se caracteriza por una solubilidad limitada y una alta propensiïn a generar fibrillas, a travïs de un proceso de nucleaciïn de varias fases.

La investigaciïn cientïfica participa naturalmente en gran medida intentando identificar nuevas molïculas capaces de inhibir la formaciïn de agregados amiloides de hIAPP, que se usarïn en el tratamiento profilïctico y terapïutico de NIDDM y en todas las patologïas relacionadas con fenïmenos de agregaciïn de proteïnas.

Al-Azzawie y col.; Life Science 2006, 78, 1371-1377 desvela el uso de oleuropeïna para tratar y prevenir la diabetes mellitus tipo I. Al-Azzawie y col. se refieren al efecto antioxidante de la oleuropeïna en conejos con diabetes aloxïnica.

El documento US 2006/0177530 desvela el uso de oleuropeïna para tratar una neuropatïa diabïtica.

Los documentos KR 2005/0078709 y KR 2005/0107897 desvelan ambos el uso de composiciones que comprenden oleuropeïna para tratar una plïtora de enfermedades (hipertensiïn, diabetes, arteriosclerosis, enfermedades vïricas, hipertermia, malaria, inflamaciïn, tos, gripe, etc.) en base a las propiedades antioxidantes de la oleuropeïna.

El documento WO02009066021, desvela el uso de extractos de aceite de oliva rico en oleocantal para el tratamiento de afecciones del metabolismo lipïdico. En particular, se demuestra que el oleocantal puede tener un efecto positivo tambiïn en la actividad de la insulina y en captaciïn de glucosa. El documento US2004097428

describe un procedimiento para inhibir el cïncer, la formaciïn de cicatrices, alterar el citoesqueleto celular y otorgar resistencia frente a infecciïn, comprendiendo dicho procedimiento la administraciïn de oleuropeïna y/o sus productos de hidrïlisis.

RESUMEN DE LA INVENCIïN

El sujeto de esta invenciïn es el uso de oleuropeïna en forma no glicosilada para la preparaciïn de una fïrmula farmacïutica como se indica en las reivindicaciones adjuntas.

A este fin, se explican y se reivindican formas preferidas de esta invenciïn, como se indica en las 55 reivindicaciones dependientes adjuntas.

DESCRIPCIïN DETALLADA DE LA INVENCIïN

La familia de las oleïceas (Oleaceae) incluye plantas muy interesantes, la mïs famosa de las cuales es el

olivo (Olea Europaea subsp. Europaea) . La familia Oleaceae incluye 27 gïneros y entre 400 y 900 especies diferentes.

El olivo (Olea Europaea) es una planta frutal, y sus frutos, aceitunas, se usan por su aceite. El aceite de oliva contiene muchos polifenoles. La oleuropeïna es el polifenol secoiridoide que, en forma glicosilada, es caracterïstico de las oleïceas, y especïficamente de Olea Europea. Los secoiridoides son derivados estructurales de los iridoides (que tienen un anillo ciclopentano que generalmente se condensa a un anillo heterocïclico oxigenado de 6 miembros) para la apertura del anillo ciclopentano tras la oxidaciïn y la ruptura de un enlace carbono-carbono.

La oleuropeïna glicosilada ( (4S, 5E, 6S) -4-[2-[2- (3, 4-dihidroxifenil) etoxi]-2-oxoetil]-5-etiliden-6[ (2S, 3R, 4S, 5S, 6R) -3, 4, 5-trihidroxi-6- (hidroximetil) oxan-2-il]oxi-4H-piran-3-carboxilato de metilo) es una ïnica especie quïmica, bien caracterizada por el peso molecular de 540, 51 y la fïrmula molecular C25H32O13. Es hidrosoluble en forma glicosilada, y fuertemente apolar en forma no glicosilada.

La hidrïlisis de la oleuropeïna, causada por las glucosidasas del olivo durante la maduraciïn y el proceso tecnolïgico involucrado en la extracciïn de aceite de oliva extra virgen, desencadena la liberaciïn de la aglicona que se divide en la fase oleosa.

En el sistema experimental, se ha aplicado la desglicosilaciïn incubando 5, 5 μmoles de oleuropeïna glicosilada (obtenida de la empresa Extrasynthese) en un tampïn de fosfato sïdico 0, 1 M a pH 7, 0 (final 10 mM) con 7, 55 U.I. de β-glucosidasa de almendra (EC 3.2.1.21) . Por lo tanto, la mezcla de reacciïn se centrifugï a 18.000 rpm durante 10 minutos, con el fin de recoger la oleuropeïna aglicona que se habïa convertido en insoluble en un entorno acuoso. El anïlisis con espectrïmetro de masas del precipitado permitiï la determinaciïn de la pureza del producto. El precipitado disolviï de nuevo completamente en DMSO y se almacenï en la oscuridad.

El Solicitante se sorprendiï al apreciar que la oleuropeïna aglicona tenïa una gran capacidad para inhibir el amiloide de amilina (hIAPP) .

El Solicitante determinï la cinïtica de agregaciïn de hIAPP, tanto en presencia como en ausencia de oleuropeïna aglicona como se ha descrito previamente, por medio del ensayo de la tioflavina T (ThT) . El ensayo ThT se usa ampliamente para controlar la apariciïn de oligïmeros y polïmeros ricos en β proteïna y pïptidos, y se basa en el aumento de la fluorescencia a 485 nm, tras la excitaciïn a 440 nm, del ThT cuando interactïa con estructuras de tipo amiloide. El ensayo ThT se ha realizado usando diversas concentraciones diferentes de oleuropeïna aglicona para generar las diversas relaciones molares entre ïsta y el pïptido.

El ensayo se realizï diluyendo la amilina (disuelta en origen en 80-100%, hexafluoroisopropanol (HFIP) ) en tampïn fosfato sïdico 10 mM pH 7, 4 en presencia de HFIP al 1-4%, a concentraciones de entre 3, 125 y 12, 5 μM, en presencia o ausencia de oleuropeïna no glicosilada a concentraciones de 0, 1 x, 2 x, 3 x y 10 x de concentraciïn de amilina. La soluciïn volïmica de oleuropeïna aglicona, disuelta de nuevo tras la desglicosilaciïn, con el fin de obtener 100 mM en dimetil sulfïxido (DMSO) se diluyï adicionalmente en el mismo tampïn fosfato inmediatamente antes del uso, para obtener 100 x de concentraciïn final. La incubaciïn se realizï a 25 ïC y, en diversos intervalos, se recogieron 50 μL de soluciïn de cada mezcla, que se diluyeron 8 veces en el tampïn de glicina/NaOH 0, 1 M pH 8, 5 que contenïa ThT 20 μM. El valor de emisiïn de fluorescencia se normalizï cada vez en comparaciïn con la de un blanco. Cada combinaciïn de concentraciones de amilina y oleuropeïna se ensayï al menos cinco veces, para poder calcular la desviaciïn tïpica para cada punto.

Los resultados muestran que la inhibiciïn de la agregaciïn amiloide del hIAPP es dependiente de la dosis. De hecho, cuando se usa una relaciïn de oleuropeïna no glicosilada:hIAPP que varïa entre 2:1 y 10:1, de acuerdo con las diferentes preparaciones de hIAPP y oleuropeïna no glicosilada, se obtiene una inhibiciïn casi completa (mayor del 90%) de la formaciïn de agregados de ThT positivos.

Ademïs, el Solicitante tambiïn realizï un estudio para aclarar los cambios estructurales provocados por la presencia de oleuropeïna durante la agregaciïn de amilina.

Se usaron anïlisis de dicroïsmo circular para esto, ya que esta tïcnica permite la evaluaciïn de estructuras secundarias y la estructura desordenada de los polïmeros en soluciïn. Se adquirieron espectros en la regiïn del ultravioleta lejano (entre 195 y 295 nm) a 25 ïC, acumulando 8 espectros sucesivos para cada anïlisis realizado a la velocidad de exploraciïn de 50 nm/min. La diferencia entre el espectro blanco correspondiente se apreciï frente a cada espectro de muestra. En la prïctica, inmediatamente despuïs... [Seguir leyendo]

1. Uso de oleuropeïna en forma no glicosilada para la preparaciïn de una formulaciïn farmacïutica para el

tratamiento de patologïas relacionadas con fenïmenos de agregaciïn de proteïnas donde la patologïa es diabetes 5 mellitus tipo 2.

2. Uso de acuerdo con la reivindicaciïn 1, donde el tratamiento es profilïctico y/o terapïutico.

3. Uso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1-2, donde la oleuropeïna en forma no glicosilada se

usa en la preparaciïn de una formulaciïn farmacïutica para el tratamiento profilïctico y/o terapïutico de diabetes mellitus tipo 2.

4. Oleuropeïna en forma no glicosilada para su uso en el tratamiento de patologïas relacionadas con fenïmenos de agregaciïn de proteïnas, donde la patologïa es diabetes mellitus tipo 2.