USO DE LA OBESTATINA PARA LA REGENERACIÓN MUSCULAR.

Uso de la obestatina para la regeneración muscular.

La presente invención se refiere al uso de la obestatina,

o a la secuencia nucleotídica que la codifica, como agente miogénico "in vitro", y para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular preferiblemente para la regeneración músculo-esquelética, siendo así de utilidad en el tratamiento y/o prevención de enfermedades degenerativas o genéticas o de lesiones que cursan con daño muscular.

Uso de la obestatina para la regeneración muscular

La presente invención se encuadra en el campo de la medicina, específicamente dentro de los péptidos con capacidad miogénica útiles para inducir regeneración muscular y, por tanto, para el tratamiento y/o prevención de lesiones o enfermedades que cursan con daño muscular.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La miogénesis es el proceso de formación de tejido muscular que implica la especificación y diferenciación de células precursoras de músculo o mioblastos, su fusión para la formación de miotubos primarios y secundarios y la consiguiente maduración en miofibras (Chargé SB., et al., 2004, Physiol Rev. 84:209-238) . Este proceso es requerido tanto para el desarrollo del músculo esquelético en el embrión, como para el crecimiento postnatal y para el mantenimiento y reparación de las miofibras del músculo esquelético tras una lesión (Perr y RL., et al., 2000, Front Biosci. 5:D750-767; Sartorelli V., et al., 2005, Curr Opin Genet Dev. 15 (5) :528-533) .

Por tanto, las fibras musculares o miocitos se forman a partir de la fusión de mioblastos en fibras multinucleadas, llamadas miotubos. En el desarrollo embrionario el proceso de miogénesis comienza con la proliferación de los mioblastos, que proliferan si hay suficiente factor de crecimiento fibroblástico (FGF) . Por el contrario, en ausencia de FGF los mioblastos cesan su división y secretan fibronectina a la matriz extracelular. El segundo estadio implica el alineamiento de los mioblastos para formar miotubos. El tercer estadio consiste en una fusión celular, en la que los iones de calcio son críticos, que está mediada por un conjunto de metaloproteinasas llamadas meltrinas.

Los factores de aumento de los miocitos (MEFs de sus siglas en inglés "Myocyte Enhance Factors”) promueven la miogénesis. Además, el factor de respuesta al suero (SRF de sus siglas en inglés “Serum Response Factor”) juega un papel fundamental durante la miogénesis, siendo requerido para la expresión de genes de actina alfa en el músculo estriado. La expresión de actina alfa esquelética está también regulada por el receptor de andrógenos. Así, los esteroides pueden regular la miogénesis.

En el proceso de cicatrización, los mioblastos son activados tempranamente, regenerando músculo mediante la generación de nuevas fibras o fusión con fibras preexistentes. Los mioblastos inducidos a proliferar en respuesta a varios factores de crecimiento expresan el factor de transcripción miogenina que promueve la expresión de proteínas específicas del músculo esquelético, tales como la creatina quinasa y la miosina.

Existen diferentes marcadores moleculares que permiten analizar detalladamente la determinación miogénica, la proliferación de mioblastos y la diferenciación terminal. Los factores reguladores miogénicos son vitales para la determinación y mantenimiento del músculo esquelético. En este sentido, durante el desarrollo, la inducción de la expresión de MyoD y de Myf-5 define el origen de las células progenitoras miogénicas que son responsables de formar distintos grupos musculares en el organismo adulto. Existe un elevado número de vías de señalización implicadas en la regulación de la miogénesis durante el desarrollo y durante la regeneración del tejido muscular dañado. Estas vías regulan la progresión del ciclo celular, las interacciones proteína-proteína y la actividad transcripcional de los factores miogénicos.

El proceso de miogénesis requiere las acciones coordinadas de múltiples vías de señalización que regulan la salida del ciclo celular, determinando y especificando el proceso de miogénesis en base a la expresión de factores miogénicos, un grupo de factores de transcripción que incluye Myf-5, MyoD, miogenina y MRF4.

Por otro lado, ha sido identificado un péptido gastrointestinal de 23 aminoácidos derivado del mismo péptido precursor de la ghrelina, pre-proghrelina, denominado obestatina. La obestatina se aisló originalmente del estómago, demostrándose que era un péptido circulante cuya secreción es pulsátil, mostrando un ritmo ultradiano similar al de la ghrelina y la hormona del crecimiento (GH) (Zhang JV., et al., 2005, Science 310:996-999) . Se han descrito acciones mitogénicas (Camiña JP., et al., 2007, J Cell Physiol. 211:1-9) y adipogénicas (Gurriarán-Rodríguez U., et al., 2010, J Cell Mol Med. 15 (9) :1927-40) para la obestatina, lo que evidencia una funcionalidad biológica para este péptido. Recientemente, se ha descrito que la obestatina promueve la supervivencia celular en células β y en islotes pancreáticos humanos. Asimismo, la obestatina induce la expresión de genes que regulan el destino de las células β, la biosíntesis de insulina y la sensibilidad a la glucosa (Granata R., et al., 2008, Diabetes 57:967-979) .

En resumen, el tejido muscular dañado requiere de un proceso miogénico para su mantenimiento y regeneración, por lo que los agentes capaces de promover dicha miogénesis, y por tanto de estimular la regeneración de las miofibras musculares, son de especial interés en clínica por su potencial aplicación en el tratamiento y/o prevención de enfermedades y lesiones que cursan con daño muscular.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un péptido aislado llamado “obestatina” que promueve la proliferación y

diferenciación en mioblastos. El efecto proliferativo en mioblastos muestra un claro patrón dosis dependiente. El papel como factor miogénico se establece a través de la expresión en mioblastos de factores clave para su diferenciación, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, del marcador de diferenciación temprano, miogenina, y del

marcador de diferenciación tardío, la miosina, (MHC, de sus siglas en inglés “Myosin Skeletal Heavy Chain”) , de forma dosis dependiente. Así, este péptido ejerce un papel como factor de supervivencia de mioblastos prolongando el potencial regenerativo del sistema muscular a través del aumento de la actividad proliferativa de los mioblastos. Por otra parte, promueve la miogénesis a través de la salida del ciclo celular facilitando la migración, la diferenciación y la fusión de los mioblastos para la determinación de los miotubos. Por tanto, dicho péptido es de aplicación en la regeneración muscular, preferiblemente en la regeneración músculo-esquelética, siendo así de utilidad en el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones que cursan con daño muscular. Existen obestatinas en diferentes organismos como por ejemplo, aunque sin limitarse, ratón, rata, hámster, búfalo, oso, gato o humano que comparten una alta identidad en la secuencia y que presentan la misma capacidad de promover la miogénesis.

Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1, o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico “in vitro”. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de un péptido aislado que consiste en una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1, o al uso de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico “in vitro”.

Se entiende por “obestatina” en la presente invención una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1. Se entiende por obestatina humana un péptido de secuencia SEQ ID NO:3 el cual presenta una homología superior al 86% con SEQ ID NO:1. Se entiende por obestatina de ratón o obestatina de rata el péptido de secuencia SEQ ID NO:1.

La secuencia aminoacídica de la obestatina de ratón, y que coincide con la obestatina de rata, es SEQ ID NO: 1. Esta secuencia SEQ ID NO:1 se corresponde con los residuos 76 a 98 de la secuencia con número de acceso al NCBI (National Center for Biotechnology Information) NP_067463 correspondiente a un pre-propéptido denominado pre-proghrelina de secuencia SEQ ID NO:7, el cual cuando es procesado en el organismo da lugar a la obestatina de secuencia SEQ ID NO:1. Este propéptido es codificado por el gen de la ghrelina.

En los ejemplos de la presente invención, se empleó la obestatina de rata/ratón, ya que los ensayos correspondientes se llevaron a cabo sobre líneas celulares de mioblastos de rata así como sobre las propias ratas, y por tanto era necesario la correspondencia entre la secuencia problema y la diana respectiva en los ensayos. Sin embargo, debe entenderse que la aplicación de mayor utilidad de la presente invención y su fin último es su uso terapéutico... [Seguir leyendo]

1. Uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, como agente miogénico “in vitro”.

2. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 1 donde dicho péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 3.

3. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 2 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 5.

4. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 2 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 3.

5. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 1 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

6. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 5 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

7. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 6 donde dicho péptido comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

8. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 7 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7.

9. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 7 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

10. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde dicha secuencia nucleotídica forma parte de un vector de expresión.

11. Uso de un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular.

12. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 11 donde dicho péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 3.

13. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 12 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 5.

14. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica según la reivindicación 12 donde dicho péptido consiste en SEQ ID NO: 3.

15. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 11 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

16. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 15 donde dicho péptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

17. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 16 donde dicho péptido comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

18. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 17 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7.

19. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 17 donde dicho péptido consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

20. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 donde dicha secuencia nucleotídica forma parte de un vector de expresión.

21. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular, torceduras, distensiones, calambres, tendinitis, contracturas, distrofia muscular, miositis, infecciones musculares, dolor miofacial, miopatías metabólicas, fasciculaciones musculares, hipotonía, miopatías congénitas, parálisis muscular, rabdomiólisis o síndrome compartimental.

22. Uso del péptido aislado, o de la secuencia nucleotídica que lo codifica, según la reivindicación 21, donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular o distrofia muscular.

23. Uso de una composición farmacéutica que comprende:

a. un péptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 86% de identidad con la SEQ ID NO: 1, o

b. la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido de (i) ,

para la elaboración de un medicamento para la regeneración muscular.

24. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 23 donde el péptido aislado de (i) comprende la secuencia SEQ ID NO: 3.

25. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 24 donde el péptido aislado de (i) consiste en SEQ ID NO: 5.

26. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 24 donde el péptido aislado de (i) consiste en SEQ ID NO: 3.

27. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 23 donde el péptido aislado de (i) comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 91% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

28. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 27 donde el péptido aislado de (i) comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

29. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 28 donde donde el péptido aislado de (i) comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

30. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 29 donde el péptido aislado de (i) consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7.

31. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 29 donde el péptido aislado de (i) consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

32. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31 donde la secuencia nucleotídica forma parte de un vector de expresión.

33. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular, torceduras, distensiones, calambres, tendinitis, contracturas, distrofia muscular, miositis, infecciones musculares, dolor miofacial, miopatías metabólicas, fasciculaciones musculares, hipotonía, miopatías congénitas, parálisis muscular, rabdomiólisis o síndrome compartimental.

34. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 33 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o lesiones musculares seleccionadas de la lista que comprende: miopatías neurogénicas, necrosis muscular, atrofia muscular o distrofia muscular.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidade de Santiago de Compostela Servizo Galego de Saúde (SERGAS)

<120> Uso de la obestatina para la regeneración muscular

<130> ES1596.40

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> Mus musculus <400> 1 Leu Ala Arg Gly His Gln Gln Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Lys Ile Gly 1 5 10 15 Val Asp Phe Pro Ala Asn Phe 20

<210> 2

<211> 69

<212> DNA

<213> Mus musculus <400> 2 ttcaatgctc ccttcgatgt tggcatcaag ctgtcaggag ctcagtatca gcagcatggc 60 cgggccctg 69

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 3 Leu Ala Gln Ser His Gln Gln Tyr Gln Val Gly Ser Leu Lys Ile Gly 1 5 10 15 Val Asp Phe Pro Ala Asn Phe 20

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 4 ttcaacgccc cctttgatgt tggaatcaag ctgtcagggg ttcagtacca gcagcacagc 60 caggccctg 69 <210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 5 Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu 1 5 10 15 Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His 20 25 30 Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu 35 40 45 Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln 50 55 60 Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe 65 70 75 80 Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln 85 90 95 Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu 100 105 110 Ala Pro Ala Asp Lys 115

<210> 6

<211> 354

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 6 atgccctccc cagggaccgt ctgcagcctc ctgctcctcg gcatgctctg gctggacttg 60 gccatggcag gctccagctt cctgagccct gaacaccaga gagtccagca gagaaaggag 120 tcgaagaagc caccagccaa gctgcagccc cgagctctag caggctggct ccgcccggaa 180 gatggaggtc aagcagaagg ggcagaggat gaactggaag tccggttcaa cgcccccttt 240 gatgttggaa tcaagctgtc aggggttcag taccagcagc acagccaggc cctggggaag 300 tttcttcagg acatcctctg ggaagaggcc aaagaggccc cagccgacaa gtga 354

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus <400> 7 Met Leu Ser Ser Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu 1 5 10 15 Trp Met Asp Met Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His 20 25 30 Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu 35 40 45 Gln Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe 65 70 75 80 Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr Gln Gln His Gly Arg 85 90 95 Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Val Lys Glu 100 105 110 Ala Pro Ala Asp Lys 115

<210> 8

<211> 354

<212> DNA

<213> Mus musculus <400> 8 atgctgtctt caggcaccat ctgcagtttg ctgctactca gcatgctctg gatggacatg 60 gccatggcag gctccagctt cctgagccca gagcaccaga aagcccagca gagaaaggaa 120 tccaagaagc caccagctaa actgcagcca cgagctctgg aaggctggct ccacccagag 180 gacagaggac aagcagaaga gacagaggag gagctggaga tcaggttcaa tgctcccttc 240 gatgttggca tcaagctgtc aggagctcag tatcagcagc atggccgggc cctggggaag 300 tttcttcagg atatcctctg ggaagaggtc aaagaggcgc cagctgacaa gtaa 354

<210> 9

<211> 23

<212> PRT

<213> Bubalus bubalis <400> 9 Leu Thr Gln Gly His Gln Leu Ser Gln Ala Gly Ser Leu Lys Ile Gly 1 5 10 15 Ile Asn Phe Pro Ala Asn Phe 20

<210> 10

<211> 23

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus <400> 10 Leu Ala Gln Gly His Gln Gln Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Lys Ile Gly 1 5 10 15

Val Asp Phe Pro Ala Asn Phe 20

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> Ailuropoda melanoleuca <400> 11 Leu Ala Gln Gly His Glu Gln Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Lys Ile Gly 1 5 10 15 Val Asp Phe Pro Ala Asn Phe <210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> Felis catus <400> 12 Leu Ala Gln Gly His Gln His Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Lys Ile Gly 1 5 10 15 Val Asp Phe Pro Ala Asn Phe