Uso diagnóstico de formas moleculares individuales de un biomarcador.

Un procedimiento de diagnóstico, monitorización o valoración de la gravedad de una lesión,

enfermedad o trastorno renal mediante la medida de la concentración de monómero de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo (NGAL) libre, mediante un procedimiento que es específico o selectivo de la forma monomérica libre, en una muestra de fluido corporal del individuo humano y comparación de dicha concentración con el intervalo de concentraciones de dicha forma molecular individual que ocurre en individuos que se sabe no están afectados por dicho trastorno o lesión renal, con lo que una desviación de la concentración de dicho intervalo determina la presencia de trastorno o lesión renal.

Uso diagnïstico de formas moleculares individuales de un biomarcador

Campo de la invenciïn La presente invenciïn se refiere al diagnïstico y monitorizaciïn de afecciones patolïgicas caracterizadas por una alteraciïn de los niveles y formas moleculares de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrïfilo (NGAL) , en particular a un proceso pernicioso o patolïgico reciente o continuo en un mamïfero que haya afectado o afecte a los riïones y haya conducido o pueda conducir a lesiïn renal o insuficiencia renal aguda (ARF) . Como tal, es relevante para medicina interna y en particular para la medicina de cuidados crïticos o intensivos, incluyendo traumatologïa, y para cirugïa, oncologïa e imagenologïa de diagnïstico, en que se llevan a cabo procedimientos que pueden daïar los riïones. Es tambiïn relevante para medicina y cirugïa veterinaria y para el estudio de la fisiopatologïa renal y las influencias nocivas o terapïuticas sobre el riïïn de animales de laboratorio. El ïmbito de protecciïn se define por las reivindicaciones.

Antecedentes de la invenciïn La presente invenciïn se refiere al uso diagnïstico de un nuevo biomarcador proteico de patologïa renal, que aparece tanto en sangre como en orina, para detectar, monitorizar y valorar la gravedad en un ser humano o mamïfero de un trastorno o lesiïn no solo renal, sino tambiïn de un trastorno o lesiïn de otros ïrganos, tejidos o tipos celulares que liberen esta proteïna. El biomarcador proteico es lipocalina asociada a gelatinasa de neutrïfilo (NGAL) , tambiïn conocida como lipocalina de neutrïfilo (NL; HNL en el caso de la lipocalina de neutrïfilo humana) , Iipocalina 2 (LCN2) o siderocalina en diversos animales incluyendo seres humanos, proteïna relacionada con microglobulina α2 de 25 kDa (NRL) en la rata o 24P3, proteïna inducible secretada de 24 kDa (SIP24) o uterocalina en el ratïn. La NGAL humana es una glucoproteïna que se aislï por primera vez en los grïnulos de leucocitos polimorfonucleares neutrïfilos, designados de aquï en adelante como neutrïfilos (Allen et al., 1989; Venge et al., 1990, Triebel et al., 1992; Kjeldsen et al., 1993) . La proteïna madura consiste en una sola cadena proteica de 178 residuos aminoacïdicos y su masa molecular se estima segïn los casos como de 24 o 25 kDa en su estado glucosilado. La proteïna contiene un puente disulfuro intracatenario y la forma humana contiene un residuo de cisteinilo adicional que se cree que participa en la formaciïn de complejos consigo misma o con gelatinasa de neutrïfilo. Este residuo de cisteinilo adicional no estï presente en la NGAL de las especies no humanas para las que estïn disponibles secuencias de ADNc hasta la fecha (chimpancï, mono Rhesus, perro, cerdo, caballo, rata y ratïn) . La NGAL aislada de neutrïfilos contiene regularmente una proporciïn sustancial de homodïmeros y ocasionalmente material de masa molecular mayor que se ha propuesto que es un homotrïmero. Ademïs, se han detectado trazas de homooligïmeros superiores de NGAL de masa molecular variable desde aproximadamente 150 kDa a mïs de 200 kDa. El hecho de que la NGAL aislada o secretada de neutrïfilos humanos in vitro contenga una alta proporciïn de homodïmeros ha conducido a que su masa molecular sea reseïada como de 40 o 45 kDa (Venge et al., 1990; Xu et al., 1994) .

Una proporciïn pequeïa y variable de la NGAL total aislada o secretada de neutrïfilos humanos in vitro estï asociada a gelatinasa de neutrïfilo humana de 92 kDa, tambiïn llamada gelatinasa B, colagenasa de tipo IV o metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) , como monïmero de NGAL que forma un complejo de 115 kDa aparentes (Monier et al., 2000; Van et al., 2001) o como dïmero de NGAL que forma un complejo de 125 kDa aparentes (Yan et al., 2001) . Estos complejos se han identificado tambiïn en la orina de pacientes con una variedad de cïnceres, incluyendo cïnceres de prïstata, vejiga, riïïn y mama.

Los homodïmeros, homotrïmeros, homooligïmeros superiores de NGAL y complejos de NGAL/MMP-9 pueden disociarse en sus monïmeros constituyentes mediante reducciïn, sugiriendo que los complejos estïn, al menos en parte, ligados covalentemente por puentes disulfuro. Sin embargo, la presencia en NGAL humana de un solo residuo de cisteinilo que no participa en el puente disulfuro intracatenario no puede explicar la formaciïn de trïmeros u oligïmeros superiores ligados por disulfuro, tanto si estos consisten en NGAL sola o en NGAL en complejo con MMP-9. Los mecanismos mediante los cuales estos homotrïmeros, oligïmeros superiores o complejos entre MMP-9 y homodïmero de NGAL propuestos se mantienen juntos tiene aïn que esclarecerse. Ha sido posible generar complejos de NGAL/MMP-9 in vitro mediante coincubaciïn de monïmero de NGAL humana recombinante con MMP-9 humana recombinante en presencia de tampïn que contiene iones de calcio y cinc (Yan et al., 2001) . Se reseïa que estos complejos tienen una masa molecular de 115 kDa y que tienen una existencia transitoria, mientras que la forma mïs comïn de complejo observada en la orina de pacientes con cïncer es la forma de 125 kDa.

Allen et al. (1989) observaron tambiïn que la masa molecular aparente de NGAL de neutrïfilos humanos aumentaba de 24 kDa a 50-70 kDa en presencia de iones de calcio, sugiriendo la formaciïn de dïmetros y trïmeros que, en opiniïn de los presentes inventores, podrïan estar ligados no covalentemente, al menos inicialmente.

Resulta por tanto evidente que la NGAL humana aparece en neutrïfilos en mïltiples formas moleculares, incluyendo monïmeros, homodïmeros (como componente principal) , homotrïmeros, homooligïmeros superiores, monïmero complejado con MMP-9 y homodïmero complejado con MMP-9. Ademïs, se han observado complejos de NGAL/MMP-9 de masa molecular aparente aïn mayor, del orden de 200 kDa. Estos pueden contener homodïmeros de MMP-9 y un nïmero indeterminado de molïculas de NGAL. Las subunidades individuales de estas formas moleculares se mantienen juntas al menos en parte por puentes disulfuro intercatenarios, aunque los residuos de cisteinilo que participan en estos en los diferentes complejos no se han identificado con certeza. Es tambiïn posible que fuerzas no covalentes participen en la formaciïn de complejo.

Estï disponible menos informaciïn sobre las mïltiples formas moleculares de NGAL en mamïferos no humanos, tales como rata y ratïn. Sin embargo, Bu et al. (2006) han mostrado que NGAL y MMP-9 se cosintetizan por cïlulas de mïsculo liso vascular de rata en respuesta a daïo angioplïstico o estimulaciïn con interleucina 1β. Se ha mostrado por transferencia Western que la NGAL de rata aparecïa en formas monomïrica, dimïrica y trimïrica, asï como en una forma de 150 kDa. La MMP-9 aparecïa en formas monomïrica y dimïrica. Aunque no pudieron demostrarse complejos de NGAL y MMP-9 de rata en cïlulas de mïsculo liso de ïntima de rata lisadas, se demostraron complejos de NGAL/MMP-9 de aproximadamente 115 y 125 kDa en medio de cultivo acondicionado con estas cïlulas, demostrado la formaciïn extracelular, pero no intracelular, de complejos de NGAL/MMP-9. La cadena proteica de NGAL de rata contiene solo dos residuos de cisteinilo, que se supone que forman un puente disulfuro intracatenario. Sin embargo, la no disponibilidad de un residuo de cisteinilo adicional en la cadena proteica no parece interferir con la formaciïn de mïltiples formas moleculares de NGAL en la rata, que se comportan en transferencia Western en estado no reducido y reducido como si dependieran de la presencia de enlaces disulfuro intercatenarios. Es desconocido cïmo se ligan las subunidades de las mïltiples formas moleculares observadas en la rata. Es una posibilidad que aparezca intercambio de disulfuro para romper el puente disulfuro intracatenario de modo que puedan formarse ligamentos disulfuro intercatenarios.

Zhao et al. (2006) han demostrado tambiïn la presencia de complejo de NGAL/MMP-9 en el plasma de ratones tanto de tipo silvestre como con desactivaciïn gïnica de RECS-1 que tienden a dilataciïn aïrtica. Como la NGAL de rata, la cadena proteica de NGAL de ratïn contiene solo dos residuos de cisteinilo.

Por tanto, a pesar de la ausencia de un tercer residuo de cisteinilo en las cadenas proteicas de NGAL de los mamïferos no humanos analizados hasta ahora, la evidencia de rata y ratïn sugiere que la NGAL de mamïferos no humanos aparece en mïltiples formas moleculares que son comparables con las observadas en el hombre.

Como biomarcador de diagnïstico, la NGAL humana se dio a conocer inicialmente (patente de EE.UU. 6.136.526; solicitud PCT W095/29404) , con su denominaciïn HNL, como marcador especïfico de la activaciïn de neutrïfilos, al liberarse en la sangre cuando microorganismos invasores,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnïstico, monitorizaciïn o valoraciïn de la gravedad de una lesiïn, enfermedad o trastorno renal mediante la medida de la concentraciïn de monïmero de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrïfilo (NGAL) libre, mediante un procedimiento que es especïfico o selectivo de la forma monomïrica libre, en una muestra de fluido corporal del individuo humano y comparaciïn de dicha concentraciïn con el intervalo de concentraciones de dicha forma molecular individual que ocurre en individuos que se sabe no estïn afectados por dicho trastorno o lesiïn renal, con lo que una desviaciïn de la concentraciïn de dicho intervalo determina la presencia de trastorno o lesiïn renal.

2. Un procedimiento segïn la reivindicaciïn 1 de diagnïstico, monitorizaciïn o valoraciïn de la gravedad de una lesiïn, enfermedad o trastorno renal que ha conducido a insuficiencia renal aguda, o que significa un riesgo inmediato de desarrollo de insuficiencia renal aguda en un individuo humano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de i) determinaciïn de la concentraciïn de monïmero de NGAL libre en una muestra de fluido corporal del individuo humano y

ii) comparaciïn de dicho valor de concentraciïn con un valor de corte determinado a partir del intervalo de concentraciones de monïmero de NGAL libre en otros individuos humanos que no muestran evidencias de lesiïn, enfermedad o trastorno renal, de modo que un valor mayor que el valor de corte indica la presencia de dicha lesiïn, enfermedad o trastorno renal.

3. Un procedimiento segïn la reivindicaciïn 1 de diagnïstico, monitorizaciïn o determinaciïn del riesgo de desarrollar insuficiencia renal aguda en un individuo humano, en el que dicho procedimiento discrimina entre un individuo que no tiene insuficiencia renal aguda y no estï en riesgo inmediato de desarrollar insuficiencia renal aguda y un individuo que puede tener insuficiencia renal aguda o estar en riesgo de desarrollar insuficiencia renal aguda, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de i) determinaciïn de la concentraciïn de monïmero de NGAL libre en una muestra de fluido corporal del 25 individuo humano y

ii) comparaciïn de dicho valor de concentraciïn con un valor de corte predeterminado elegido de tal modo que una concentraciïn de monïmero de NGAL libre por debajo del valor de corte clasifique al individuo humano por no tener y no estar en riesgo inmediato de desarrollar insuficiencia renal aguda.

4. El procedimiento de las reivindicaciones 2 y 3, que comprende la etapa adicional de repetir las etapas i) y ii)

de dichas reivindicaciones una o mïs veces o que comprende la etapa adicional de repetir las etapas i) y ii) de la reivindicaciïn 2 o 3 dentro de 24 horas, por ejemplo, dentro de 12 horas, tal como dentro de 6 horas, por ejemplo dentro de 3 horas, tal como dentro de 1 hora, por ejemplo dentro de 30 minutos o dentro de 15 minutos, o que comprende la etapa adicional de repetir las etapas i) y ii) de la reivindicaciïn 2 o 3 despuïs de iniciar o completar un tratamiento de insuficiencia renal aguda.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la lesiïn renal o el riesgo de desarrollar insuficiencia renal aguda es debida a isquemia, o es debida a una complicaciïn de una enfermedad inflamatoria, infecciosa o neoplïsica, o es debida a una dolencia crïtica de cualquier causa que requiera cuidados intensivos, o es debida a una intervenciïn quirïrgica, o es debida a la administraciïn de un agente nefrotïxico.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la lesiïn es debida a causas fïsicas o 40 quïmicas externas o es debida a exposiciïn a radiaciïn.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el fluido corporal es plasma sanguïneo o suero sanguïneo u orina.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la NGAL monomïrica libre se

mide mediante una molïcula que se une especïficamente a monïmero de NGAL libre y no a formas complejadas de 45 NGAL en individuos humanos.

9. Un kit o dispositivo para efectuar el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicho kit o dispositivo un soporte sïlido y molïculas de uniïn que se unen especïficamente a monïmero de NGAL humano y no a formas complejadas de NGAL humana.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4